DL-96试剂 SOP文件

X X X 检验科 临床微生物实验室 DL-96细菌测定系统 标准操作规程 编号：WSW-SOP-1 日期： 年 月 版号： 第 1页，共4页

【目的】

规范DL-96细菌测定系统随机体外诊断试剂操作规程，保证检验质量。 【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【原理】

试剂板由生化反应孔和抗菌药物MIC测定孔组成。在生化反应孔中加入细菌悬液，经35-37℃孵育，在细菌代谢作用下生化反应直接颜色变化或经加入显色剂后产生颜色变化；抗菌药物MIC采用微量肉汤稀释法，加入还有细菌的MH肉汤培养基，经35-37℃孵育，根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定细菌是否生长。测定系统采用比色法对各项生化反应进行结果判定，根据细菌生化反应的概率来完成细菌的鉴定；测定系统通过比浊法对抗生素进行MIC半定量测定分析MIC值。

【操作程序】

1 使用本试剂板的基本要求：

1.1无特殊营养要求的革兰氏阳性菌、革兰阴性菌和真菌等病原菌 1.2 18-24小时分离培养的单个纯菌落（或纯培养物）。 2 随机试剂板的选择：

2.1根据待测菌的培养特性、菌落特征、氧化酶实验、触酶试验结果以及革兰染色情况，选择好相应的试剂板。 2.2试剂板的选择DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH、DL-96STREP、DL-96FUNGUS 3试剂板的接种

3.1 菌悬液与药敏液的配置

菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液，要求如下： DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH的菌悬液都制备0.5麦氏单位； DL-96STREP菌悬液制备2麦氏单位； DL-96FUNGUS菌悬液都制备1麦氏单位；

药敏液的配置：具体请见细菌测定系统随机体外诊断试剂板使用说明书 3.2 试剂板的接种

3.2.1 DL-96E试剂板:适用于氧化酶试验阴性的革兰氏阴性杆菌的鉴定和抗菌药物MIC测定。 3.2.1.1菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液（0.5麦氏单位）。

3.2.1.2用连续移液器 （配无菌移液吸头）吸取该菌悬液加入试剂板A1-A12、B1-B12和C1—C4孔内，每孔100μl。

X X X 检验科 临床微生物实验室 DL-96细菌测定系统 标准操作规程 编号：WSW-SOP-1 日期： 年 月 版号： 第 1页，共4页 3.2.1.3在A1-A7孔分别滴加无菌石蜡油2滴。

3.2.1.4吸菌悬液50μl，加至肉汤培养基内，充分混匀，继续加入试剂板的其余各孔（所有的抗菌药物MIC测定试验孔及生长对照孔C+），每孔100μl。

3.2.1.5剩余的菌液及吸头浸入杀菌溶液内浸泡灭菌。

3.2.2 DL-96NE试剂板:适用于氧化酶试验阳性或氧化酶试验阴性但厌氧葡萄糖不产酸的革兰氏阴性杆菌的鉴定和抗菌药物MIC测定。

3.2.2.1菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液（0.5麦氏单位）。

3.2.2.2用连续移液器（配无菌移液吸头）吸取该菌悬液加入试剂板A1-A12和B1-B12孔内，每孔100μl。 3.2.2.3在A1-A7孔分别滴加无菌石蜡油2滴。

3.2.2.4吸取菌悬液50μl，加至肉汤培养基，充分混匀，继续加入试剂板的其余各孔（所有的抗菌药物MIC测定试验、生长对照孔C+及6.5%NaCl），每孔100μl。 3.2.2.5剩余的菌液及吸头浸入杀菌溶液内浸泡灭菌。

3.2.3 DL-96STAPH试剂板：适用于触酶试验阳性的革兰氏阳性球菌的鉴定和抗菌药物MIC测定。 3.2.3.1菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液（0.5麦氏单位）。

3.2.3.2用连续移液器（配无菌移液吸头）吸取该菌悬液加入试剂板A1-A12和B1-B10孔内，每孔100μ1。 3.2.3.3在A1-A3孔分别滴加无菌石蜡油2滴。

3.2.3.4吸菌悬液50μl，加至肉汤培养基内，充分混匀，继续加入试剂板的其余各孔（所有的抗菌药物MIC测定试验孔及生长对照孔C+），每孔100μl。

3.2.3.5剩余的菌液及吸头浸入杀菌溶液内浸泡灭菌。

3.2.4 DL-96STREP试剂板:适用于触酶试验阴性的革兰氏阳性球菌的鉴定和抗菌药物MIC测定。 3.2.4.1 记录菌落溶血类型（α-溶血、β-溶血）。 3.2.4.2挑取纯培养单个菌落于0.3ml无菌水中，混匀。 3.2.4.3将以上菌悬液浇于或用无菌棉拭子均匀涂于血平皿上。

3.2.4.4对于β-溶血链球菌和肠球菌，经以上24小时孵育，一般能形成较大的菌落，对于其它链球菌需经48小时孵育才可形成较大的菌落。对于某些对营养要求极高的苛养菌，则取菌落于链球菌专用培养液（1ml）中35-37℃孵育5小时，将以上菌悬液均匀浇于血平皿上, 再置35-37℃ 孵育18-24小时。 3.2.4.5菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈细菌悬液（2麦氏单位）。 3.2.4.6用连续移液器（配无菌移液吸头）吸取该菌悬液加入试剂板A5-A12孔内，每孔100μl。

X X X 检验科 临床微生物实验室 DL-96细菌测定系统 标准操作规程 编号：WSW-SOP-1 日期： 年 月 版号： 第 1页，共4页 3.2.4.7吸菌悬液500μl，加至肉汤培养基A内，充分混匀，继续加入试剂板A1-A4、B1-B7孔内，每孔100μl。

3.2.4.8在A1-A4、A9、B1-B7孔分别滴加无菌石蜡油2滴。

3.2.4.9吸剩余肉汤培养基A 50μl，加至肉汤培养基B内，充分混匀，继续加入试剂板的其余各孔（所有的抗菌药物MIC测定试验孔、生长对照孔C+及6.5%NaCl），每孔100μl，并在C1孔滴加无菌石蜡油2滴。 3.2.4.10剩余的菌液及吸头浸入杀菌溶液内浸泡灭菌。

3.2.5 DL-96FUNGUS试剂板:适用于真菌的鉴定和抗菌药物MIC测定。

3.2.5.1菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨呈菌悬液(1个麦氏单位)。

3.2.5.2用连续移液器 （配无菌移液吸头）吸取该菌悬液100μl加至同化稀释液内，充分混匀，加入试剂板C1-C11和D1-D12孔内，每孔100μl。

3.2.5.3用连续移液器 （配无菌移液吸头）吸药敏稀释液100μl加入E12孔内。

3.2.5.4再吸菌悬液20μl，加至药敏稀释液内，充分混匀，加入试剂板E1-E11和F2-F12孔内，每孔100μl。 3.2.5.5剩余的菌液及吸头浸入杀菌溶液内浸泡灭菌。 3.3试剂板的孵育

撕开不开胶的纸对齐贴于测试板，35-37℃孵育（DL-96FUNGUS试剂板放置30℃湿盒内孵育） 4 随机试剂板的检测

4.1 试剂板孵育培养18-24小时后（个别生长缓慢可延长36-48小时）检测试剂板，按照使用说明的要求向DL-96E 、DL-96NE、DL-96STAPH、DL-96STREP测试板加入辅助试剂。

4.1.1 DL-96E：先于A12孔（VP）滴加VP试剂A、B各1滴，20分钟后，再于A11孔（IND）滴加靛基质试剂1滴，数分钟后，于A10孔（PHE）滴加苯丙氨酸试剂1滴，立即判读结果。

4.1.2 DL-96NE：1.先于A11孔（IND）滴加靛基质试剂1滴，数分钟后，再于A10孔（NIT）滴加硝酸盐还原试剂A、B各1滴，立即判读结果。

4.1.3 DL-96STAPH：先于A12孔（VP）滴加VP试剂A、B各1滴，30分钟后，再于A10孔（PYR）滴加PYR试剂1滴及All孔（NIT）滴加硝酸盐还原试剂A、B各1滴，立即判读结果。

4.1.4 DL-96STREP：先于A11孔（VP）滴加VP试剂A、B各1滴，于A10孔（PYR）滴加PYR试剂1滴，再于A12孔（HIP）滴加马尿酸盐试剂1滴，30分钟后判读结果。

4.2 打开细菌测定系统软件，录入病人信息资料。选择测试板类型后，按判别键，按照颜色和浊度输入结果，系统自动得出细菌鉴定和药敏试验结果。

X X X 检验科 临床微生物实验室 DL-96细菌测定系统 标准操作规程 编号：WSW-SOP-1 日期： 年 月 版号： 第 1页，共4页 5 报告单的打印 细菌鉴定与药敏试验报告单在细菌测定系统中专家系统中打印。 6 报告的查询与统计

6.1 按查询键进入查询界面：输入查询条件、观察结果。 6.2 按统计键进入统计界面：输入统计条件、观察结果。 【质量控制】 1 质控方法

1.1 DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH、DL-96STREP、DL-96FUNGUS为鉴定与药敏复合试剂板，采用鉴定与药敏一起进行质控。

1.2 鉴定与药敏的质控 每新近一批鉴定卡做一次质控：每一新生产批号鉴定卡需用相应质控菌株做质控以检测生化反应的可靠性；每一新生产批号药敏卡需用相应质控菌株做质控以检测MIC结果的可靠性。材料和试剂批号必须记录并保存。

2 质控步骤 DL-96E 、DL-96NE、 DL-96STAPH、DL-96STREP、DL-96FUNGUS质控步骤同“操作程序”，观察质控是否失控。

3 失控原因分析和处理

3.1 如果失控应按一下步骤进行初步分析和处理 错误使用质控菌株；

每一按照彼岸准操作程序操作； 试剂板超出有效期； 测定系统严重误差；

3.2 无上述因素失控应进一步分析和处理 重新试验以确认误差结果；

确认比浊仪校正在有效期内，功能正常； 确认所有试剂均在有效期内，并妥善保存 确认培养箱温度是否正常； 确认标准菌株是否污染；

确认标准菌株接种平板正确、孵育时间正确； 确认无菌操作下打开试剂板，以防空气污染杂菌。 3.3 如误差无法解决，应联系厂家的技术支持人员。

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