外生长的影响及相关实验技术的研究

湖南师范大学

硕士学位论文

四种人参三醇组皂苷对小鼠骨髓MSC体外生长的影响及相关实验

技术的研究

姓名：朱海林

申请学位级别：硕士

专业：动物学

指导教师：汪保和

20090501

摘要

研究背景及目的：人参皂苷对骨髓间充质干细胞的药理作用鲜见报道。已有研究表明，人参皂苷的脱糖基化可能与其药理活性密切相关。本部分工作旨在研究人参三醇组皂苷对体外培养条件下小鼠骨髓问充质干细胞（ＭＳＣ）增殖的影响，并分析脱糖基化与人参三醇组皂苷药理活性的关系，以期更进一步认识人参皂苷的药理作用机制。

方法：进行小鼠骨髓ＭＳＣ原代和传代培养，分组在ＭＳＣ培养体系中加入人参三醇组皂苷Ｒｅ、Ｒ９１、Ｒｈｌ、ｐｐｔ，测定ＭＳＣ集落形成率和细胞数，自行设计和制作了贴于培养板底部的胶片，此网格用于细胞计数区的定位，用目镜网格计数细胞。目镜网格单元方格的平均细胞计数除以方格的面积，再乘培养孔底面积，从而计算出一个孔的细胞总数。ＭＴＴ比色试验测定细胞活力，实时定量ＲＴ．ＰＣＲ检测Ｃ啪、缈砌Ｅ、以Ｊ珊ⅢＡ表达水平。

结果：体外培养体系中，人参皂苷Ｒｈｌ在１０肚ｍｏｌ／Ｌ～２０“ｍｏｌ／Ｌ的浓度范围内，ＭＳＣ集落产率显著减低；浓度为２０ｕｍ０１／Ｌ时，ＭＳＣ传代扩增细胞数明显减少；浓度在５肛ｍｏｌ／Ｌ～２０ｐｍ０１／Ｌ范围内，ＭＳＣ传代细胞的ＭＴＴ试验吸光值明显低于对照组。ｐｐｔ为２０ｐｍｏｌ／Ｌ时，ＭＳＣ集落产率显著减低，ＭＳＣ传代细胞的ＭＴＴ试验吸光值明显减小。然而，在人参皂苷Ｒｅ和Ｒｇｌ实验组与对照组之间，以上三种实验指标均无明显差异。在培养体系中人参皂苷Ｒｅ、Ｒｇｌ、Ｒｈｌ、ｐｐｔ

为１０“ｍｏｌ／Ｌ时，ＭＳＣ传代细胞的缈砌ＥｍＲＮＡ表达水平明显下降，而ＣＤ灼和叩ｎＴ】ＲＮＡ表达水平无明显变化。

结论：以上结果表明，在一定的浓度，人参三醇组皂苷Ｒｈｌ和ｐｐｔ能减低小鼠原代骨髓ＭＳＣ的集落生成能力，抑制ＭＳＣ传代细胞的增殖，而Ｒｅ、Ｒｇｌ对这些细胞的体外增殖无明显影响。这提示人参三醇组皂苷的药理活性可能有赖于其分子某种程度的脱糖基化。人参皂苷Ｉ沁、ｌ沁ｌ、Ｒｈｌ、ｐｐｔ对ＭＳＣ传代细胞的妒砌Ｅ的表达有下调作用，其意义还需进一步研究。

关键词：人参皂苷，间充质干细胞，体外增殖，网格，细胞计数

ＡＢＳＴＲＡＣＴ

ＢａｃｋｇｒｏｕｎｄａｎｄｐｕｎｐＯｕｓｅ：Ｌｉｍｅ

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主要缩略词

缩略词英文全名中文全名

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ｐｐｔ百ｎｓｅｎｏｓｉｄｅｐｒｏｔ叩ａｎａＸａｔｒｉｏｌ

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嗅盐ｐＯｌｙｎｌｅｒａｓｅＲＴ－ＰＣＲｒｅＶｅｒｓｅ仃ａｎｓｃｒｉｐｔ：ｉｏｎ

ｃｈａｉｎＩ．ｅａｃｔｉｏｎ逆转录聚合酶链反应

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作者签名：朱迄林日期：抄净占月乒日

导师签名：ｉ纠晷铷日期：砷年占月垆日

四种人参三醇组皂苗对小鼠骨髓ＭＳＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究

第一部分：四种人参三醇组皂苷对小鼠骨髓

ＭＳＣ体外生长的影响

前言

１．人参皂苷的研究进展

１．１人参皂苷的分类

人参皂苷（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ，ＧＳ）是人参的主要活性成分，目前已从人参和同源植物中分离出的人参皂苷单体及其活性衍生物约６０多种【１１。人参皂苷分子的多样性是由于苷元结构的不同和连接在苷元骨架上糖组分种类、数目和位置的差异。按照皂苷的系统分类，人参皂苷均属于三萜类皂苷。按苷元结构不同，人参皂苷可分为人参皂苷可分为达玛烷型（ｄａｍｍａｒａｌｌｅ．ｔｙｐｅ）、齐墩果烷型（ｏｌｅａｎａｎｅ—ｔｙｐｅ）及奥克梯隆醇型（ｏｃｏｔｉｌｌ０１．ｔｙｐｅ）。人参皂苷绝大多数属达玛烷型皂苷，且在人参中含量最丰富。达玛烷型人参皂苷又可分为原人参二醇组（ｐｒｏｔｏｐ锄ａ）（ａｄｉｏｌｇｒｏｕｐ）和原人参三醇组（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉ０１ｇｒｏｕｐ），前者包括ＧＳ—Ｒｂｌ、－Ｒｂ２、．ＲＣ、一Ｒｄ、－Ｉ姆３、．Ｒｈ２等，后者包括ＧＳ－Ｒｅ、．Ｒｆ、．Ｒｇｌ、．Ｒ９２、．Ｉｍｌ等［２】。

１．２人参皂苷的药代动力学

研究表明，人参皂苷在肠内菌群及消化液的作用下发生代谢性转变。在肠内，人参皂苷主要受细菌有关酶类的作用，而从末端糖逐步裂解连接在苷元上的寡糖。通过这种脱糖基化作用，原人参二醇组皂苷经过中间产物（如ＧＳ—ｌＨ、．Ｆ２）阶段，生成的主要代谢产物是化合

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物Ｋ（ｃｏｍｐｏｕｎｄＫ，Ｃ．Ｋ），即２０一０．ｐ．Ｄ－吡喃葡萄糖苷基２０Ｓ一原人参二醇，Ｃ．Ｋ还可再脱糖基生成２０Ｓ一原人参二醇（ｐｐｄ）【３１。原人参三醇组皂苷通过脱糖基化，主要经过ＧＳ．Ｒｈｌ、．Ｆｌ等中间产物阶段，生成２０Ｓ．原人参三醇（ｐｐｔ）【４】。

应用ＴＬＣ、ＨＰＬＣ．ＭＳ、ＮＭＲ和ＥＬＩＳＡ进行检测和分析的结果表明，ＧＳ—Ｒｂｌ和ＧＳ．１吨ｌ经口给药后在肠内的吸收率均极低，前者吸收的主要分子形式是Ｃ—Ｋ，以及ＧＳ．Ｒｄ、ｐｐｄ；后者主要以ｐｐｔ及ＧＳ－Ｒｈｌ形式吸收【５矧。用酶免方法测定给大鼠口服Ｋ物质后的药物代谢，发现１５缸ｎ后血浆中出现Ｋ物质，且很快达到高峰，维持时间长达１０ｈ以上，说明口服Ｋ物质吸收很快，消除慢。口服Ｒｂｌ后４ｈ血浆中才出现Ｋ物质，７ｈ达高峰，高浓度维持达１５ｈ，２４ｈ后血浆中仍能检测出，但２４ｈ内未检出Ｒｂｌ。这提示Ｒｂｌ较长时间被胃肠道细菌转化为Ｋ物质，然后在胃肠道的下端被吸收。Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ【刀等给小鼠口服Ｒｂｌ、Ｋ物质也出现了类似的结果。王毅【８】等在ＧＳ．Ｒｇｌ的药代动力学研究中发现在大鼠尿和血中有Ｒｈｌ／Ｆｌ存在。且在人的尿中也检测到Ｒｈｌ。

１．３人参皂苷去糖基化与药理活性的关系

近年来的文献报道，多种人参皂苷在多方面的药理活性依赖其去糖基化。小鼠在体实验显示，ＧＳ．Ｒｂｌ和Ｃ．Ｋ经口给药后，两者都能显著抑制叔丁基过氧化氢（ｔ．ＢＨＰ）诱导的血清丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）和天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）增高，但是，在ＨｅｐＧ２细胞培养体系中，Ｃ．Ｋ对ｔ．ＢＨＰ诱导的细胞毒效应具有保护作用，而ＧＳ．Ｒｂｌ没有这样的作用【９１。Ｃ．Ｋ作腹腔内注射给药能抑制化合物４８／８０诱导的小鼠搔抓行为，

四种人参＝醇组皂苷对小鼠骨髓ＭＳＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究

Ｇｓ．Ｉ№ｌ作腹腔内给药却没有ｃ．Ｋ的止痒剂作用。ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ掣刀报告，Ｃ．Ｋ在体内能抑制黑素瘤细胞的转移，在体外培养条件下抑制肿瘤细胞的浸润；人参标准提取物和人参皂苷经口给药也具有与Ｃ．Ｋ相同的肿瘤细胞转移抑制作用，但没有Ｃ．Ｋ在体外培养条件下的相同效应。Ｌｉｕ等【１０１研究了原人参二醇和原人参三醇两家族皂苷及其一些衍生物对大鼠肝微粒体ＣＹＰ３Ａ活性的影响，结果显示ＧＳ－Ｒｂｌ、－Ｉ妯２、一Ｒｃ、Ｃ－Ｋ、－Ｒｅ和Ｒｇｌ不影响ＣＹ．Ｐ３Ａ的活性，而ＧＳ－Ｒ９２、ｐｐｄ和ｐｐｔ对ＣＹＰ３Ａ具有竞争性抑制作用。陈英杰【１１】等通过比较２１种人参皂苷单体对六种瘤细胞的杀伤作用，对ＧＳ抗肿瘤活性构效关系进行研究，发现抗肿瘤活性受糖基的影响强弱规律是：单糖苷＞二糖苷＞三糖苷＞四糖苷。Ｗ狄ａｂａｙａｓｈｉ【１刁报道，ＧＳ．Ｒｅ、一Ｒ９１及其肠道菌代谢物ｐｐｔ口服后具皆有很强的抗肿瘤细胞转移活性，而静脉注射后只有ｐｐｔ具有很强的抗转移活性，说明Ｒｅ、ＲｇＩ口服抗转移活性是由代谢物ｐｐｔ介导的。这些研究表明，人参皂苷脱糖基化产物才是直接作用于组织细胞的高活性分子形式。

１．４人参皂苷对体外培养条件下骨髓细胞的影响

体外培养条件下，人参皂苷对骨髓造血细胞的生物活性有不少研究。多篇文献报道了人参总皂苷、ＧＳ．Ｒｇｌ、．Ｒｂｌ能促进骨髓造血干／祖细胞的体外增殖与分化【１３－１６１。陈晓建等【１７］报道人参总皂苷、ＧＳ．Ｒｇｌ、．Ｒｂ。能刺激脐血ＣＤ３４＋细胞集落形成，而且单体皂甙的作用优于人参总皂苷。王莎莉‘１８】等发现，人参总皂苷可刺激巨噬细胞，上调造血调控因子ＥＰＯ、ＧＭ．ＣＳＦ、ＩＬ．３、ＩＬ．６的合成和分泌，促进造血干／祖细

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胞的增殖分化。李静等【１９】的工作显示，用人参总皂苷诱导大鼠骨髓巨噬细胞，其培养上清可提高髓系造血祖细胞的集落产率，受诱导的骨髓巨噬细胞高水平表达ＥＰＯＩＩｌ】［ⅢＡ、ＧＭ．ＣＳＦ删ⅢＡ，ＥＰＯ、ＩＬ．３、ＩＬ．６、ＧＭ．ＣＳＦ蛋白水平有不同程度的提高。

人参皂苷对非造血谱系骨髓细胞的作用，目前仅见少数几篇文献报道。卢新政【捌等应用成纤维细胞体外集落形成法、【３Ｈ】ＴｄＲ掺入实验和ＭＴＴ试验，研究了人参皂甙Ｒｇ．对体外培养猪骨髓基质细胞增殖的影响，结果表明人参皂甙Ｒｇ，对骨髓基质细胞增殖有促进作用，且呈剂量依赖性。陈笛等【２１】的研究显示，人参总皂苷能显著促进人骨髓基质细胞的ＧＭ．ＣＳＦ蛋白和ｍＲＮＡ表达。近来，王力【２２】等报道，人参皂苷ＲｇＩ可促进大鼠骨髓间充质干细胞的体外增殖，其机制可能是通过上调ＧＡＴＡｌ和ＧＡＴＡ２的表达以及其与ＤＮＡ的结合活性来实现。２．骨髓间充质干细胞

间充质干细胞（ｎｌｅｓｅｎｃｈⅥ１１ａ１ｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＭＳＣ）是一类成体多能干细胞。ＭＳＣ的发现归功于Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等【２３】的开创性实验，他们将骨髓单细胞悬液低密度种植于塑料器皿，骨髓基质细胞很快贴壁，通过反复洗涤而除去非贴壁的造血细胞，培养一定时间后，培养物中形成一个个清晰可分的集落，由此推定每一个集落来源于一个前体细胞。这些集落由习惯上所说的成纤维细胞组成，因而将这些具有集落生成能力的细胞称为成纤维细胞集落形成单位（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃｃｏｌｏｎｙｆ－ｏ珊ｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ．Ｆ）。不仅将多集落源细胞（即多个ＣＦＵ．Ｆ的后代细胞）移植到宿主动物的肾囊下或其它部位，它们能形成异位小骨，

四种人参三醇组皂苷对小鼠骨髓ＭＳＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究

偶尔形成软骨；而且当移植单集落源细胞株（即单个ＣＦＵ．Ｆ的后代细胞）时，其中一部分能形成同样的异位小骨。这些集落源细胞还能转变成脂肪细胞。研究者们还提出了骨髓内含有多种结缔组织的共同先祖细胞的概念，并之称为骨髓基质干细胞。后来有许多研究显示，骨髓以外的其它器官中也广泛存在着结缔组织干细胞，体内所有这类干细胞统称为间充质干细胞【州。骨髓基质中ＭＳＣ的含量最丰富【２５】。

虽然骨髓中ＭＳＣ含量比其它器官或组织丰富，但其数量仍非常稀少，每ｌ×１０５～ｌ×１０６单个核细胞中有１个ＭＳＣｓ【２６１。要获得足量的骨髓ＭＳＣ，则需要进行体外分离和扩增。目前，ＭＳＣ分离和培养的方法主要有全骨髓培养贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫选择法。利用ＭＳＣ在培养器皿上贴壁生长的特性是对它们进行分离和扩增的基本原则。全骨髓培养贴壁筛选法常用于小鼠、大鼠骨髓ＭＳＣ的分离，该法是将制备的骨髓单细胞悬液直接种植于培养瓶皿，培养一定时间后，通过换液除去未贴壁的造血谱系细胞和其它基质细胞，在原代培养后做传代培养，以求获得大量的高纯度ＭＳＣ。相比而言，全骨髓培养法操作较简单，成本较低，还具有对细胞损伤最小的优点。对兔、狗及人骨髓ＭＳＣ的分离和扩增，一般选用密度梯度离心法，先将骨髓单细胞悬液作密度梯度离心，获取界面的单个核细胞进行细胞培养。根据细胞一些表面标志分子，采用流式细胞仪和免疫磁珠技术分选细胞，然后进行细胞培养。

目前对ＭＳＣ的鉴定，一般采用两种方法：免疫表型鉴定、分化潜能鉴定。目前尚未发现ＭＳＣ独特的表面抗原，ＭＳＣ表达间质细胞、

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内皮细胞、上皮细胞和肌肉细胞的一些标志分子，而不表达造血细胞的标志。已经报道的一些表面抗原包括Ｓ仃０１、ＣＤｌ３、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７ｌ、ＣＤ９０、ＣＤｌ０６以及ＣＤｌ２４等【２７１。根据多种表面抗原阳性和造血谱系抗原阴性的检测结果，而鉴定ＭＳＣ。对认定同源或同质的细胞群进行诱导分化培养，如能向成骨、成软骨和成脂谱系多向分化，可逆推其为间充质干细胞，即为分化潜能鉴定。虽然这种鉴定是后验性的，但由于未找到识别ＭＳＣ的独特标记分子，认为是目前鉴定ＭＳＣ最佳标准。

在正常生理条件下，机体内大多数ＭＳＣ并不增殖，但是在体外补充适宜血清的培养液中，ＭＳＣ能迅速增殖，并在多次传代中保持未分化状态。许多因素可以影响骨髓ＭＳＣ在体外培养条件下的增殖和分化。细胞的种植密度、动物种系、个体的年龄和身体状况、骨髓的取样部位以及分离细胞的技术等因素也都影响它们的生长。然而，这些影响因素中最重要的影响因素是血清。血清的品质、浓度、批次都对骨髓ＭＳＣ的影响较大。Ｈａｙｎｅｓｗ嘣ｈ【２８１等的研究表明，筛选合适批号的胎牛血清有助于ＭＳＣ的贴壁、扩增以及多谱系潜能的维持。Ｌ锄ｏｎｄ等【２９】报道，人骨髓间充质干细胞在体外不同批次血清的培养条件下细胞抑制生长率相差６倍。血清中细胞因子的量及种类的差异是其对骨髓ＭＳＣ作用不同的主要原因。

骨髓ＭＳＣ增殖和分化受到多种细胞因子和生长因子的调节，这些因子在ＭＳＣ上存在相应的受体，现已检测到的有ＩＬ．１Ｒ、ＩＬ．３Ｒ、ＩＬ．４Ｒ、ＩＬ．６Ｒ、ＩＬ．７Ｒ、ＬＩＦＲ、ＳＣＦＲ、Ｇ．ＣＳＦＲ、ＩＮＦ—ＹＲ、ＴＮＦ－０【Ｒ、

四种人参三醇组皂蒈对小鼠骨髓ＭＳＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究

ＴＧＦ．ｐｌＲ、ＴＧＦ．ｐ１Ｒ、ｂＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ等多种细胞因子和生长因子受体。Ｙｏｏｎ掣３伽报道在血清剥夺的情况下，同时在培养体系中加入经骨髓细胞培养获得的无血清条件培养液，人或小鼠骨髓基质成纤维细胞集落均能够形成；但同时做抗体中和实验，加入抗ＰＤＧＦ、抗ＴＧＦ．ｐ、抗ｂＦＧＦ和抗ＥＧＦ四种抗体后，能特异地抑制集落的形成，这提示骨髓基质成纤维细胞前体细胞增殖起始的激活至少需要ＰＤＧＦ、ＴＧＦ．ｐ、ｂＦＧＦ和ＥＧＦ四种因子的参与。

由于骨髓ＭＳＣ具有高增殖、多向分化潜力，易获取、易培养，便于自体移植、无免疫反应等特点，不仅使它们在干细胞生物学基础研究中受到青睐，也使它们成为用于细胞和基因治疗的诱人候选者，尤其对它们作为在组织工程的“种子＂细胞的应用前景，人们有着浓厚的兴趣。然而，在ＭＳＣ能被成功地利用前，它们的许多基本生物学问题和操作性问题还有待弄清和解决，其中的关键课题之一是在阐明其增殖和分化调控机制。

３．本研究的目的和意义

本研究的目的是通过小鼠骨髓ＭＳＣ的原代培养和传代培养，在培养体系中加入四种含不同糖基数的人参三醇组皂苷Ｒｅ、Ｒｇｌ、Ｒｈｌ、ｐｐｔ，观察对体外培养条件下小鼠骨髓ＭＳＣ及其传代细胞生长的影响，初步探索其可能的作用机制，并进一步明确人参皂苷脱糖基化与其药理活性的关系，对人参皂苷的药理研究、临床用药和新药开发具有理论意义和应用价值。

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１．１材料与方法

１．１．１实验动物

昆明种小鼠，雌雄不拘，３～４周龄，体重１８土１．２９，为ＩＩ级动物。由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。

１．１．２主要试剂及仪器、耗材

①主要试剂

胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｎｌｍ，ＦＢＳ）：天津ＴＢＤ生物工程公司产品，５６℃灭活３０ｍｉｎ，分装后一２０℃贮存。

ＤＭＥＭ培养液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｎｌｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）：ＤＭＥＭ粉（低糖，Ｓｉ鄹ｎａ公司产品）用约Ｏ．５Ｌ三蒸水溶解，培养基加入ＮａＨＣ０３３．７９，再加三蒸水至近１Ｌ，用Ｏ．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ至７．Ｏ，三蒸水定容至１Ｌ，正压过滤除菌，４℃保存，使用期２个月以内。

磷酸盐生理盐水缓冲液（ＰＢＳ）：取ＮａＣｌ

Ｎａ２ＨＰ０４ Ｈ２０１．５６９，ＫＨ２Ｐ０４８．ＯＯｇ，ＫＣｌＯ．２０９，Ｌ，０．２０９，用三蒸水溶解，定容至１高压灭菌４０ｍｉｎ，４℃保存备用。

胰蛋白酶溶液：取Ｏ．２５９胰蛋白酶溶于近１００１ｎＬＰＢＳ缓冲液，充分溶解，用Ｏ．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调ｐＨ至８．Ｏ，ＰＢＳ缓冲液定容至１００ｍＬ，正压过滤除菌。

四甲基偶氮唑盐（３一（４，５－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｚ０１）一２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅ一仃讹ｏｌｉ啪ｂｒｏ耐ｄｅ，ＭＴＴ）：ＳｉｇＩｎａ公司产品，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，Ｏ．０１ｍ０１／Ｌ，ｐＨ７．４）配成５ｍ的ｎＬ的ＭＴＴ溶液，正压过滤除菌，分装，４℃避光保存，一星期之内使用。

四种人参三醇组皂苷对小鼠骨髓ＭｓＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究人参皂苷工作液：准确称取一定量的ＧＳ－Ｒｅ、一Ｒ９１、一Ｉ洫ｌ、ｐｐｔ，根据所称取的人参皂苷重量，用相应体积的ＤＭＥＭ液配制成的２５０ｐｍｏｌ／Ｌ的人参皂苷溶液，即为工作液。配制时，用乙醇助溶，先将人参皂苷用一定体积的无水乙醇溶解，再将乙醇溶解的人参皂苷逐滴加入ＤＭＥＭ，工作液中乙醇的浓度１．２５％（体积分数）。配制时室温在２５℃左右，磁力搅拌２０分钟。将工作液过滤除菌，２５℃下贮存备用。

成骨分化诱导液：用含ｌＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液配制，含１０。‘７ｍ０１／Ｌ的地塞米松（储存液１ｍｍｏｌ／Ｌ，无水乙醇配制）、ｌＯｍｍ０１／Ｌ的ｐ一磷酸甘油和５０ｍｇ／Ｌ的抗坏血酸。

成脂分化诱导液：用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液配制，含１０“ｇ／Ｌ的胰岛素（储存液ｌＯＯ“ｇ／Ｌ，生理盐水配制）、１邮∞１／Ｌ的地塞米松（储存液ｌ加ｍｏｌ／Ｌ，无水乙醇配制）、Ｏ．５ｍｍｏｌ／Ｌ的１．甲基．３．异丁基黄嘌呤（储存液５００ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＭＳＯ配制）以及１００岬ｏｌ／Ｌ吲哚美辛（储存液１００ｍｍｏｌ／Ｌ，丙酮配制）。

瑞氏－吉姆萨（ＷＨｇｈｔｅ．Ｇｉｅｍｓａ）染色液：瑞氏粉和吉姆萨粉均为上海试剂总厂第三分厂产品。Ｏ．２９瑞氏粉溶于１２０ｍＬ纯甲醇中制得瑞氏染液，Ｏ．８９吉姆萨粉溶于５０ｍＬ甲醇制得吉姆萨染液。将瑞氏染液与吉姆萨染液按５：ｌ的体积比混合并过滤，即为瑞氏一吉姆萨染液。使用时先加少量染液染色５～８ｎｌｉｎ，再加等量ＰＢＳ混合继续染色５～ｌＯｍｉｎ。

茜素红．嘶ｓ—ＨＣｌ染液：ｌｇ三羟甲基氨基甲烷（而ｓ，鼎国生物技

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术公司）加入ｌＯＯｍＬ三蒸水中，用滴管逐滴加入ＨＣｌ至ＰＨ为８．３左右，配好后加入０．１ｇ茜素红粉（Ａｌｉｚ撕ｎＲｅｄＳ，上海生工生物工程有限公司产品），即为Ｏ．１％茜素红．嘶ｓ．ＨＣｌ染液，用小口塞瓶密封避光保存备用。

油红Ｏ．乙醇染液：将Ｏ．５９油红０粉（国药集团化学试剂有限公司产品）加入１００ｒｎＬ７０％乙醇中，混合后间隔摇动多次，待２４ｈ后形成饱和溶液即可，用小口塞瓶密封至室温中保存备用。

②主要仪器及耗材

超净工作台（苏净集团安泰公司产品）；Ｃ０２培养箱（３１１０，

Ｆｏ彻ａ）；酶标仪（ＥＬｘ８００，ＢＩＯ．ＴＥＫ）；实时荧光定量ＰＣＲ仪（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ公司）；离心机（Ｕｎｉｖｃｒｓａｌ３２Ｒ，德国）；电子分析天平（ＦＡｌ００４型，上海精科天平仪器厂产品）；快速混匀器（ＸＫ９６．Ａ型，江苏新康仪器厂产品）。２５ｃｍ２、７５ｃｍ２塑料培养瓶，１０ｃｍ、６ｃｍ塑料培养皿，２４孔、４８孔、９６孔塑料培养板（Ｃｏｓｔａｒ）。２ｍＬ冻存管（Ｃｏｍｉｎｇ），Ｏ．４５岬和Ｏ．２２岬微孔滤膜（上海兴亚净化材料厂产品），滤器（鼎国生物公司产品）。

１．１．３骨髓单细胞悬液的制备

颈椎脱臼法处死小鼠，依次用络合碘和７５％酒精做手术野及其周围区域的灭菌，无菌条件下分离出小鼠股骨和胫骨，剔除软组织，剪掉骨的两端。用带７号针头的玻璃注射器抽取适量ＤＭＥＭ培养液冲出骨髓，依次用６号、５号和４号针头吸打，制成单细胞悬液，计数。１．１．４骨髓ＭＳＣ的原代和传代培养

四种人参二醇组皂苷对小鼠骨髓ＭＳＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究

骨髓细胞混于２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液，细胞密度５×１０６／ｍＬ，种入７５ｃｍ２培养瓶，每瓶１０ｍＬ，于３５℃、ｌＯ％Ｃ０２、饱和湿度的环境下培养。３ｄ后，取出轻轻振摇后吸出上清液，加入等量２０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液，继续在同样环境条件下培养。此后每３～４ｄ半量换液１次，培养１４～１６ｄ后，至细胞达融合状态，用Ｏ．２５％胰酶消化下细胞，ｌ瓶细胞分种入２瓶，于同样培养体系中传代培养。

１．１．５ＭＳＣ的诱导分化培养

取上述传代培养至第３代的ＭＳＣ，于１２孔培养板中分别进行成骨、成脂谱系的诱导分化培养。培养环境条件同前。

①成骨谱系分化

当ＭＳＣ生长达到亚融合状态（约铺占８０％瓶底）时，吸去孔内培养液，实验组每孔加入１ｍＬ成骨诱导液（ＤＭＥＭ＋ｌＯ％ＦＢＳ＋ｌＯ＿７ｍｏｌ／Ｌ地塞米松＋５０ｍｇ／Ｌ抗坏血酸＋ｌＯｍｍ０１／Ｌｐ一磷酸甘油），对照组加入等体积的ｌＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ。每３ｄ半量换液一次，连续培养３ｗ。吸弃培养液，ＰＢＳ洗３遍，用９５％的乙醇固定细胞１０ｍｉｎ，用蒸馏水洗３遍，用Ｏ．１％茜素红．嘶ｓ．ＨＣｌ染液室温染色３０ｍｉｎ，轻缓流水冲洗，晾干。显微镜下观察和拍照。

②成脂谱系分化

如上所述，当ＭＳＣ生长达到亚融合状态时，吸去孔内培养液，实验组每孔加入１ｍＬ成脂诱导液（ＤＭＥＭ＋ｌＯ％ＦＢＳ＋ｌ“ｍｏｌ／Ｌ地塞米松＋Ｏ．５％ｍｍｏｌ／Ｌ１．甲基．３．异丁基黄嘌呤＋１００ｍ０１／Ｌ吲哚美辛＋ｌＯ“ｇ／Ｌ胰岛素），对照组加入等体积的ｌＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ。每３ｄ

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