流式细胞术彩色图谱

第一章流式细胞仪的结构和原理

第1节流式细胞术发展史

纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15 种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。

流式细胞术的发展简史：

1930年 Caspersson 和 Thorell 开始致力于细胞的计数；

1934年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞数量；

1936年 Caspersson等引入显微光度术；

1940年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；

1947年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；

1949年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；

1950年 Caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：1953年 Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；

1953年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；

1954年 Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器；

1959年B型Coulter计数器问世；

1965年 Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对细胞分类；

1967年 Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法；

1969年Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM(即现在的National Flow Cytometry Resource Labs),发明第一台荧光检测细胞计；

1972年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号；

1975年Kochler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。

从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入21 世纪，流式细胞术作为一门生

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2物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。

第2节 流式细胞仪结构和工作原理

流式细胞仪（Flow cytometry ,FCM ）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各项相关技术的迅速发展，FCM 技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。

流式细胞仪分为三大类：

一类为台式机，临床型，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，见图1-2-1。

图1-2-1 临床型台式流式细胞仪

（左：BD FACSCalibur —2L ，4F ； 右：Coulter EPICS XL/XL-MCL —1L ，4F

中：Partec ，cyFlow —1L,3F ）

第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图1-2-2、1-2-3。

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图1-2-2 大型科研型流式细胞仪

（左：BD ，FACSDiVa —14F ，four-sorting ； 右：Coulter EPICS ALTRA—4L,8F ；

中：Partec ，CyFlow SPACE ―2L ，6F ）

第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。

图1-2-3 目前最新型流式细胞仪

（左上：partec ，CyFlow ML ―FSC,2xSSC,FL1~FL13；右上：Coulter ，Cytomics TM FC 500

左下：FACSAria ，FSC ，SSC ，FL1-FL13； 右下：BD ，BD LSR ，4L ，10F ）

4（一） 流式细胞仪的结构

FCM 的结构一般分为5部分：

③ 光学系统；④ 1-2-4。

图1-2-4 流式细胞仪的光路结构

1、流动室与液流驱动系统

流动室（Flow Chamber 或 Flow Cell ）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430×180μm 的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。

流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息，见图1-2-5。

图1-2-5 FCM 的流动室和液流系统

细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli 方程，即P=(1/2)PV （勿略高度的变化），可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。

从图1-2-5可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样

5本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流经光照射区的细胞数就增加。

这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图1-2-5），中心处能量最高，因此当样本速率选择高速（Hi ）时，处在样品流不同位置的细胞或颗粒，受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测量误差。当

在测量分辨率要求高时（如

DNA 分析）应选取用低速（Low ）。

2、激光光源与光束成形系统

目前台式机FCM ，大多采用氩离子气体激光器。激光（light amplification by stimulated emission of radiation , Laser ）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。

激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm 即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机FCM 的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作任何调节，所以使用者操作十分方便。

3、光学系统

FCM 的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器（见图1-2-6）。

在FCM 的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter ），主要分成3类：长通滤片（long-pass filter, LP ）、短通滤片（short-pass filtr, SP ）及带通滤片（band-pass filter, BP ）。

（1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500μm 以上的光通过，而500μm 以下的光吸收或返回。

（2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。如SP500滤片，将允许500μm 以下的光通过，而500μm 以上的光吸收或返回。

（3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500表示其允许通过波长范围为475μm -525μm。

图1-2-6 流式细胞仪的光学系统

4、信号检测与分析系统

当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。

（1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（side scatter,SSC）

，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数（见图1-2-7）。

①前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。

②侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90o方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。

以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

图1-2-7 流式细胞仪的散射光图

（2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量(图1-2-8)。

图1-2-8 激光的作用原理

前向角散射

激光

激光

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7荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的波长。目前台式机FCM

① 荧光信号的线性测量与对数测量

荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT ），PMT 将光信号转换成电信号。有些厂家不采用PMT ，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降低，最高速度不可能超过3 300个细胞/秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此高档仪器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器，如果原来输出是1，当输入增大到原来的十倍时，输出为2；当输入增大到原来的100倍时，输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。

② 荧光信号的面积和宽度

所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA 含量测量时，采用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA 的含量，当形状差异较大，而DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。

荧光信号的宽度（如FL2-W ）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G 1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A ）与G 2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G 2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate ）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W ）要比单个G 2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

③

光谱重叠的校正

当细胞携带两种荧光素（如PE 和FITC ）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种荧光间相互干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保光源程序间互不干扰。因此可以避免有第1激光（488nm ）激发出的FL1、FL2、FL3和第2 激光（635nm ）激发出的FL4间的补偿。当然，FL1、FL2和FL3是来自同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。

5、FCM 测量数据的存贮、显示和分析

目前FCM 数据的存贮的方式均采用列表排队（list mode ）方式。因为目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000个细胞，所占容量为4×10000个（字或双字）。同时当只检测1个参数时（如DNA ），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4的空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直

8方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

（1）单参数直方图：

细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogram ）来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图1-2-9。

图1-2-9 DNA 含量直方图和抗原表达直方图

左图较低道数处细胞峰为G 1期细胞，道数为G 1期细胞两倍的是G 2M 期细胞，二者之间是S 期细胞。右图100-101（M1）为阴性细胞，而101以上（M2）为阳性细胞。

（2）双参数数据的显示

双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图（dot plot ）,等高线图（contour plot ）,二维密度图（density plot ）。在二维图中，X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为FSC 和SSC 组成的点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据。右下图是通过设‘门’分析（gating analysis ）得到的FL1和FL2散点图，设‘门’可以是单参数设‘门’，也可以是双参数设‘门’，通过设”门”可以调出其它参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图1-2-10(左)就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图，设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体，再调出免疫荧光的散点图图1-2-10（右）。

散射光图 双色标记荧光图

图1-2-10 双参数免疫荧光点阵图

（二）流式细胞仪的主要技术指标

1、荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，一般现在FCM均可达到600个荧光分子。

2、仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV（coeffeient of variation）值来表示：

CV=d/m×100%(d-是分布的标准误差，m-是分布的平均值)

如果一群含量完全相等样本，用FCM来测量，理想的情况下，CV=0，用FCM测量曲线表示为图1-2-11（左），但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的误差，样本在进入流动室时照射光的微弱变化，再加上仪器本身的误差等，实际得到的曲线为图1-2-11（右）。

图1-2-11 仪器分辨率的显示—CV值

CV值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小。一般的FCM在最佳状态时CV 值<2%。CD值的计算，除采用以上计算公式外，还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽，m代表峰顶部的荧光道数；它们与CV值的的关系式如下：

CV=半高峰宽/m×0.4236×100%

上述公式是建立在正态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形，故采用半高峰宽所计算得到的CV值要明显小于前公式得到的CV值，这在实际工作中应引起注意。

3、前向角散射光检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2-0.5μm左右。

4、FCM分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间（dead time）。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达3 000个/s-6 000个/s，大型机已达每秒几万个细胞。

5、FCM分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选速度为300个/s，大型机的FCM最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低；反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或舍的决定。因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。图1-2-12为两种细胞分选原理示

意图。

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图1-2-12 细胞分选示意图

（左：通道式分选； 右：电荷式分选）

(三) 流式细胞仪补偿设置

众所周知，流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算机统计处理变为可读数据。

现在流式细胞上常用的荧光素有：

激发波长 发射波长

FITC 488nm 525nm

PE 488nm 575nm

PE-TR 488nm 615nm

PE-Cy5.5 488nm 667nm

PE-Cy7 488nm 767nm

（以上五种荧光染料可在Coulter XL 或BD Calibur 或Partec,PAS,Cyflow ，Cytomation,Moflo 机型上使用）

APC 633nm 660nm

APC-Cy 633nm 767nm

(以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如Coulter,Altra 或BD Calibur 或Partec Cyflow ML 或Cytomation, Moflow)

以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为FTIC ，PE 的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布，FITC 受激后多数将光源转变为525nm 左右的光；PE 多数将其转变为575nm 左右的光。故在流式细胞仪中对FITC 检测525nm 附近的光，对PE 则检测

575nm

11左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。

图1-2-13 受激光照射后FITC 和PE 分子发射光谱互相干扰图

根据上图中FITC 和PE 发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时，PE 荧光探测器便会误检由FITC 发射的575左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入PE 荧光信号中，从而引起错误。同样PE 受激后也会发出小部分525nm 左右的光，进入FITC 荧光探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。

现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC 、PE 等荧光分子性状十分相近，其发射光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以百分比后的数值。如图：

图1-2-14 FITC 无PE 荧光检测补偿调节示意图

图1-2-15 PE 无FITC 荧光检测补偿调节示意图

其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做FITC、PE、PE-Cy5三色荧光分析原则上需要调节的补偿有：FITC-%PE，PE-%FITC，PE-Cy5-%FITC，PE-Cy5-%PE，FITC-% PE-Cy5，

PE-% PE-Cy5六组补偿，即有23种组合。

由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以525nm或其他波长的光信号可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿过程中的百分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0。由此补偿的百分比数值将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。

要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。如现进行FITC、PE双色分析，先准备该试剂的阴性对照管：

A：IgGFITC/IgGPE，通过调节电压，使阴性群体落在FTIC及PE双阴性区。（注：在进行调补偿时，必须将原补偿全部归零）

图1-2-16 PE和FITC分子的阴性对照

阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。当荧光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号），和特异性结合信号。所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围。

B： FITC

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13图1-2-17 未调补偿的双参数直方图

上图为未调补偿的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只含有PE 标记的IgG 阴性对照（如同A 管一样），所以仍将没有何任信号出现。但实际情况并不如此，在PE 坐标上出现了阳性信号。这个信号就是由于FITC 荧光漏入PE 探测器中而引起的。此时就要取一合适百分比与FITC 信号相乘后去抵消PE 中的信号。（此时电压已通过阴性对照设定，绝对不可变动！）

通过调节补偿参数如下图：

图1-2-18 A 管FITC 荧光信号补偿的调节

打个比方，通过A 管已将FITC 、PE 的荧光信号设为零；此时检测FITC 标记抗体与PE 阴性对照，FITC 信号假设为1000，漏入PE 的信号为200。在补偿调节1号位时，补偿数字为5%，通过计算得出PE 信号：200-1000x5%=150；此时1号位的补偿不足。同理2号位的补为15%，此时PE 信号为：200-1000x15%=50；补偿仍显不足。3号位的补偿为20%，PE 信号为：200-1000x20%=0，补偿调节良好。4号位补偿为30%，PE 信号为：200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头，PE 的信号会比原来的本底还低。补偿调节不足或过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出现。

当将FITC 漏入PE 的信号恰好全部减除时，即PE 信号与原来本底相同时，此时的补偿便是正确的；即FITC 单阳性细胞的PE 的平均荧光强度与双阴性细胞PE 荧光强度一致。

图1-2-19 FITC/PE 双阴和FITC 单阳荧光示意图

对于FITC 阳性细胞，通过调节补偿需将PE 中的信号恢复至与其本底一至。由上图可知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过A 管调节电压确定阴性范围。其次，在检测FITC 标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将

PE

14的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿。

同理，如检测C 管：FITC 阴性对照/PE 标记抗体，可将PE 漏入FITC 中荧光去除。但前提条件是在C 管中要存在FITC/PE 双阴性细胞和PE 单阳性细胞。

图1-2-20 FITC/PE 双阴和PE 单阳荧光示意图

在流式细胞上，当PE 单阳性细胞的FITC 平均荧光强度与双阴性细胞的FITC 平均荧光强度一致时，补偿便调节完毕。

在做多色分析时，必须做荧光之间的补偿。方法如上，先准备各种标记的荧光阴性对照，调节确定合适的放大电压。逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。

在日常工作中，我们可以用CD4/CD8，或CD3/CD4/CD8多色抗体来调节荧光补偿。现将其原理及方法解释如下。

在人外周血中，存在有T 、B 、NK 等白细胞。当加入CD3-PE-Cy5/CD4-FITC/CD8-PE 三色荧光抗体时，会出现以下几种情况：

CD3-/CD4-/CD8-细胞群：如B 细胞

CD3+/CD4-/CD8-细胞群：如NK 细胞

CD3+/CD4+/CD8-细胞群：如辅助型T 细胞

CD3+/CD4-/CD8+细胞群：如杀伤型T 细胞

由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调节补偿的基本要求。已知不存在CD3-/CD4+和CD3-/CD8+阳性细胞，又已知PE-Cy5对于PE 和FITC 的干扰很小，所以不用考虑CD3-PE-Cy5荧光对CD4-FITC 、CD8-PE 荧光的干扰（不会有假阳性存在）。补偿调节如下：

图1-2-21 CD3-PE-CY5、CD4-FITC 和CD8-PE 荧光相互干扰的补偿

在许多实验中，会用到某一标记物进行设”门”情况。此时最终观察的单参数结果而非双参数，所以往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清楚地理解补偿的形成及调节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设”门”的实验方案。

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第二章流式细胞术样品制备及分析技术

第1节样本单细胞悬液的制备方法

一、新鲜实体组织样本的制备

FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。现在已有专门的样本制备仪（见图2-1-1），但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。

图2-1-1 流式细胞术自动细胞分离器（BD，Medmachine）

（一） 酶消化法

1、作用原理：

对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。

2、注意事项：

①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的pH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。

3、方法学程序

（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；

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（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；

（3）一般消化20-30 min（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；

（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞碎片；

（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。

（二）机械法

机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。1、剪碎法：

（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；

（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；

（3）加入10ml生理盐水；

（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；

（5）离心沉淀1000 rpm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800 rpm）短时离心沉淀去除细胞碎片；

（6）以300目尼龙网滤去细胞团块；

（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。

2、网搓法

（1）将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；

（2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；

（3）收集细胞悬液，500-800 rpm离心沉淀2min；

（4）固定细胞或低温保存备用。

3、研磨法

（1）先将组织剪成1-2 mm3大小组织块；

（2）放入组织研磨器中加入1-2 ml生理盐水；

（3）转动研棒，研至匀浆；

（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；

（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 rpm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀；

（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。

（三）化学处理法

1、作用原理

化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。

2、试剂的配制

（1） 0.2%EDTA配制：称EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4℃保存；

（2）胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0.2g 加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。

3、实验方法

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（1）将组织切成薄片，置入试管中；

（2）首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；

（3）再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒温水浴振荡器内30min；

（4）用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000 rpm，5min。再以生理盐水洗2-3次；

（5）细胞固定或低温保存备用。

以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。

（四）注意事项

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织

坏死以及细胞自溶，影响FCM测定结果；

2、根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的

不稳定；

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方

面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞

瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；

往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺

癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca2+、Mg2+存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。

二、组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备

正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。

1、取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；

2、另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新

鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取3块以上；

3、在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；

4、先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细

胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS 液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；

5、细胞加固定液或低温保存，备用。

三、石蜡包埋组织样本的制备

石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。

1、实验方法：

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（1）把石蜡包埋组织切成40-50um厚的组织片3-5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中；

（2）加入二甲苯5-8ml, 在室温下脱蜡1-2 天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；

（3）水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10 min，去乙醇，加入蒸馏水3-5 ml，10 min 后弃之；

（4）消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，在消化期间，每隔10min 用振荡器振荡1次；

（5）消化30 min 后，立即加生理盐水终止消化；

（6）经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2次消化；

（7）收集细胞悬液，离心沉淀1500 rpm ,再以生理盐水漂洗1-2 次，离心沉淀500-800 rpm 去碎片；

（8）保存细胞备用。

2、注意事项

（1）一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1遍应在12小时左右，第2遍为30min左右。检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净；反，则蜡尚未脱净；

（2） 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；

（3） 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。（4）消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用尖吸管吹打成悬液状；

（5）消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在300目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。

四、外周血单个核细胞样本的制备

血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。它是流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多见。

1、外周血细胞样本制备方法的选择

一般检测细胞大分子成分——DNA、RNA、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细胞表面标志检测可采用溶红细胞法。

2、单个核细胞样品制备程序

（1）取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 ml ,混匀；

（2）将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；

（3）离心2000rpm,30min,室温18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4 层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；

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（4）用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍，每次均以1500 rpm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；

（5） 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。

五、骨髓细胞单细胞悬液的制备

1、制备方法

（1）无菌抽取骨髓液0.5 ml；

（2）将骨髓标本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中；

（3）再加入PBS液稀释至10ml；

（4）用吸管吸取5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；（5）在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；（6）吸取有核细胞层，加入到10 ml PBS液中，混匀；

（7）以1000 rpm 离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。

2、注意事项

（1）抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中；

（2）在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在300 ul 左右，这样有利于洗去多余的分层液；

（3） 溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现，立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。

六、培养细胞的单细胞悬液的制备

1、培养细胞的特征

一般细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细胞团块或连接成片。如果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响FCM结果，进而导致实验失败。所以，制备合格的培养细胞单细胞悬液十分重要。

2、培养细胞样品的制备程序：

（1）将培养细胞用0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根据室温情况而定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加PBS液；

（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；

（3）短时低速离心，即800-1000 rpm，5 min；

（4）弃上清，加pH 7.4的PBS液5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 min ；重复2- 3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；

（5）加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。

七、脱落细胞样品单细胞悬液的制备

在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。

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1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备

(1) 将食管拉网器上的细胞洗脱到20 ml PBS液中，以1500 rpm 离心后，再用PBS液洗

2次，离心500-800 rpm, 1-2 min，弃上清；

(2) 再加入PBS液5 ml ，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

(3)加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。

2、尿液脱落细胞的单细胞悬液的制备

（1）用一清洁器皿收集24小时尿液，置4℃冰箱中自然沉淀2小时，轻轻倒去上清液，留下少许带细胞的沉淀物，用吸管移至10-20 ml 离心管中；

（2） 500 rpm 离心 10min ，去上清；

（3） 加PBS液8-10 ml，以1000 rpm 离心10 min ，去上清；重复再洗1 次；

（4） 再加5 ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

（5）再加少许PBS液，混匀。加固定液或低温保存，备用。

3、胸、腹水脱落细胞的制备

（1）抽取胸、腹水50-100 ml ，加入1000 IU/ml肝素液1 ml ，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6-12 h，弃去上清；

（2） 将底部10-20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3 次，以1500 rpm 离心沉淀5 min ；

（3）再加5 ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

（4）加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。

4、冲洗液细胞样品的制备

（1）用300-500 ml 生理盐水冲洗膀胱,冲洗一定时间后,吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6-12 h；

（2）取沉淀液20-40 ml ,离心沉淀并以生理盐水洗2 次, 吸上清；

（3）加10 mlPBS液，混匀；以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；

（4）过滤后1000 rpm,10 min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。

第2 节样品的荧光标记和检测分析

一、荧光标记原理

定量细胞荧光染色，要求细胞成分染色的均匀性，保证染色做到染料分子数与被染的某种参量成一定的量效关系。在流式定量分析中，掌握好荧光染色液的浓度非常重要。为了更好地说明这个问题，可以用下式表示：

F=Q(I-eεCL)

式中F表示荧光强度，Q表示光量子产额，I表示激发光强度，ε表示消光系数，C表示染色浓度，L表示浓度厚度。当激发光增强时，荧光强度相应按比例增加；当荧光强度达到1.0时，继续增强光密度，荧光不仅不会增加，还会造成结合到细胞上的荧光素发生猝灭现象。一个荧光分子发射的荧光，有可能被邻近的分子吸收淬灭。由于这种淬灭现象，如果再增加荧光染料浓度也不会使荧光强度增大。

1、荧光染料与细胞参量结合的方式

（1）共价键结合：DNA链的连结之间被打开，形成与荧光染料分子共价键结合，这种结合方式不十分稳固，冲洗过多易造成荧光分子丢失。例如异硫氢酸盐荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（phycoerythrin, PE）等这些荧光染料。

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