抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

应用生态学报2010年4月第21卷第4期

ChineseJournalofAppliedEcology，Apr.2010，21（4）：1063－1069

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散

*

及抗性研究方法

王丽梅

1

罗义

1，2

毛大庆

3

3

周启星

1

（1南开大学环境科学与工程学院教育部环境污染控制过程与基准重点实验室，天津300071；污染防治重点实验室，天津300071；

沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳110016）

2

天津市城市生态环境修复与

摘要抗生素在医药、畜牧和水产养殖业的大量使用造成了环境中抗性耐药菌和抗性基因

日益增加，抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物引起人们的广泛关注.本文综述了近年来国内外有关抗生素抗性基因的研究进展，其在水、土壤、空气等环境介质中和动，植物体内的传播扩散，以及开展环境中抗生素抗性基因研究的必要性，重点介绍了有关抗生素抗性（包括抗性细菌和抗性基因）的研究方法，指出抗性基因研究中存在的问题，并对未来的相关研究进行了展望.关键词

抗生素抗生素抗性抗性耐药菌

文章编号1001－9332（2010）04－1063－07

抗生素抗性基因中图分类号X171

文献标识码

A

Transportofantibioticresistancegenesinenvironmentanddetectionmethodsofantibiotic

2

resistance.WANGLi-mei1，LUOYi1，，MAODa-qing3，ZHOUQi-xing1（1MinistryofEducation

KeyLaboratoryofPollutionProcessesandEnvironmentalCriteria，CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering，NankaiUniversity，Tianjin300071，China；2TianjinKeyLaboratoryofRemedia-tionandPollutionControlforUrbanEcologicalEnvironment，Tianjin300071，China；3CollegeofLifeScienceandBiopharmaceutical，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，Chi-na）.-Chin.J.Appl.Ecol.，2010，21（4）：1063－1069.Abstract：Thelargescaleuseofantibioticsinmedicine，animalhusbandry，andaquaculturein-ducestheincreasingemergenceofantibioticresistancebacteriaandantibioticresistancegenes（ARGs），and，asakindofnewenvironmentalcontaminants，theARGsareattractedmuchatten-tionbythepublic.ThispapersummarizedtheresearchprogressofARGsinrecentyears，anddis-cussedthetransportofARGsinwater，soil，andair，andinplantsandanimals.ThenecessityofthestudyonARGsinenvironmentandtheexistingproblemsinpresentstudieswerepointedout，andtheresearchmethodsofantibioticresistance（includingantibioticresistancebacteriaandARGs）wereintroduced.Somerelatedresearchdirectionswereproposed.

Keywords：antibiotics；antibioticresistance；antibioticresistancebacteria；antibioticresistancegene.

长期以来，抗生素在保障人类健康和促进畜牧业发展方面发挥了重要作用，由于能预防疾病和促进生长，目前经常作为亚治疗剂量添加在动物饲料［1］

中.但近年来，抗生素的过度使用开始引起人们的广泛关注，主要集中于日益出现的抗生素耐药菌和抗性基因.世界卫生组织（WHO）已将抗生素抗性

*国家自然科学基金项目（20777041，30870363）和天津市自然科学基金项目（08JCYBJC02700）资助.

mail：luoy@通讯作者.E-2009-10-09收稿，2010-01-19接受.

基因（ARGs）作为21世纪威胁人类健康的最重大挑

战之一，并宣布将在全球范围内对控制ARGs进行

［2］

战略部署.自Pruden等将抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物提出之后，有关其在环境中传播和污染等的报道日益增多.

本文综述了近些年来国内外对环境介质中抗生素抗性基因的研究现状，指出研究的必要性；重点介绍了有关抗生素抗性（包括抗性细菌和抗性基因）的研究方法，指出抗性基因研究中存在的问题，最后对未来的研究方向进行了展望.

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

11.1

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散

抗生素抗性基因在水环境中的传播扩散目前，抗生素主要用于人类医疗业和动物畜牧

污水处理系统是抗性基因进入水环境的重要途

径.抗生素抗性基因随医疗废水、制药业废水和动物养殖场污水等进入污水处理系统后，由于现有的水处理技术对许多抗生素类物质没有明显的去除效［11－13］

，果污水出水中仍有相当浓度的抗性基因存在

［14－15］

养殖业，随着后者向集约化发展，对兽用抗生素的使

用和消耗已经超过人用.据报道，美国2000年共消70%用于兽药，30%用于人耗16200t抗生素，其中，

［3］

类医药.抗生素在畜牧业和养殖业中的长期滥用，已在养殖动物肠道内诱导出携带抗性基因的菌株，这些抗性菌株是环境中抗生素抗性基因的重要来源.

许多研究表明，养殖场化粪池系统内的抗性菌及抗生素抗性基因能够通过渗透、泄漏等途径进入地下水和地表水等水环境

［4－5］

.大量研究均表明，污水处理厂的进水、出水

及底泥中均含有相当浓度的耐药抗性菌株或抗生素

抗性基因.而且生物处理和紫外消耗都无法有效去.由此可见，污水处

理系统是抗生素抗性基因的重要储存库.除高水平的四环素抗性基因

由于污水经污水处理厂处理后直接排入河流或用于农业灌溉，故河流中耐药菌和抗性基因报道日

［16－18］

.Pei等［17］采用定量PCR法对CacheLa益增多

Poudre河5个采样点（分别为无污染区、轻度农业活动污染区、城市污水排放区、农业活动严重污染

［15］

.Chee-Sanford等［4］在

养猪场附近的化粪池内监测到8种编码核糖体保护

tet（Q）、tet（W）、蛋白的四环素抗性基因，即tet（O）、tet（M）、tetB（P）、tet（S）、tet（T）和otrA.这些抗性基因可渗滤到地下水中，在化粪池下游250m处的地

［5］

下水中仍能检测到.Koike等在此研究的基础上，于2000—2003年连续对化粪池及地下水中的四环

结果显示，所有采样点均含有素抗性基因进行监测，

RPP基因tet（M）、tet（O）、tet（Q）、tet（W）和外排泵tet（H）、tet（Z）.Peak等［6］对美国中西基因tet（C）、

部8个化粪池（分属于5个养牛场）内的6种四环素抗性基因进行了连续6个月的在线监测，结果表明，抗生素抗性基因的丰富度与抗生素的使用量有关，大量使用与混合使用抗生素的抗性基因含量显著高于不使用抗生素，而大量四环素抗性基因会对水质产生影响.由此可见，化粪池是抗生素抗性基因向水环境转移的重要储存库.

水产养殖是抗生素抗性基因进入水环境最直接的途径.水产养殖区的鱼体内、水体和底泥中均监测到抗生素抗性基因，表明抗生素在水产养殖业的大量使用可能使水产养殖区成为抗生素抗性基因的暂

［7－8］

.抗生素不仅可直接投加到水体中，时存储库还可通过作为饲料的动物粪便（残留抗生素及抗性基

［9］

因）间接进入水体.从35条人工养殖的淡水鱼罗非鱼（Telapiamossambica）溃疡皮肤细胞中分离出21个嗜水气单胞菌，测定其对10种抗生素的敏感性，结果表明，所有细菌均对氨比西林具有抗性，大部分对链霉素、四环素及红霉素具有抗性

［10］

区、城市和农业混合污染区）的抗生素抗性表型及

抗性基因进行了研究，结果表明，受人类干扰区域的四环素类及磺胺类抗性基因水平明显高于未受干扰

［18］

区域.胡建英等对北京温榆河流域的耐药大肠杆表明大肠杆菌对9菌表现型和基因型进行了研究，

种抗生素中的一种或多种产生抗性，其中对磺胺类、四环素及氨比西林的抗性最为明显；经抗性基因检

tet（M）基因首次出现在河流中，测发现，表明抗性基因可以通过水平基因转移在微生物间传播.目前，海滩娱乐水域的抗生素抗性问题越来越受到人们的关注、研究表明，海滩娱乐水域可能成为携带抗生素抗性基因的微生物传播扩散的又一媒［19－21］

.介1.2

抗生素抗性基因在土壤环境中的传播扩散目前有关抗生素抗性基因在土壤环境中迁移转

化规律的研究还不系统，但已有研究表明，它不仅能在动物肠道的菌株间传播，还可以通过粪便施肥传

［22］

播给土壤土著细菌.Jensen等研究了动物粪肥使用前后土壤中假单胞菌（Pseudomonasspp.，革兰氏阴性菌）和蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus，革兰氏阳性菌）抗性水平的变化，结果表明，动物粪肥对土壤中的抗性细菌具有选择压力，施肥是耐药微生物及抗性基因进入土壤环境的主要途径.有关动物粪便施肥诱导土壤环境产生抗生素抗性基因的研究多见

［23－24］

.相比之下，报道关于动物养殖业的抗生素残留对土壤环境中抗性基因的选择性压力有较少研

［23］

究.Sengelv等对施用了猪粪水的农田的可培养土壤细菌进行了为期8个月的针对四环素、大环内

结果显示，农田中抗酯类和链霉素的抗性筛选研究，

.这些

抗性基因很可能通过食物链进行垂直传递，最终进

入动物或人的肠道中，也可能通过基因水平转移扩散到其他微生物体内.

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

性细菌数量明显增加，耐四环素细菌增加尤为显著.Schimitt等［25］采用微宇宙及现场调查的方法研究了猪粪对土壤中四环素及磺胺类抗性基因多样性的影响，结果显示，施肥后土壤中抗性基因数量明显增加，但直接加入氧四环素对抗性基因多样性的影响很小，这表明动物施肥是影响抗性基因丰度的重要因素.在养猪场附近的典型土壤土著菌中发现四环

表明其可通过肠道菌株向土壤素抗性基因tet（M），

［5］

微生物传播.

1.3抗生素抗性基因在空气中的传播扩散

史.之后又有报道称，在最偏远、最隔离的玻利维亚群落也发现了抗药性菌株，这表明即使在无抗生素直接暴露的情况下，抗性细菌也可经其他途径进行

［32］

鸟类可能是其重要的传播载体.在北极的传播，

鸟类体内分离出了携带抗菌素抗性物质决定子的大［33］

再次表明在无抗性压力条件下仍可诱导肠杆菌，

出抗性基因.以上研究表明抗生素抗性具有在世界范围内传播扩散的潜在风险.2

开展环境中抗生素抗性基因研究的必要性

目前在大气环境中发现抗生素抗性，相关研究主要集中在养殖场附近的空气环境中分离到耐药细

［26］

菌及抗性基因的报道.Gibbs等揭示了大规模养猪场内及其下风处的空气中多种细菌（包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、粪大肠菌群及总大肠菌群）对

［27］

多种抗生素产生抗性.Chapin等发现，集中式养猪场内的空气中大约98%的革兰氏阳性菌对至少

目前，全球医疗业的抗生素滥用情况十分严重.1990年欧盟各国已开始对环境中抗生素进行风险评估研究，并对人用和兽用抗生素做出了严格的限定和制定了相应的法规，但世界范围内，仍有越来越多的抗生素因被授权用于医疗业而投入生产和使

德国目前已有5万种抗生素药品被注册用用.例如，

于人类医疗，其中2700种被大量使用，而这其中又包含900种不同的药物活性物质.英国大约已授权3000种药物活性物质的生产［34］.我国由于医药管理方面的原因，乡村和城市中对低端和高档抗生素的滥用同时存在，使得抗生素滥用情况更为复杂、严［35］重.

随着畜牧养殖集约化发展，其抗生素滥用情况更为严重，直接后果很可能是诱导动物体产生抗性耐药菌，并在环境中传播扩散.已有研究表明，畜牧活动可导致动物体内的抗性菌株扩散到环境中，并通过质粒交换等水平基因转移方式将抗性基因传播

［4，36］

，这些微生物又可能通过多种方给环境微生物

式传播进入人体，最终对人类健康和生态安全相成巨大威胁.人工养殖的鱼、虾、贝体内的抗性菌株和抗性基因经排泄后，可对养殖区域、周围农业环境和人居环境造成基因污染隐患；对公共健康和食品、饮用水安全构成威胁.因此，针对以上现状开展相关研究，揭示抗生素抗性基因在渔业和畜牧环境中的扩散和传播规律，对于评价抗生素抗性基因的生态风险十分必要，并且任务紧迫，这还将在很大程度上促进畜牧和养殖业的可持续健康发展.对新型环境污染物抗性基因的研究将引起公众和政府权利机构对基因污染的重视，进而制定相应政策并加强监管力度，最终有助于评估、减轻或控制基因污染对生态环境和人体健康造成的危害，并推动公共卫生事业健康发展.3

抗生素抗性的研究方法

由于微生物是抗生素抗性基因最重要的宿主，

两种养猪场常用抗生素（包括大环内酯类、林克胺

［28］

类、四环素）产生抗性.Sapkota等在此研究基础采用DNA分子杂交和PCR法，研究发现，所有上，

受试菌（包括肠球菌链球菌）均含有多重对大环内脂类、林可胺类、红霉素及四环素（含称MLS）的抗

50%的肠球菌和44%的链状球菌含有多重性基因，

四环素抗性基因.以上研究表明，吸入养猪场内的空气可能是耐多重药物细菌性病原体向人体传播的一

个暴露途径，养猪场空气中的革兰氏阳性菌可能是抗性基因的储存库.

1.4动植物体内抗生素抗性基因的研究

食物链是抗生素抗性基因进入人体最直接的途径，因此，在食品领域开展相关研究显得非常必要.对从美国爱荷华州（Iowa）981个零售生肉样品（包括鸡肉、火鸡肉、猪肉、牛肉）中分离出的肠球菌进行药敏试验发现，生肉中存在多种抗生素，如奎奴-［29］［30］达福普丁和庆大霉素的耐药菌株.Johnston等从美国西南部收获的新鲜芹菜、香菜、菠菜等蔬菜中分离出了肠球菌属，并采用药敏试验鉴定其抗性类型，结果表明，新鲜果蔬中含有大量常用抗生素（如环丙沙星、四环素、呋喃妥英等）的耐药肠球菌.即使在远离抗生素暴露的环境也有检出抗生素

［31］

抗性的报道.Gilliver等在英国西北部尔半岛的啮齿类动物野鼠沙田鼠（Clethrionomysglareolus）和小林姬鼠（Apodemussylvaticus）的粪便中发现了阿莫西林-克拉维酸、头孢呋辛、甲氧苄氨嘧啶及四环素

但这些动物基本上没有抗生素暴露的耐药大肠菌，

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

因此，对抗生素抗性的研究应包括耐药微生物和其携带的抗性基因两部分，对前者的研究是此项研究的必备基础.

3.1基于细菌培养的研究方法

抗生素抗性的传统研究方法主要是基于微生物培养，通过抗性表型来评价其抗性；最为传统的方法

［37］

是基于最小抑制浓度药敏试验.药敏试验是根据

B琼脂法，把美国临床标准委员会CLSI推荐的K-

菌数的近似值.

3.2采用PCR法研究抗性基因

传统的通过细菌培养来判断抗性的方法在细菌抗药性研究中发挥了很大作用.但因对环境中许多pH、微生物的最适生长温度、氧和营养成分等不十

分清楚，故难以用平板培养.因此，以传统的微生物培养方法评价抗性，难免会低估了诸如污水处理厂和水生生态系统等复杂微生物群落中的抗性微生物总量.

当前，由于分子生物学手段的发展和分子示踪技术的不断完善，在方法学上为将其应用于抗生素抗性基因的研究提供了极大可能.聚合酶链式反应PCR（polymerasechainreaction）技术是一种选择性反应原理与细体外扩增DNA或RNA片段的方法，

胞内DNA复制相似，但其反应体系要简单的多.它可直接检测微生物或环境样本中的抗性基因，不需要对微生物进行分离培养.该方法快速、灵敏、准确，能将目的基因扩增放大几百万倍，目前已在抗生素抗性研究中得到了广泛应用.

PCR是目的基因的体外复制过程.PCR前对环境样品中目的基因进行提取纯化（即DNA提取）的方法主要有细胞抽提法和直接溶解法.前者是指先将微生物从环境介质中分离出来，再提取DNA，该方法不但费时，而且由于绝大部分细菌仍吸附在基

DNA的损失率也较大.Ogram等［40］提出了通质上，

过直接裂解细胞来释放DNA，即直接溶解法，它不需要分离细胞，可直接通过物理、化学或酶的作用来裂解细胞.该方法较方便省时，且大量微生物及吸附在有机矿物基质上的微生物细胞均可被裂解，因此不仅提取DNA得率高，而且能较真实地反映样品中

［41］

微生物的群落状态.Tsai等采用直接提取法获得的DNA得率是细胞提取法的50倍.直接溶解法在环境样本的DNA提取中得到了广泛应用并发挥了重要作用.

目前，使用试剂盒提取微生物DNA的应用最多，其原理是，在特定溶液环境下（高盐、低pH）使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，经洗涤去除杂质后，通过改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE缓冲液中.Knapp等［42］使用MoBioUltraCleanSoilDNAkit（一种DNA提取试剂盒）直接从水样过滤器上提取DNA，再通过PCR扩增检测氧四环素对

［15］

水样中四环素抗性基因的诱导作用.Auerbach等使用FastDNAkit（一种DNA提取试剂盒）提取污水

以此研究处理厂进水和出水中的四环素抗性基因，

待测菌株接种到琼脂平板上进行培养，再将浸有一

定浓度的抗生素滤纸片贴在纯菌落生长的平板上，待纸片周围出现无细菌生长区，即抑菌环时，测定抑菌环直径，据此评估细菌对抗生素的抗性.目前，评价细菌对抗生素的抗性强弱大都采用此方［14，21，38］

.法

但纸片药敏试验法具有耗资、耗时和耗人力的

［39］

缺点.Watkinson等发明了一种快速评估地表水中细菌抗性的方法，即用浸入了抗生素的修正选择性培养基快速评估大肠杆菌对抗生素的抗性.具体步骤是：在添加了荧光物质的新型MI培养基中，首

再接种待测大肠杆先按最小抑制浓度浸入抗生素，

由于后者体内的酶可分解培养基中的荧光菌样品，

物质并在紫外光下显示蓝色，故可通过计算蓝色菌株数目来判断抗性水平.此方法可在24h内完成测定.

通过微生物抗性表型研究抗性的方法需鉴定耐药微生物的种属类型，据此了解抗性宿主的特征.微生物种属的鉴定方法很多，如传统的生理生化鉴定法可对细菌的种属进行鉴定.随着微电子和分子生物技术的发展，微生物种属的鉴定方法和技术也得到了相应扩展，如Woese建立的16SrRNA/rDNA基因序列分析法和Biolog全自动和手动细菌鉴定系统等，与传统的生理生化鉴定法相比，不仅简单、省时、省事，而且准确性好、敏感性高.目前常用的抗性细菌鉴定方法是将16SrRNA细菌鉴定法和Biolog法结合，经PCR扩增后，通过16SrRNA基因测序判断细菌的属，再通过Biolog法确定细菌的种.判断微生物对抗生素的抗性水平主要依据抗性微生物占总微生物的百分比.常用的估算细菌总量的方法是最大可能数法（mostprobablenumber，MPN），它是应用概率理论来估算细菌浓度.具体步骤是：将待测样品做一系列稀释，直到将少量样品液接种到新鲜培养基时没有或极少出现生长繁殖，根据没有生长的最低稀释度和出现生长的最高稀释

“最大近似值”采用理论计算样品中单位体积细度，

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

人类活动对活性污泥中四环素抗性基因的影响.

由于普通PCR技术不能做到准确定量，故在此基础上结合荧光能量传递技术又发展了实时荧光定

PCR）技术，量PCR（RTQ-它是通过荧光标记探针巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测计算技

术结合起来，然后借助荧光信号检测PCR产物.荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度就

从而可以实现精确定量.与扩增产物量成正比，

RTQ-PCR技术的发展和完善，为研究环境中抗生素抗性基因提供了方法学上的可能.因此，在分子水平

PCR技术对环境中的ARGs-DNA/RNA上运用RTQ-进行定量分析，不仅结果更灵敏、准确，还能客观地

表征环境中的抗性基因.

PCR技术定量表征环境近年来关于应用RTQ-样品中抗性基因的研究日益增多，主要集中在对养殖场废水、城市污水、河流沉积物和养殖场周围土壤

中的四环素类、磺胺类、万古霉素等抗生素抗性基因的研究

［43－44］

分.DGGE技术的原理是在一般聚丙烯酰胺凝胶基

础上，加入变性剂甲酰胺梯度，一个特定的DNA片段有其特定的序列组成，其序列组成决定了其解链

MD）和解链行为（meltingbe-区域（meltingdomain，

havior），变性剂浓度梯度可使DNA片段在解链区域发生解链，因此序列不同的DNA会在胶中的不同位置发生部分解链，导致迁移速率大大下降，从而将长序列不同的DNA片段在胶中被区分开来.度相同、PCR-DGGE技术将PCR扩增后的目的基因通过变梯度凝胶电脉形成不同的单链DNA谱带，测定谱带的碱基序列，同基因文库中的16SrDNA序列比较，对抗性基因的来源微生物进行种属鉴定，从而更好地了解抗性基因的来源.4

抗生素抗性基因研究中存在的问题

传统的微生物培养法因忽略了环境中大量的不可培养微生物，难免会低估抗性基因的数量.现代PCR检测技术可对抗生素抗性基因进行直接检测，虽解决了微生物培养受条件限制的缺陷，但技术本

DNA聚合酶如模板、引物、身仍存在多种限制因素，

实时荧光定量PCR还受其他因素和温度等.此外，

影响，如：引物二聚体，它是非特异性退火和延伸的产物，不仅影响扩增效率，还因SYBRGreenI可与所有双链DNA结合，在反应体系中会出现特异性产物与引物二聚体竞争SYBRGreenI的现象，从而降低实时PCR敏感性.

鉴于PCR和实时荧光定量PCR技术等本身存在的问题，在进行抗性基因检测时，应根据需要对实验方案和基本参数进行优化.

PCR成功检测抗性基因采用传统PCR或RTQ-的关键仍然是模板和引物的设计与选择.具体为、模

板必须纯化，特别对于从环境介质中直接提取抗性基因的试验；引物设计要合理，不仅要求质量高而且

PCR试验中有时还需设计探针，要纯化，在RTQ-但PCR反应这会给引物设计增加难度.通常设计RTQ-的引物和探针时，除了满足一般引物设计要求外，还应注意以下几点：引物序列和探针序列应尽可能靠

近但不发生重叠；引物和探针间既不能发生互补，也不能形成稳定的发卡结构；引物的退火温度Tm值较探针要低10℃左右.

PCR对抗性基因进行定量时，此外，利用RTQ-定量方法的选择同样至关重要.其中，模板定量有绝对定量和相对定量两种表示方法.前者是指用已知

即将标准品稀释至不标准曲线来推算未知样本量，

.

作为PCR技术的补充，目前也采用了其他一些

如DNA微列阵技术（microar-方法检测抗性基因，

ray）和变梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术等.DNA微列阵技术的基本原理是基于其中，

Southern杂交或斑点杂交技术，用荧光或带有标记的mRNA、基因组DNA探针与固定在玻璃片或尼龙膜表面上的成千上万个DNA克隆片段和人工合成的寡核苷酸片段进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因，进行DNA序列分析等的一种新技术.近年来，将DNA微列阵技术与PCR技术结合来检测抗生素抗性基因的研究也日益兴

［45］

起.Call等采用DNA微列阵技术监测了单个细菌体内的多种四环素抗性基因.Patterson等

［46］

采用

膜列阵技术对欧洲多个国家土壤及动物粪便样品中

的四环素和红霉素抗性基因进行了检测，发现膜列阵技术是筛选环境样品DNA从而鉴别四环素、红霉素等抗性基因的有力工具.

PCR产物可通过经溴化乙锭（EB）染色的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行定量检测，前者最为常用.现代生物技术的发展使检测技术逐步完善，变梯度凝胶电泳（DGGE）技术等广泛用于微生物群落结构分析，在抗生素抗性基因研究方面也有所开展.双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷，因此不同长度的DNA片段在胶中能被区分开，而同样长度

不能被区的DNA片段因其在胶中的迁移行为一样，

抗生素抗性基因在环境中的传播扩散及抗性研究方法

同浓度后作为模板进行PCR，通过标准曲线确定未

－1－1

知样本量，单位ARGscopies·mlormg（可以解释为单位体积环境样品中所含的抗性基因拷贝数）.绝对定量在环境介质中表征ARGs数量时发挥了重要作用，特别是在不同环境介质中研究ARGs时起到了不可替代的作用.后者是在绝对定量的基础上引入了管家基因16SrRNA（一种原核生物rRNA），将目的基因和16SrRNA同时进行PCR，由于管家基因16SrRNA相对恒定，可用来指示环境中微生物的种类数，因而相对定量的单位ARGscopies/16SrRNAcopies表述为样本中目的基因的绝对数量相对于管家基因16SrRNA绝对数量的变化，代表的是每个微生物细胞中所含的抗性基因的数量，可定量表示抗生素对抗性基因的诱导率，应结合研究需要将绝对定量和相对定量两种表示方法互相结合、补充.综上所述，在研究抗生素抗性基因时应根据试验目的选择合适的方法.微生物培养法虽存在缺陷，但耐药微生物作为抗性基因最重要的宿主，其环境行为很可能直接对抗性基因产生影响，因此对环境pH中抗性基因的研究不能忽略环境因素（如温度、和氧等）对特定微生物类群的影响.5

研究展望

［3］

［4］

［5］

［6］

［7］

［8］

［9］

［10］

目前，尽管大量文献报道了关于抗生素抗性基

但研究结果只局限于在水环境、土壤环境因的研究，

或食物中发现或检测到抗性基因，有关其在环境中

的来源、分布、传播和扩散机制及控制对策等仍不清对未来抗生素抗性基因的研究提出了以下楚.因此，几点建议：

1）建议有关部门和公众重视抗生素抗性基因这类新型污染物，在畜牧和水产养殖业等加大对其污染的研究，并明确其从污染源向水环境、土壤环境和大气环境等扩散和传播的分子机制.

2）弄清抗生素抗性基因是否可以通过食物链和饮用水等途径进入人体内以及进入人体后会通过什么机制产生危害；创建检测环境中抗性基因的技术体系；减轻基因污染对生态环境和人体健康的影响.

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作者简介1986年生，王丽梅，女，硕士研究生.主要从事污

mail：wanglimei08@染物迁移转化研究.E-责任编辑

肖

红

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