过氧化物酶活性的测定POD

过氧化物酶活性的测定POD

一、原理：

过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。，

二、实验准备

仪器：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器 试剂：

愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录） 反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H2O2 19μl，混合均匀，保存于冰箱中。]

三、步骤：

1、粗酶液的提取：称取植物材料0.4-0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml（分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min离心10min，收集上清液于冷处（冰箱4度保存）。

2、酶活性的测定：一个试管入反应混合液3ml，磷酸缓冲液（7.8） 1ml，作为校零对照，另外加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（龙麦26酶液稀释10倍，克旱16酶液稀释15倍），立即开启秒表计时，于470nm测OD值，每隔15秒读1次值，读45秒，以为每15秒钟OD变化值测酶活性的大小，以△OD/min.mg蛋白质表示。

四、计算公式

VVt POD活性?0.01?t?W?A470?ΔA470：反应时间内吸光值的变化 W：样品重量

V：提取液总体积，即5ml Vt：测定时所用体积,即1ml t：反应时间

注意：一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。

——张志良，瞿伟菁，P123-124,2004高教版《植物生理学实验指导》 ——李玲主编，P97-98，科学出版社，2009,《植物生理学模块实验指导》

磷酸缓冲液配置

A 0.2mol/l NaH2PO4 27.8g NaH2PO4?H2O 1000ml B 0.2mol/l Na2HPO4 71.7g Na2HPO4?12H2O 1000ml A(ml) B(ml) PH7.8 8.5 91.5

200ml PH6.0 87.7 12.3

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