1.实验室与基本操作（植物组织培养）

第一章 实验室与基本操作

第一节 实验室及其基本设备

实验室的大小取决于工作的目的和规模：

1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。

2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。

实验室设计

标准的组织培养实验室包括：洗涤室（准备室）；配置室；灭菌室；接种室；培养室；观察室等

一、准备室

作用：材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等的准备工作。

普通化学实验室：仪器及设备、化学药品。

纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑等 。 作用：配制培养基。

洗涤室：清洗、贮存器皿设施、鼓风干燥箱等。 作用：玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。

灭菌室：

①高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。 作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒 ②细菌过滤器

二、无菌操作室

作用：进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操作，对组织培养成功起关键作用。

试验设施；超净工作台；紫外灯；固定式和移动式载物台；消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架；手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等

超净工作台 (a laminar flow hood)

工作原理:利用鼓风机驱动空气通过高效过滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

三、培养室

作用：进行材料的培养的场所。其大小、规模可根据工作性质设定。以充分利用空间和节能为原则。

设备：可调控光、温、湿度等设备。还有固定式培养架、转床、摇床。适用于器官（芽、茎、花药等）、愈伤组织、细胞和原生质体的固体培养和液体培养。

四、细胞学实验室

作用：细胞学和组织学观察。

设备：需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。

五、温室

作用：培育组织与细胞培养出来的材料，组培苗的移栽锻炼。

第二节 基本操作

一、洗涤方法

1、重铬酸钾洗液：

饱和的重铬酸钾洗液：43克重铬酸钾溶于1000毫升蒸馏水中（饱和溶液）。按1：1体积比将浓硫酸缓慢地倒入饱和重铬酸钾水溶液中。

流程： （12h）

水洗 → 晾干 → 重铬酸钾洗液 → → 自来水冲净 、蒸馏水洗两次 → 干燥 2、洗涤剂：洗衣粉、洗液

3、超声波洗净器：小型玻璃器皿，顽固性污渍。超声波除污。（要加水） 新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小时，洗衣粉、自来水洗、蒸馏水冲。 污染的玻璃器皿：要先高压灭菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。

二、灭菌方法

1、干热灭菌：利用鼓风干燥箱（烘箱）进行烘烤灭菌的方法。箱内温度控制在150℃，120min。玻璃器皿. 2、湿热灭菌：利用高压蒸汽灭菌的方法。一般温度为121℃，压力0.1MPa，消毒15～20min。培养基灭菌.

3、熏蒸灭菌：利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。用甲醛内加入高锰酸钾、百菌清、硫磺熏蒸。用3%来苏尔溶液或1%漂白粉水溶液，或0.2%过氧乙酸溶液喷洒、拖擦地板。培养室、接种室灭菌.

4、过滤灭菌：使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，滤膜孔径需选用0.3～0.45μm。在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。液体培养（不耐高温活性物质）

5、药剂灭菌：用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸钠、新洁尔灭、Clorox等药剂灭菌的方法。培养材料灭菌。 6、烧灼灭菌：用酒精灯烧灼达到灭菌的目的。接种器具灭菌。

7、射线灭菌：用紫外线照射的方法灭菌。照射时间一般为15～30min。接种时应关闭紫外灯。室内灭菌。

三、无菌操作

1. 接种室以及工作台灭菌：紫外灯30分钟，用时一定要关闭它。 2. 工作台消毒：70%乙醇，用小型喷壶消毒或棉球擦拭。

3. 点燃酒精灯，开启灭菌器,对使用器械进行烧烤灭菌。器械冷却后方可使用。

第三节 培养基的配置

一、培养基成分（culture medium：维持离体细胞生存和生长的溶液） 主要有：

1、无机盐：包括大量元素（N，P，K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I）。 2、有机化合物：碳源（糖类），维生素类，有机含氮化合物。

3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。 4、附加物类：琼脂，活性炭，椰乳，硝酸银等。

1、无机盐——大量元素和微量元素 大量元素：

N：用量最多。常用的有硝态氮和铵态氮，KNO3、NH4NO3植物组织，从培养基中吸收氮后形成蛋白质。 P：在植物组织培养在的细胞增殖分化大量需要。主要从NaH2PO4、KH2PO4供应。磷参与核酸、能量代谢。 K：直接影响培养物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或KH2PO4供应。

Ca、S、Mg： CaCl2、Ca(NO3)2作为Ca来源，MgSO4作为S和Mg的来源。 微量元素：

主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。植物对这些元素需要量甚微，稍多会发生毒害。Fe是用量较多的一种微量元素，对组织中叶绿素的合成和延伸生长起重要作用。铁常以FeSO4和乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)的螯合物存在于培养基中。

2、有机化合物（organic compounds) ①有机碳源：即糖类。

作用：维持培养基的合适渗透压对初生细胞和原生质体的完整性有十分重要作用。另外，糖类也是合成有机物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作为氮源，蔗糖一般浓度为2%～3%。

糖的浓度影响组织分化类型：

在高浓度（3%～4%）的蔗糖有利于韧皮组织分化；低糖浓度（1.5%～2.5%）时，仅生长出木质部；适中浓度时形成具有木质部和韧皮部。

②维生素类

作用：直接参与生物催化剂（酶）的形成、蛋白质、脂肪代谢等重要生命活动。

③有机含氮化合物

氨基酸：常用的为：甘氨酸及酰胺类物质。如谷氨酰胺、天冬酰胺和多种氨基酸混合物。水解乳蛋白、水解酪蛋白。

3、植物生长调节物质 ①生长素：

吲哚乙酸（IAA）：在培养组织中有吲哚乙酸氧化酶，可使IAA解体，而且也可在光下分解，用量稍高。 吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA），人工合成化学物质，用量低（0.1～2mg/L）。 2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），作用比IBA和NAA强。 ②细胞分裂素： 激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-异戊烯基腺嘌呤（2iP）、噻重氮苯基脲（TDZ） ③赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生长调节物质也在组织培养中应用。 GA3—主要用于促进试管苗的生长；ABA—体胚的发育成熟；PP333—促进壮苗。

在组织培养中，生长素的主要作用是诱导外植体脱分化产生愈伤组织及促进培养物生长，诱导根器官的分化。细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导不定芽和胚状体的分化和形成，延缓组织衰老，增加蛋白质合成。

4、 附加物类 常用附加物类有:

①琼脂: 组织培养支持物.本身并不提供任何营养，它是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后(40℃以下)即凝固为固体状的凝胶。在固体培养方式中不可缺少。一般用量为0.5%～1.0%，有固体条状和粉状两种。

②琼脂糖:可改善培养物的供氧状况。 ③聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、维生素C（Vc）以及硝酸银等，可防止培养材料的褐变.

④活性碳(AC)：具有吸附能力，减少有害物质的影响，如可防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。也有利于某些植物生根 .用量1-5%.

⑤ 马铃薯萃取液：多用于壮苗的培养，在使用时可将马铃薯去皮、切碎、水煮20一30分钟，然后将滤液加入培养基中，其用量通常为100—200g/L。当培养基中添加了马铃薯萃取液后，可以对pH产生缓冲作用，试管苗也生长得更为健壮。 ⑥香蕉：多用于兰花的组织培养，将成熟香蕉果肉捣烂后，添加到培养基中，用量150—200g/L。香蕉果泥可缓冲培养基的pH，对外植体的分化有着较为明显的促进作用。

⑦椰乳：Coconut milk, CM。用于较难培养的植物材料的培养基中。可将椰子的液态胚乳取出、或高压灭菌，或无菌过滤。使用浓度100-200mL／L。

二、培养基的种类 （一）常用的培养基： MS培养基

无机盐数量适宜，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其他培养基高。

应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、花卉、蔬菜等的组织培养。

B5培养基

铵的含量较低。在豆科植物上应用最多。 培养大豆细胞和组织培养设计。

White培养基

成分比较简单，无机盐和糖的用量低。

（二）培养基按试验目的分为：

诱导培养基，继代培养基，分化培养基，生根培养基。 1、诱导培养基 （脱分化培养基）： 外植体诱导发生愈伤组织的培养基。

水稻诱导愈伤组织时加2.4-D；而烟草、胡萝卜既需生长素，又需细胞分裂素。

2、继代培养基： 诱导出愈伤组织后，使愈伤组织能不断地生长下去的培养基。 3、分化培养：由愈伤组织诱导形成小苗（幼芽或胚状体）的培养基。

① 不加任何激素的基本培养基，即可诱导分化。如水稻、珍珠粟、甘蔗等植物。

② 加较高浓度细胞分裂素和少量生长素培养基。如烟草、矮牵牛、四季海棠、天竺葵、菊花、倒挂金钟等组织的分化。 ③ 只加细胞分裂素的培养基。如豌豆、油菜、小麦等。

4、生根培养基：诱导再生小苗生根的培养基。

①在无任何生长激素的基本培养基中就可生出良好的根系。如烟草、红薯、草莓、枸杞等。 ②有些需加入少量的NAA、IAA或IBA以诱导根。

③有些需要减低培养基中无机盐的浓度。如用MS 培养基中1/2或1/4的无机盐诱导生根，常可获得良好的效果。

（三）培养基按其物理性质划分为： 1、固体培养

在培养基中加入一定量的凝固剂，使液体培养基固化,一般用于组织或器官培养. 优点：使用方便，占地不大。

缺点：培养外植体只能有部分组织与培养基接触，培养物上下部因接受养分不均匀，引起组织生长的差异。

2、液体培养

培养物消毒后直接置于液体培养基中培养,一般用于细胞培养。 优点：培养物吸收营养比较充分，容易获得均匀一致的细 胞群体。

缺点：转换培养基较麻烦。

液体培养又分为静止培养和振荡培养两种形式： 1、静止培养

在液体培养中用滤纸做成纸桥，桥系紧贴培养液表面，四周插入溶液中，直至瓶底部，使营养液借助毛细管力渗入滤纸，培养物置于滤纸桥面，通过纸桥源源不断地供给养分。 2、振荡培养

将装有培养物和液体培养基的器皿置于转床或摇床上进行培养，它既能使培养物在培养过程中均匀的接触吸收培养基成分，又能保持良好的通气条件.

摇床有旋转式、半旋转式和往复式三种。速度比转床快。

（四）培养基的筛选

1、筛选：在多种培养基上培养，根据培养物的生长情况，确定较适宜的培养基。

2、调整：根据培养物的生长情况或培养目的的不同，对培养基进行调整，探索新的培养基。 如：改良MS、改良B5培养基、N6培养基等。

三、 培养基的制备 （一）母液的配制

1、大量元素母液：配制原溶液的10～50X，依次溶解，混合定容。

2、微量元素母液：一般配制100X，定容。称量时最好用万分之一的电子天平。

3、铁盐母液：亦配制100X，硫酸亚铁和乙二胺四乙酸钠（Na2-EDTA）分别溶解后，混合后再螯合30分钟，最后定容。 4、有机物母液：100X，定容。

5、生长调节物母液：浓度0.5～1mg/ml。

生长素类：IAA、2.4-D、NAA、IBA为有机酸，制备时用碱液溶解。

IAA溶液配置：一般称25mg ，加0.1mol/L NaOH 2～3ml，溶解后，加水定容25ml，即为IAA 1mg/ml，也可用无水乙醇溶解后定容。

细胞分裂素类，KT、BA等，一般用0.1mol/L HCl溶解后加水定容。

配制母液注意几点：

1、配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。 2、母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。

3、母液贮备时间不宜过长。过长时宜出现沉淀和微生物污染。

（二）培养基配制

1、按培养基配方浓度将母液实际用量依次加入大量筒中。 2、然后将蔗糖溶解加入，用蒸馏水定容至所需要的体积。 3、调整pH值（0.1～1mol/L NaOH或0.1～1mol/L HCl)。

4、另外,琼脂溶解后的总体积计算在培养基体积中，溶解后，分装培养器皿中，加塞，准备消毒。

第四节 离体培养体系的建立

一、建立离体培养体系的基本程序

1. 无菌外植体的获得 2. 初代培养物的建立 3. 形态发生和植株再生

二、外植体选择的基本原则

1. 再生能力强：基因型；分化程度；发育年龄；器官和组织的类型、部位等。 2. 遗传稳定性好； 3. 外植体来源丰富；

4. 外植体容易灭菌：地上比地下、一年生比多年生、幼嫩比老龄、健康比受伤组织灭菌容易。 5. 外植体大小适宜

三、培养材料的灭菌

（一）灭菌的要求：①消灭病菌 ②减少对材料的损伤 （二）常用消毒剂： （三）材料灭菌过程

1、材料前处理：自来水冲洗，此过程在准备室内完成。 2、消毒液处理：

用酒精、升汞、次氯酸钙等配制好的溶液进行消毒。 程序:首先75%酒精30S,0.1%升汞消毒5～30min。 3、无菌水冲洗：

3-5次，每次要把镊子、刀片等器械，进行酒精灯烧灼消毒。 2-3步骤操作在超净工作台中进行。

四、污染主要类型及特征

1、细菌：菌斑粘液状，在材料基部挨着培养基的部位，一般短时间内可以观察到。1-3天。 2、真菌：有颜色的霉菌。时间较长才能看到。10-30天之后出现。

五、污染的控制

1、操作环节：

防止污染的主要措施是：①改善环境条件、②严格执行无菌操作、③严查接种材料、④经常检查灭菌设备的质量、⑤检查培养容器是否存在问题。 2、内源细菌

⑴ 培养基中加入杀菌剂：添加抗菌素（200mg/Ｌ的青霉素）、链霉素、庆大霉素和头孢唑林钠、苯甲酸钠。 ⑵ 反复茎尖培养：致病菌在植物体内通过维管束传播，通过反复的茎尖培养既可脱除内生菌，又可脱病毒。 ⑶ 降低PH值：大多数细菌在介质PH小于4.5时不能生长。培养基的PH值由5.8调至3.9～4.3，可防止大量的细菌污染。

小 结

1. 组织培养的实验室及基本设备

准备室、无菌操作室、培养室、细胞学实验室、温室 2. 无菌操作：洗涤、灭菌、无菌操作

3. 培养基的制备：培养基的成分、种类、制备程序 4. 离体培养体系的建立

培养材料的选择、确定原则，影响取材部位的因素、材料的灭菌、污染的控制等。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ltqo.html