RNA干扰技术及其在医学研究中的应用.pdf

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"专题评述"

!"#干扰技术及其在医学研究中的应用

贾!放!!刘长梅"!张义正!

!#四川大学生命科学学院!成都$!%%$&""#中国科学院微生物研究所!北京!%%%’%

摘要!!9是指生物体内利用双链9诱导同源靶基因的,9":;干扰!9:;.:;!<49:;":;特异性

降解#从而导致转录后基因沉默的现象#9:;.主要通过核酸酶=.8>?切割<49:;生成"!$"*2@的小干扰9#继而由4:;!4.9:;".9:;识别并靶向降解同源靶基因,9:;#从而抑制靶基因的蛋白表达#近年来#9:;.技术在医学研究中的广泛应用均取得了显著的基因沉默效果#9:;.以其高特异性%高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段#文中综述了该技术在医学研究中的应用#关键词!!!"#干扰!小干扰!"#!基因沉默!疾病是由双链9%:;干扰$9:;.:;介导的特异!!9

!’

同源靶基因转录后沉默的过程&#9:;.可以通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链9:;!诱导内源靶基因,9:;降解!达到阻止基因表达的目的!所以9:;.可以作为一种简单(有效的可代替基因敲除技术来抑制特定基因表达的有力遗传工具#9:;.技术作为新兴的基因阻断技术具有明显优势!它具有高度特异性!靶基因中一个

&’碱基的改变就会使9:;.效率大幅下降"!因此它

$&$!’%!"#分子的设计

针对靶基因不同位点所设计的4.9:;在诱导9:;干扰中的作用效力不同!所以靶基因位点的选择非常重要#对哺乳动物细胞!其靶基因同时满足以下序列特征的4.9:;可诱导高效的基因沉

’*

#反义链的()默&末端具;末端具D"正义链的(CC

)))末端!EF"在反义链(*处至少有(个;D碱C基"所设计的4).9:;!其毗连的EF碱基的长度不能超过A2@#为避免4.9:;序列与非靶标,9:;序列同源而导致非靶标基因沉默的脱靶效应$511)

&&!(’

%!应对所设计的4@-?>@>11>8@4.9:;进行序列3

可以使等位基因特异性沉默"它的高效性可使靶基因表达的蛋白量下降A%B以上#它比反义核酸技术有效!比基因敲除技术简单!已经迅速广泛地应用到基因功能研究(基因表达调控机制和抗病毒感染等热门领域!并为基因治疗开辟了全新的途径#

同源性分析!确保其与相应的基因组数据库中基因编码序列的连续配对碱基不超过!%个#E724-/74等已经建立了线虫$!"#$#&’(%的9:;.=G%

$"#)))%!并详9:;.=-@-H-4>6@@JJJ#?2-.#5?I3细提供了实验方法和9:;.的表型图谱参考价值#

$&(!’%!"#分子的制备

用于9:;.的4.9:;可以是<49:;!也可以

&(’

$!!"#%技术

9:;.技术是决定9:;.效率的关键因素#

9:;.的主要技术包括#设计小干扰9:;$4.9:;%分子!体外或体内制备4.9:;分子!4.9:;转染细胞或个体!检测4.9:;诱导基因沉默的效果#

%%()%&)!*收稿!"%%()%$)%’收修改稿!"

#),-./567#85,.-1-2"$*!4!+03

!具重要

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!第

%是单链茎环结构的短发夹状9#制备:;$469:;44.9:;的方法包括化学合成法(体外转录法(4.9):;表达载体转录法和4.9:;表达盒等#

化学合成法最方便!但体外合成4.9:;的成本较高!而且在体内表达时间短暂#它最适用的情况是在已经找到最有效的4.9:;序列后而需要大量合成4.9:;进行研究时#

无需先克隆到载体中#因此!P+F4是筛选4.9:;的最简单有效的工具!可作为构建高效的体内转录载体进行9:;.研究的预实验#如果在QF9两端添加酶切位点!那么通过P+F4筛选出的最有效的4.9:;后!可以直接克隆到载体中构建4.9:;表

达载体#这个方法的主要缺点是QF9产物比较难转染到细胞中!不能进行序列测定!QF9和=:;体外转录法是利用双链复合体$<>I/7K>4%体外直接转录出特异双链4.9:;!此法费用低!毒性小!稳定性好!效率高!主要适用于筛选4.9:;!尤其当需要制备多种4.9:;或化学合成的价格太高时可选用此法#如果研究对象不是哺乳动物细胞!可用9:-4>LLL$或=.8>?%把"%%*!%%%碱基的靶,9:;模板在体外消化!得到一份有各种4.9:;4

+混合鸡尾酒,$4.9:;858M@-./4

%&$’来直接转染细胞#此法相对经济!基因沉默效率高!可以跳过检测和筛选有效4.9:;序列的步骤!为研究人员节省时间和费用#但此法特异性不强!无法确知有效靶片段!还有可能引发非特异的基因沉默#

4.9:;表达载体转录法是把转录4.9:;的靶

:;克隆入含有D$或N!启动子的表达载体!导入受体细胞中!经细胞内转录后持久和稳定地表达.9:;#带有抗生素抗性标记的4.9:;表达载体可用于长期抑制研究!通过抗性辅助筛选!该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达至数周甚至更长久#4.9:;病毒表达系统$逆转录病毒(腺病毒和慢病毒等%不但可以在可分裂细胞中表达!并且可以在不发生分裂的细胞及原代细胞中表达!大大提高4.9:;表达载体对宿主细胞的侵染性!彻底克服某些细胞转录效率低的障碍!是实现哺乳动物细胞

.9:;4瞬时表达与稳定表达的理想工具&O!’’#最近新推出的带荧光标记的表达载体!可以使我们通过

荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率!并可通过荧光显微镜观察含有469);的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞#总之!此法克服了体外合成4.9:;成本较高!不稳定!体内表达短暂并受到转染技术和效率的影响等不足!使9:;.技术真正成为可被广泛采用的有力工具#

4.9:;表达盒$P+F4%是一种由QF9得到的.9:;表达模板!它能够直接导入细胞进行表达而

合成时可能产生的误读不能被发现!从而导致结果不理想#

总之!以上4.9:;合成法各有优缺点!适合不同的研究需求#应根据具体实验目的选择合适的方法#

$&)!转染细胞和个体的方法

高效地将4.9:;4转入细胞和个体内是成功抑制基因表达的关键步骤#针对不同的研究目的和对象可以选择不同的<49:;的导入方法#对于多种真核生物细胞!常用基于脂质体技术的转染试剂进行转染"简单生物如单细胞生物等!可选用电穿孔的方法"较复杂生物如线虫可采用肠道或假体腔注射的方法以及喂食其质粒含<49:;的大肠杆菌$)"*+$,%(将虫卵浸泡于<49:;溶液中等方法"对模式生物果蝇$-.+(+/0,$&%来说!可通过注射<49:;入幼虫体内!或使果蝇组织培养细胞直接从混合有<49:;培养基中吸收<49:;!或者在特定组织进行转基因"对于小鼠!多采用静脉或腹腔注射(尾部注射(肌肉注射等将构建的可以表达4.9:;的质粒直接注入小鼠体内

&A!!%

’#R-@47<-等用电穿孔法

将质粒转染啮齿动物也获成功&!!’

#$&*!分析!"#%的效果

9:;干扰作用的检测可根据不同的实验目的!从多个水平全方位(多层次进行检测#整体水平上可测定生物表征(组织器官的结构(细胞的代谢过程(生理生化系数等表型参数的改变"表达水平上可通过S>4@>?2杂交!酶联免疫吸咐实验+TLP;!免疫荧光检测等检测蛋白含量变化"转录水平上可以采用9U)QF9!定量QF9!或:5?@6>?2杂交等通过信号强弱判断目的基因的沉默效果#

总之!9:;.实验成功与否!与以上每个过程密切相关#随着9:;.分子机制研究的不断深入!9:;.应用领域的不断扩大!9:;.的方法得到不断=44:4

!第

!"’*

改进和完善!新的9:;.试剂盒层出不穷!将使

9:;.的效率更高!操作更简单!使9:;.技术会具有更广阔的应用前景#

疾病较难治愈!是威胁人类健康的主要因素#9:;.为抗病毒研究提供了一条重要的全新的策略#

目前!人们主要用9:;.技术抑制病毒蛋白表达(阻止病毒入侵及复制等!并在艾滋病病毒$(NLX%

&’A!!&!!(

(丙型肝炎病毒乙型肝炎病毒$NGX%

&’&’!$!O

$(人乳头瘤病毒$(流感病NFX%NQX%!’!!A’

(和脊髓灰质炎病毒(P毒&;9P相关的冠状病&’"%’"!

毒$等的研究中!呼吸道合疱病毒&P;9P)F5X%

(!!"#%在医学研究中的应用

(&$!!"#%与基因功能研究

9:;.是一种有效(快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段!它可以通过对某些关键基因的:;.来确定基因的功能#例如!U74.9:;实验组将体外构建的4.9:;分别导入人类宫颈癌细胞(大鼠成纤维细胞和小鼠细胞!分别抑制了哺乳动物的"!个不同类型基因!均获得成功!并重新界定了部分必需基因和非必需基因#现在人们把9:;.技术与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合!用.9:;在基因组水平上筛选成百甚至上千基因!在基因组学功能研究中发挥着越来越大的作用!其应用前景不亚于QF9技术#例如!人们选取果蝇基因组中的(’&A个基因分别作为模板!用包含UO启动子的序列作为通用引物!通过QF9进行体外转录形成<49:;!对胚胎进行微注射并进行抗体和免疫组织化学分析!从而在基因组中筛选出果蝇心源性基因

&!"’

#再如!V6>23等不但应用9

:;.研究了哺乳动物细胞中某些关键基因的作用!还探索了

.9:;在基因组水平上的筛选方法#他们从人类基

因文库中选出’%%%个靶基因!每个基因设计两个靶序列!应用I=7-/4.9:;表达系统产生4.9:;表达盒并构建4.9:;表达框文库!通过它来高通量筛选:WMG信号途径中已知的及未知的特有基

因&!*

’!从而为疾病治疗提供有用信息#&(!!"#%与基因治疗

9:;.可用于抑制体内过度表达的基因!也可用于抑制病毒或寄生病原性蛋白的表达!更甚的是有希望抑制某些癌基因或突变基因的表达#尽管到目前为止4.9:;还未用于临床来治疗人类疾病!但大量的理论研究表明!9:;.是基因沉默疗法的理想工具#其总体思路是通过加强关键基因的9:;.机制!控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达#

&(&$!!"#%与病毒感染的抑制!病毒感染引起的

取得很多进展#

应用9:;.抗病毒感染的一个策略是抑制病毒入侵宿主细胞#利用4.9:;!以宿主细胞内的病毒受体或其协同受体,9:;为靶目标!抑制受体蛋

白的表达!从而抑制病毒的入侵或病毒基因的表达!抵抗病毒感染#例如!F=&!FF9(!FYF9&等分子是细胞上NLX致感染重要的受体和协同受

体#利用4.9:;靶向F=&&""’!FF9(&"*’!FY)

F9&&"&’

等的,9:;!可以有效阻断这些细胞表面蛋

白的表达!从而有效阻止NLX进入细胞#一些对

于病毒生活周期必须但对于细胞存活非必须的宿主基因!例如U43

!%!是对于NLX)!子代的运输和出芽必须的宿主因子!也可作为9:;.的可选靶

标&"(’#

另一个策略是利用小干扰9:;$4.9:;%!靶向参与病毒复制(包装等并且相对保守的病毒结构基因或调控基因!从而封闭或抑制病毒基因的某些保守序列发挥功能#在NLX中!一些特殊的基因如

1&%!2+$!3,4及一些小调控蛋白如U

-@!9>Z等已经被成功抑制&""!"$’#V6-23等

&"%’

设计了由质粒载体介导的靶向P;9P)F5X9:;多聚酶基因的

.9:;!此4.9:;的表达有效地抑制了病毒复制!表明把此4.9:;作为抗P;9P药物的可行性#[-)

I

-<.-&"O’

等利用9:;.技术!设计4.9:;靶向丙型肝炎病毒$NFX%基因组!证明4.9:;可以抑制病毒的复制并阻止病毒的入侵#E>等&"

’’也证明靶向流感病毒基因的4.9:;可以降低和抑制病毒的复制和转录#

&(&(!!"#%与抗肿瘤治疗!根据肿瘤形成和发展的不同机制!9:;.已经在肿瘤学领域的各个方面得到应用#多种癌基因可以作为靶点设计相对应的.9:;!包括显性突变癌基因(增强型癌基因(融

944((4(4

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"A’*%’合型癌基因&和病毒癌基因&#例如#P86>??’&!’"A等&和S设计特殊的4!以R*./<-等*.9:;4

))GF9;GT的融合处作为靶位点!封闭了GF9

载体来转送以转基因小鼠过度表达的人P]=!突变株为靶标的4.9:;!并把此载体注射进突变小鼠的重要肌肉如保证呼吸的膈肌(保证进食的颜面肌(保证行走以获得食物的腿肌或者腰椎内!发现;TP症状发作延迟!症状减轻!神经肌肉功能和运动神经元的生存等得以改善!证实这种载体转送9:;

干扰的方法有效#如果用于人类!治疗的肌肉范围可能更广#该技术也有益于其他与中毒性功能获得;GT融合癌蛋白的表达!为白血病的治疗提供理论

&"’

依据#有人以凋亡抑制子G为48/)"*.9:;的靶标!抑制G8/)"的表达!从而促使癌细胞凋亡#QT[!是重要的细胞周期调节子!它在多种人类肿瘤中过度表达#用带有D$启动子的质粒表达靶向T[!基因的469:;!成功抑制了QT[!的表

达&

**

’!致使癌细胞凋亡#另外!在癌症治疗中!9:;.也被用来提高化疗和放疗的效果#例如5-67基因编码的Q)

糖蛋白的过度表达会导致化疗的药物从肿瘤中泵出#-3

7>等&*&’

已经用稳定整合的可表达469:;的质粒证明R=9!可作为用4.9:;治疗癌症的靶标#>23等

&*(’用4.9:;靶向2.89*基因!发现在一定剂量区!细胞的放射敏感性增强#这些研究为治疗癌症提供了有意义的途径#

癌细胞的入侵和转移在癌症发展中起重要作用#在人类肝细胞癌$NFF%中7)Q;的表达水平与

病人的生存成负相关#P-/Z.等&*$’

用靶向7)Q;的

.9:;转染高水平表达7)Q;的细胞!这些细胞的

转移(入侵和增殖明显减慢#T.I485,H等&*O’

用:;.技术抑制了.2@>3?.2$"$#&%介导的乳腺癌细胞的入侵和转移#

总之!人们已经从很多方面对应用9:;.技术治疗癌症进行了有益的探索!并取得令人鼓舞的成果#因此基于9:;.技术的抗肿瘤基因治疗开发潜力巨大#

&(&)!!"#%与神经退行性疾病!9:;.技术亦被应用于神经退行性疾病等遗传病和其他疾病的治

疗#例如Y.-等&*’’

构建了腺相关病毒$;;X%

载体!可表达靶向突变的&:&;,’<!基因的469:;#把此载体注射入由于&:&;,’<!基因的突变导致小脑共济失调$PF;!%的鼠模型的小脑中!显著改善了PF;!小鼠的动作协调性并有助于恢复小脑形态#另据近期-自然医学.杂志$:-@7?>R><.8.2>%上的两项报告!使用4.9:;来抑制突变型超氧化物歧化酶$P]=!%延迟了肌萎缩侧索硬化症$;TP%

小鼠模型的发作和进展#9-57/和9-/I

6等&!%!*A’

使用慢病毒有关的神经变性疾病!如"共核蛋白引起的遗传型-?M.2452病或N72@.23

@52病等的治疗#&)!!"#%与信号传导通路

9:;.技术可用于确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系!将成为研究细胞信号传导通路和描绘更全面的细胞内部工作机制的新途径#

/>,>24等&&%’

应用9:;.研究了果蝇细胞系中胰岛

素信息传导途径!并在此基础上分析了=PN*QY!

与=;F[之间的关系!证实了=;F[是位于

PN*QY!磷酸化的上游激酶#T7,等&&!’

用9:;.技术!把双链4.9:;转染果蝇细胞!通过系统地抑制特异9:;分子!然后激活果蝇的一个关键的细胞信号传导级联反应***N><3>653通路!判断是否会引起与异常N><3>653通路信号传导有关的细

胞或解剖学缺陷!从而查明一个基因是否是该通路执行功能所必需的#研究人员筛查了与果蝇N><3>)53通路有关的(O%%个基因!发现了&个N><3>)53基因新成员!其中!个基因可能是正常情况下阻断N><3>653通路在人体中的活性的肿瘤抑制基因#此项研究有助于查明N><3>653通路是如何引导胚胎发育(如何引起癌症的#

!展望

9:;.一经发现!立即成为科学研究的一大热

点!它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人#本实验室将9:;.技术与逆转录病毒载体相结合!建立了一种逆转录病毒载体介导的能将.9:;表达盒稳定整合于细胞基因组的9:;干扰系统!此系统含有真核筛选标记!表达针对NGX基因组的4.9:;#本载体系统可以实现4.9:;在细胞和动物水平的稳定表达和对靶基因的长期抑制!有望成为对NGX进行基因治疗的有效方法

Q(FQ\Q=6649()4

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$未发表%#9:;.技术在基因治疗中应用前景广阔#如果通过可诱导系统来调控9:;.效率将更有临床实用意义#研究者建立了四环素$和强%@>@?-88/.2>^

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%力霉素$可诱导9和蜕皮激8<5K8/.2>:;.系统&^^

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个F9+融合酶诱导型9:;.系统!这些研究拓宽了9:;.技术的实际应用范围#

虽然已被广泛应用到不同种生物!但仍素诱导的9:;.系统

&’&*&&&’

9:;.然有许多问题有待我们进一步阐明#例如!9:;.具体分子机制研究!9:;.机制本身受哪些因子调控!不同种生物是否沿用同一种9:;.机制!:;.生物功能研究等#另外!9:;.虽然用于抗病毒和肿瘤方面的研究成果很丰富!但目前多限于体外研究#如何安全有效地将4.9:;导入人体!使.9:;表达定位于靶器官或靶细胞!从而特异治疗某些疾病仍是4.9:;基因治疗中亟待突破的问题#

参!考!文!献

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