微生物初级考试细菌部分

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霍乱弧菌（肠道菌疾病检验—肠道属）

1．概述 ：（1） 霍乱是急性肠道传染病，剧烈的无痛性水样腹泻 （2）霍乱主要由01群的古典型和El Tor型以及()139群菌株引起。

（3）()1群称凝集弧菌，非()1群为不凝集弧菌。()1群依菌体中主要抗原成分A、B、C组分分为不同亚群。各称为小川型(含A、B抗原)、稻叶型（含A、C抗原）和彦岛型(含A、B、C抗原)。

（4）()139群最早出现于1992年东南亚。①0139群和()1群El To()抗原不同；②有相同的霍乱毒素基因，对()抗原的免疫血清两者无交叉凝集，o139独特特点是：有荚膜多糖，国际标准株为M045。

霍乱弧菌不侵入上皮细胞，在人的小肠内定居、增殖，释放霍乱毒素。霍乱毒素为A、B两种亚基组成，每个毒素分子A：B数量比为1：5，A又分为A1和A2，毒素酶活性部分在A1亚单位。霍乱毒素通过其B亚单位与人小肠上皮细胞上的GMl受体结合，用GMl—ELISA（酶联免疫吸附实验）可检测霍乱

毒素存在。

兔小肠段结扎试验也可用来检测霍乱弧菌是否产生霍乱毒素。霍乱弧菌引起的肠道局部黏膜免疫是霍乱保护性免疫的基础。针对菌体产生的抗菌免疫以及针对霍乱毒素的抗毒免疫是对霍乱免疫的因素。 2．分离培养与鉴定

显微镜下呈逗点状或弧形，经人工培养传代后，镜下观察呈类似大肠杆菌的杆状。

庆大霉素琼脂、4号琼脂培养基为强选择性培养基，碱性琼脂、碱性胆盐琼脂等为弱选择性培养基。

在庆大霉素琼脂平皿上的菌落形态：带灰色、半透明、圆形扁平稍隆起、菌落边缘湿润。

河水、池塘水等外环境水进行霍乱弧菌分离，采集33．3cm以内的表层水，先用lmol/L 的Na()H将水样pH值调整到8.4—9.2。碱性蛋白胨水37℃增菌6—8小时后，霍乱弧菌在培养液的上层增殖最多。 碱性蛋白胨水可用作霍乱弧菌的运输保存培养基。

V—P试验和第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验可作为区分()1群古典型与El Tor型菌株的参考指标。

对0139群霍乱弧菌，则可用特异的诊断血清。 3．（噬菌体型为1～6且生物型为a至f的为流行株）

对于霍乱弧菌流行株与非流行株的噬菌体—生物分型试验，最少用两平皿两试管来完成。

区分流行株与非流行株的溶血试验中所用的红细胞为绵羊红细胞。 溶原性测定试验中用双层琼脂法，其中上层半固体琼脂的浓度为o.7％。 山梨醇发酵实验，接种pH8．0的山梨醇发酵管后37℃培养3小时。流行株对山梨醇为慢发酵。

生化反应：分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、产酸不产气。迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖。氧化酶、明胶酶试验和ONA酶试验均阳性。产生靛基质，霍乱红反应（即亚硝基靛基质试验）阳性。

(二)副溶血弧菌检验

嗜盐性弧菌 ，已确定有12种不同的()抗原和约60种不同的K抗原。 致病菌株能产生的耐热直接溶血素和不耐热溶血素是副溶血弧菌的主要致病物质。

检验方法：（1）标本采集：患者的粪便、可疑食物。

（2）分离培养：称取样品25g，加225ml 3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐再菌选择性琼脂平板各1个，同时取10ml，加入100 ml增菌液中（40g/LNaCl），放37℃8～16小时培养后，进行平板分离，于37 ℃18—24小时培养后取出观察。

（3）挑取上述可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24小时观察结果。

（4）涂片镜检：将三糖铁培养基反应可疑者(底层变黄，葡萄糖产酸不产气，斜面不变，乳糖蔗糖不分解，有动力，不产生硫化氢)进行涂片革兰染色镜检形态。 ①形态染色：革兰阴性杆菌，随培养基不同菌体形态差异较大，多种形态。两极浓染。菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽孢、无荚膜。

②培养特性：营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。最适浓度为35g/LNaCl，生长所需 PH 7.0～9.5，最适 PH 7.7。需氧，在液体培养基表面形成菌膜。在厌氧环境下生长较慢。

①在35g/LNaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；

②在副溶血弧菌专用选择培养基上形成1~2.5mm，稍隆起、浑浊、无粘性、绿色菌落；

③在SS平板上不生长或长出1~2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。

④在羊血琼脂平板上，形成2~3mm圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株形成β溶血或α溶血

⑤在TCBS琼脂（副溶血弧菌专用选择培养基）上不发酵蔗糖，菌落绿色。 ③生化反应：所有用于该菌的生化反应（副溶血弧菌）培养基需加入30g/LNaCl。 本菌（副溶血弧菌）在70g/LNaCl培养基生长，在无盐或10%NaCl以上培养基不生长。能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖；靛基质，甲基红试验阳，V-P、H2S、尿素酶试验阴性；致病菌株能使人或兔红

细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。

动物试验 将上述各类反应的副溶血性弧菌接种3.5％氯化钠胨水，经37℃16～18小时培养后，小鼠腹腔注射0.3ml，观察2～3天，将死亡小鼠进行解剖并做分离培养。

预防原则 水产品及盐渍品等应煮熟后食用。可用复方新若明、庆大霉素、氟哌酸等抗菌药物治疗。

拟态弧菌 “拟态弧菌与霍乱弧菌相似——形态学、培养特性、抗原结构” 引起胃肠炎和某些肠外感染。但对01群霍乱弧菌标准诊断血清不凝集，可与霍乱弧菌相鉴别。另外拟态弧菌与霍乱弧菌生化特性上最重要的区别在于拟态弧菌不发酵蔗糖（霍乱弧菌发酵蔗糖）。

V-P试验、酒石酸盐及对多粘菌素B的耐药性等也可作为区别这两种弧菌的参考试验。

三、肠致泻性大肠埃希菌

人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。革兰阴性短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原(O抗原)、包膜抗原(K抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。

临床表现为：旅游者腹泻或食物中毒。新生儿病房及托幼机构可引起交叉感染而发生流行。

根据发病机制、临床表现、流行病学特征、()抗原血清型及细菌的毒力测定可将致腹泻性大肠杆菌分为5类：

①肠致病性大肠杆菌EPEC的主要毒力因子有菌毛、志贺样毒素(SLTs)和LEE毒力岛。

②肠产毒性大肠杆菌ETEC的主要毒力因子为热不稳定毒素、热稳定毒素及与致病性相关的定居因子。

③肠侵袭性大肠杆菌EIEC在毒力因子和致病机制上与志贺菌基本一致。 ④肠出血性大肠杆菌EHEC的主要毒力因子有志贺样毒素(SLTs)、溶血素、LEE毒力岛及其他未知的毒力因素。

⑤肠集聚性粘附大肠杆菌(EAggEC)是一类新发现的致泻性大肠杆菌，目前已知的毒力因子有菌毛和热稳定肠毒素。主要与小儿顽固性腹泻有关。

4．鉴别诊断

EPEC引起肠炎鉴别诊断：①痢疾②沙门菌肠炎③空肠弯曲菌肠炎④病毒性肠炎⑤幼儿急疹等。

ETEC：主要①霍乱，其次②病毒性肠炎③沙门菌肠炎。

EIEC：细菌性痢疾，确定诊断：EIEC血清凝集试验阳性及大便培养所得的大肠杆菌作豚鼠角膜试验阳性。

致泻大肠埃希菌检验 一、增 菌

样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。 无菌称取检样25g，加在225ml营养肉汤中，以均质器打碎1分钟或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，测定大肠菌群MPN，其余的移人500ml广口瓶内，于36℃土1℃培养6小时。挑取l环，接种于1管30ml肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18小时。 二、分 离

将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36℃±1℃培养18～24小时，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 三、生化试验

1、自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。

同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7．2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。

2．TSI（三糖铁琼脂）斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希菌。底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任意一项为阳性的培养物，均非大肠埃希菌。必要时做氧化酶试验和革兰染色。 四、血清学试验 假定试验+证实试验 四、沙门菌属 (一)病原学：

寄生人类和动物肠道中，生化反应和抗原构造相似的革兰阴性杆菌。目前至少有67种()抗原和2000个以上的血清型，仅少数对人致病①肠热症的伤寒②副伤寒③甲和乙沙门菌

其他对动物致病，偶可传染给人，引起食物中毒或败血症，如①鼠伤寒沙门菌（最常见）、②肠炎沙门菌、③鸭沙门菌、④猪沙门菌等

沙门菌属除鸡沙门菌和雏沙门菌，都有周身鞭毛。一般无荚膜。营养要求不高，在普通平板上形成中等大小、五色半透明的S型菌落。

沙门菌属不发酵乳糖或蔗糖。大多产生硫化氢。对葡萄糖、麦芽糖和甘露醇发酵，除伤寒沙门菌产酸不产气外，其他沙门菌均产酸产气。

IMViC○1伤寒沙门菌(一十一一)、○2甲型副伤寒沙门菌(一十一一)、○3乙型副伤寒沙门菌(一十一V)和○4鼠伤寒沙门菌(一十一V)。生化检验主要用于菌属鉴别。 伤寒沙门菌与大肠埃希菌在糖发酵方面的主要差别之一在于伤寒沙门菌不分解乳糖。

对沙门菌的选择分离培养可用SS琼脂，在SS琼脂上其菌落呈现微黄色或无色。 在发病早期(一般l周内)可从血液中分离，此时从血液中的分离率最高；l周后粪便或尿中，发病第3周时粪便标本病原分离率最高；骨髓培养是细菌学确诊的最好方法，在发病第1周时也较高，检出率可达到90％以上。胆汁标本也可以进行分离。

沙门菌属具有分类诊断意义的3类抗原：○1O抗原、○2H抗原和○3K抗原，另外K抗原又有两种，即○1Vi抗原和○2M抗原 O抗原系耐热性菌体抗原，由多糖—磷脂复合物组成；H抗原系不耐热抗原，存在于鞭毛中，由鞭毛素组成；K抗原存在于荚膜或被膜中，其中Vi抗原是覆盖在细菌细胞壁LPS（脂多糖）外的荚膜多糖抗原。伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌具有Vi抗原。

沙门菌的抗原变异，对菌型诊断及在制备菌苗上有重要意义，变异的类型○1H—O、○2S-R、○3V-W变异和位相变异。

肥达试验为用已知的伤寒沙门菌O、H和甲、乙型副伤寒沙门菌H抗原与不同稀释度的待检血清作定量凝集试验，根据抗体的含量和动态变化以辅助临床诊断伤寒病原菌的一种血清学试验。在病起的第2周，血清中抗体就可有较明显增多，恢复期达到高峰。

一般()凝集价≥l：80，H凝集价≥l：160时才有诊断价值，有时单次效价增高不

能定论，病程中应逐周复查，若效价依次递增或恢复期效价增加≥4才有意义。IgM类O抗体出现较早，持续约半年，消失后不易受伤寒等病原菌的非特异性抗原刺激而重新出现。IgG类H抗体出现较晚，维持时间长达数年，消失后易受非特异性抗原刺激而能短暂重现。因此若O、H凝集效价均超过正常值，则伤寒或副伤寒感染的可能性大；如两者均低，则患伤寒的可能性甚小；若O不高H高，可能是预防接种或非特异性回忆反应；如O高H不高，可能是感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌(如肠炎沙门菌)。少数病例，在整个病程中，肥达试验始终在正常范围内，可能是早期使用大量抗生素，或患者免疫功能低下等因素。

预防 “三管一灭’’(管水、管食物、管粪便和消灭苍蝇)，防止水源和食品污染。伤寒疫苗为Vi疫苗。 （五）实验室：沙门菌检验

1、前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。

2、分离 取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE、WS、LS)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。36℃±1 ，18～24小时(DHL、HE、WS、SS)或40—48小时(BS)，观察各个平板上生长的菌落特征。 3、生化试验

（1）．自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果不同。

○1在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H2S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门菌的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。

（2）、在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于361℃±1培养18～24小时，必要时可延长至48小时，按表7—3判定结果。（看结果在后面） 4、血清学分型鉴定

（1）抗原的准备 一般采用1.5％琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 （3）H抗原的鉴定 位相变异试验方法如下： (1)小玻管法：(2)小倒管法、简

易平板法

(4)Vi抗原的鉴定：用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：①伤寒沙门菌，②丙型副伤寒沙门菌，③都柏林沙门菌。

五、志贺菌属 (一)病原学

志贺菌为肠杆菌科志贺菌属，革兰阴性，需氧，无鞭毛、不能运动，引起细菌性痢疾。

根据抗原结构的不同，分为A、B、C、D四群，其中A群为痢疾志贺菌，B群为福氏志贺菌，C群为鲍氏志贺菌，D群为宋内志贺菌。

志贺菌的主要毒力因素包括：○1其表面结构脂多糖、○2细菌侵袭性以及○3分泌的志贺毒素。

志贺毒素由A和B亚单位组成，A亚单位是毒素的活性部位，能抑制蛋白合成。 志贺菌A群Ⅰ型产生的志贺毒素具有○1神经毒、○2细胞毒和○3肠毒性。目前已知各群志贺菌的侵袭相关基因都位于质粒上。

志贺菌在普通琼脂平板上生长形成中等大小、半透明的光滑型菌落(D群的宋内志贺菌：培养中常出现扁平的粗糙型菌落)。

其O抗原为群特异性抗原，K抗原为型特异型抗原，分解葡萄糖，产酸不产气，不分解乳糖。

（总结 志贺菌：革兰阴性，需氧，无鞭毛、不能运动、分解葡萄糖，产酸不产气，不分解乳糖，在普通琼脂平板上生长形成中等大小、半透明的光滑型菌落，D群的宋内志贺菌：培养中常出现扁平的粗糙型菌落） (二)流行病学

志贺菌菌型较多，菌群分布随国家、地区、年份的不同而有不同，基本上发展中国家以A、B、C群多见，而发达国家以D群感染为主。

目前在我国以B群福氏志贺菌为多，其次是D群。患者和带菌者是传染源，病菌随患者或带菌者粪便排出，通过污染食物、水、生活接触或借苍蝇传播等，使易感的接触者发病。人对志贺菌较易感，10～200个细菌就可使10％～50％志愿者致病。志贺菌痢疾（A群为痢疾志贺菌）在中国全年均有发生，以夏秋两季多

见。

志贺菌感染的一些特点包括：（A群）痢疾志贺菌感染患者病情较重，（D群的）宋内志贺菌多引起轻型感染，（B群）福氏志贺菌感染易转变为慢性；急性中毒性菌痢以小儿多见；感染后免疫期短。 (三)病原分离

取新鲜粪便粘液或脓血部分接种于SS琼脂选择培养基上，并按常规鉴定菌群与菌型。注意在三糖铁培养基上，痢疾志贺菌与伤寒沙门菌的表现相似。需要增菌时，如自可疑食品中进行分离，可先用GN增菌液增菌，提高检出率。 (四)诊断标准

细菌性痢疾的（志贺菌）诊断原则为依据流行病学史、症状、体征及实验室检查进行综合诊断，确诊则需依赖于病原学检查。

志贺菌根据症状体征可诊断为○1急性非典型菌痢、○2急性典型菌痢、○3急性中毒型菌痢和○4慢性菌痢。

志贺菌感染病程在2个月以上属慢性。 (五)防治原则

1．预防：应以切断传播途径为主，同时加强对传染源管理的综合性防治措施。对重点人群、集体单位应特别注意预防暴发或流行。

2．治疗：一般对症治疗中注意进易消化饮食，注意水电解质平衡，可给口服补液盐(()RS)，必要时()RS（口服补液盐）和静脉输液同时应用。病原治疗中，细菌性痢疾可以是自限性的，一般情况下可以不使用抗生素。对症状比较严重的患者，抗生素治疗可缩短病程、减轻病情和缩短排菌期。对休克型菌痢进行抗感染、抗休克处理。对脑型菌痢需抗感染、防治脑水肿和呼吸衰竭。 （六）实验室志贺菌检验 1、增菌

称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500ml广口瓶内，固体食品用均质器以8000～10000转／分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8小时。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2、分离和初步生化试验

（1）、取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取l环

划线接种子麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个（弱选择性分离培养基），于36℃培养18～24小时，志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

（总结：志贺菌在HE琼脂平板或SS琼脂平板：麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板（志贺菌）在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落）。 （2）、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24小时，分别观察结果。 （3）、下述培养物可以弃去。

○1在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物。

○2在18～24小时内发酵乳糖、蔗糖的培养物。（因为志贺菌不发酵乳糖、蔗糖的培养物）

○3不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物。（因为志贺菌分解葡萄糖和不能只生长在半固体表面的培养物）

○4产气的培养物。（因为志贺菌产酸不产气）

○5有动力的培养物。（因为志贺菌无鞭毛、不能运动所以无动力的培养物） ○6产生硫化氢的培养物。（因为志贺菌不产生硫化氢的培养物）

（4）凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。

3、血清学分型和进一步的生化试验 （1）、血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。

如系B群福氏志贺菌，则用群和型因子血清分别检查。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。

4种志贺菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。

如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。

（2）进一步的生化试验

在作血清学分型的同时，应作进一步的生化试验，

即：○1葡萄糖铵，○2西蒙柠檬酸盐，○3赖氨酸和○4鸟氨酸脱羧酶，○5pH7.2尿素，○6KCN生长，以及○7水杨苷的分解。

除宋内菌和鲍氏13型为鸟氨酸阳性外，志贺菌属的培养物均为阴性结果。 必要时还应做革兰染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺菌属的培养物。

已判定志贺菌属的培养物，应进一步作5％乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。

3、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。

六、小肠结肠炎耶尔森菌病（肠道菌疾病检验—肠道属）

小肠结肠炎耶尔森菌病是近年来在国际上颇受重视的——种新的传染病，是目前较为常见的腹泻病种之—（是小肠结肠炎耶尔森菌病），

该病在（小肠结肠炎耶尔森菌病）世界范围内均有发现，在中国20世纪80年代有两次大的暴发（是小肠结肠炎耶尔森菌病）。

小肠结肠炎耶尔森菌病除肠道症状外（有肠道症状），还能引起○1消化系统、○2呼吸系统、○3心血管系统、○4骨骼结缔组织等局部组织和全身疾患，极少数情况下可弓[起败血症，有时造成死亡。 (一)病原学

小肠结肠炎耶尔森菌病，是由小肠结肠炎耶尔森菌感染引起的。，与鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌构成了这个属的3个主要致病种

（○1小肠结肠炎耶尔森菌病、○2鼠疫耶尔森菌、○3假结核耶尔森菌），为革兰阴性小杆菌，对营养要求不严格，在0℃～42℃时均可生长，

是肠道致病菌中能在4℃生长的少数细菌之一（○1小肠结肠炎耶尔森菌病、○2鼠疫耶尔森菌、○3假结核耶尔森菌）。

小肠结肠炎耶尔森菌的鉴定主要依靠27种生化反应和动力试验，本病原体在37℃生长时无动力，而在25℃~28℃生长时有动力形成。该病原体常污染多种食

品和水源。 （总结：小肠结肠炎耶尔森菌是由小肠结肠炎耶尔森菌感染引起的，该菌属于肠杆菌科，耶尔森菌属。小肠结肠炎耶尔森菌是 肠道致病菌中能在4℃生长的少数细菌之一，37℃生长时无动力，而在25℃~28℃生长时有动力形成。腹泻病种之—）

小肠结肠炎耶尔森菌有如下特征：

1、抗原：这种病原体有革兰阴性肠杆菌特异性的多糖抗原和肠道菌的共同抗原，小肠结肠炎耶尔森菌血清型是根据脂多糖()抗原确定的。现在国际上常报告的有57个抗原因子，将小肠结肠炎耶尔森菌分成50多个血清型。

2、V、W因子：由质粒编码的抗原，是—种毒力决定因子，也是毒力的标记。小肠结肠炎耶尔森菌在37℃生长时需要钙离子（小肠结肠炎耶尔森菌），而在25℃～28℃生长时不需要钙离子（小肠结肠炎耶尔森菌）。

3、自凝性：小肠结肠炎耶尔森菌在含有10％小牛血清的组织培养液内37℃培养1天，发生自凝，而在25℃则不发生自凝。

目前的研究已证实这种自凝作用是由质粒编码的外膜蛋白A(YOPA)引起的。（YOPA—外膜蛋白A）

4、侵袭性：小肠结肠炎耶尔森菌能侵入肠上皮细胞，并且能侵入到人工培养的Hep-2及Hela细胞内，这种侵入性是由染色体编码的侵袭素所决定的。 目前还发现染色体上有另一基因位点，称作粘附侵袭位点(ail)，编码的—种蛋白质，是介导低水平的粘附侵袭作用。

5、外膜蛋白：小肠结肠炎耶尔森菌都具有一个约60kb的占力质检，编码10多种外膜蛋白(YOPs)，现已证实这些外膜蛋白中的—些与致病密切相关。 有关小肠结肠炎耶尔森菌病原体的研究还在不断深入。 (二) 临床表现：

1、急性肠炎和急性胃肠炎：是小肠结肠炎耶尔森菌病最常见的临床类别，表现为腹泻和发热，病情轻重不一，部分患者伴有腹痛和呕吐。

2．有类似于阑尾炎的症状：有报道在外科手术后的阑尾内容物中分离别小肠结肠炎耶尔森菌。

3、慢性反应性关节炎及结节性红斑：这两种症状（慢性反应性关节炎及结节性红斑）引起的机制可能相似，很有可能都是该菌肠道感染后的迟发型免疫后遗症。目前的研究发现，小肠结肠炎耶尔森菌质粒编码的外膜蛋白A(YopA)是引起关节

炎的关键因素，有学者推测该菌产生的超抗原也是引起这两种症状（慢性反应性关节炎及结节性红斑）另一个原因。

4、耶氏肝炎：前苏联和我国学者都发现该菌感染可引起肝炎，称“耶氏肝炎”。这种病原体引起的与②病毒性肝炎症状相似。区别是前者（①肝炎）高热、抗生素治疗效果显著，然后根据血清学和病原体检测作出进一步诊断。

5、其他： 还有一些少见症状，如败血症等全身性症状。这些症状虽然少见，但死亡率较高。 (三)诊断标准

对小肠结肠炎耶尔森菌病的确诊主要依靠病原体分离及血清学诊断。

在未分离到病原体之前，应根据临床症状(先有发热、腹泻，不久发生咽喉炎、扁桃体炎、颈部淋巴结肿大、关节炎以及结节性红斑等)作出初步诊断。目前还发展了一些分子生物学方法，以利于对该菌的感染作出快速诊断，如PCR技术(聚合酶链反应)，针对于外膜蛋白的单克隆抗体检查技术等。但这些方法推广却受到一定限制。

(四)治疗原则： 一般说来小肠结肠炎耶尔森菌感染症状较轻，主要采取支持疗法，症状很快消失。对于一些严重病例，特别是一些肠外型的感染应及时采用抗生素治疗。链霉素和庆大霉素是临床上常用的药物。（小肠结肠炎耶尔森菌常用的药物是链霉素和庆大霉素）

(五)监测：小肠结肠炎耶尔森菌常存在于一些冷藏食品中，这类感染通常称作“冰箱病”因此食品检验是对该菌最好的监测方法。

(六)控制措施：1．控制传染源：(1)发现和治疗患者，执行隔离制度，以免病菌扩散。(2)在我国，牛、猪等家畜是主要的传染源，加强管理，防止排泄物污染水源和食物。(3)有一些鼠类和昆虫也是携带有对人类致病性的小肠结肠炎耶尔森菌，因此消灭也是防治该病的主要环节。

切断传播途径：(1)加强环境卫生管理。 (2)保护水源。

个人防护：(1)讲究个人卫生，不食不洁食物，防止病从口入。 (2)不喝牛水(水源极易被该菌污染)和未消毒的牛奶。

七、空肠弯曲菌（肠道菌疾病检验—肠道属） (一)病原学：

弯曲菌为革兰阴性菌，为严格的微需氧菌。镜下观察菌细胞末端是尖的，且形态细长，呈弧形、螺旋形或“海鸥展翅”状，一端或两端各有一根鞭毛。(二)流行病学：

弯曲菌为人兽共患病，与人类感染有关的主要是家禽和家畜，也是主要的传染源，患者和带菌者也可以成为传染源。

最常见的传播途径是进食污染的食物和水。人群普遍易感。本病（空肠弯曲菌）的胃肠炎症状表现不一，可由无症状的带菌、轻型腹泻以至严重腹泻，潜伏期为l一10天，多数为3～5天。主要症状有发热、腹泻和腹痛，少数有呕吐等。与细菌性痢疾相似，但病情较轻。

空肠弯曲菌是弯曲菌中最常见的病原菌，感染后可表现为轻微的胃肠炎或重型的小肠结肠炎。

近年报道该菌（空肠弯曲菌）感染与格林巴利综合征的发生密切相关。 (三)病原分离

取新鲜粪便标本或肛拭子插入C—B运送培养基，在24小时内或经增菌后接种于相应抗生素的硫乙醇酸钠培养基（空肠弯曲菌），置42℃、微氧(浓度5％～10％)、高二氧化碳(3％～4％)的条件下培养约48小时。作生化试验和药敏试验以进一步确定细菌种。

蜡样芽胞杆菌检验（形态观察革兰阳性大杆菌有芽胞这是最大的特点）（食品） 一、菌数测定：以无菌操作将检样25g(m1)用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5，的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在2个选择性培养基

——甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置36℃±1℃温箱培养12～20小时后选取适当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色(甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上为粉红色)（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验。根据汁实力蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以其稀释倍数，即得每克(或毫升)样品中所含蜡样芽胞杆菌数，例如MYP（甘露醇卵黄多粘菌素）平板的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，乘以稀释倍数(如104)，再乘以Ig(或m1)检样数(取的是0.1ml样)则为： 25×4／5×104×10＝2×106 二、分离培养

取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）（甘露醇卵黄多粘菌素）上，置37℃培养12～20小时，

挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌落接种于肉汤和营养琼脂作成纯培养，然后作证实试验。

三、证实试验 (一)形态观察

本菌为革兰阳性大杆菌（蜡样芽胞杆菌），宽度在1um或lum以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。 (二)培养特性

◇1本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化；

◇2在普通琼脂平板上生成的菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不齐

(三)生化性状及生化分型

1、生化性状 本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。

2、生化分型 根据蜡样芽胞杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V—P反应、明胶液化性状的试验，将该菌分成不同的型别。 (四)与类似菌鉴别

本菌与其他类似菌(如巨大芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状

芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌等)的鉴别。

五、肠毒素试验(食品)

(一)酶联免疫吸附试验（ELISA）检测LT（双抗体夹心法测抗体）和ST（抗原竞争性测定抗原）

1、产毒培养： 将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6ml CAYE 培养基内．37℃振荡培养过夜。

加入20 000u／m1的多粘菌素B 0.05ml，于37℃1小时，离心4000转／分15分钟，分离上清液，加入0.1％硫柳汞0.05ml，于4℃保存待用。

2、LT检测方法(双抗体夹心法)： ①包被：先在产肠毒素大肠埃希菌LT（(双抗体夹心法)和ST（抗原竞争）酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5ml，混匀后全部吸出于3.6ml包被液中混匀，以每孔100ul量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，

于4℃冰箱湿盒中过夜。②洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。

③封闭：每孔加100ul封闭液，于37℃水浴中1小时。④洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑤加样本：每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100ul，37℃水浴中1小时。⑥洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑦加酶标抗体：先在酶标LT（双抗体夹心法）抗体管中加0.5ml稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，每孔加100ul，37℃水浴中1小时。⑧洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

⑨酶底物反应：每孔(包括第1孔)各加基质液100 ul，室温下避光作用5～10分钟，加入终止液50 ul。

⑩结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，

待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。

3、ST检测方法(抗原竞争性) ①包被：先在包被用ST（抗原竞争性）抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出，于1.6ml包被液中混匀，

以每孔50uL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第l孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。

②洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。③封闭：每孔加100uL封闭液，37℃水浴1小时。④洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

⑤加样本及ST(抗原竞争性)单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50uL稀释的ST单克隆抗体50uL(先在ST单克隆抗体管中

加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出，于1.6ml稀释液中混匀备用)，37℃水浴l小时。⑥洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。

⑦加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，

每孔加100uL，37℃水浴中l小时。⑧洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。⑨酶底物反应：每孔(包括第1孔)各加基质液100uL， 室温下避光5～10分钟，再加入终止液50uL。

⑩结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值：

(二)双向琼脂扩散试验检测LT（双抗体夹心法测抗体）：

将被检菌株按5点环形接种于Elek培养基上。以同样操作，共做2份，于36℃培养48小时。

在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6小时，使肠毒素渗入琼脂中。在5点环形菌苔各5mm处的中央，挖1个直径4mm的圆孔，并用l滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT（双抗体夹心法测抗体）抗毒素30uL，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20小时观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。 (三)乳鼠灌胃试验检测SI'（(抗原竞争性)

将被检菌株接种于Honda产毒肉汤内，于36℃培养24小时，以3000转／分离心30分钟，

取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30分钟，每lml滤液内加入2％伊文思蓝溶液乱0.02ml。

将此滤液用塑料小管注入l～4日龄的乳鼠胃内0.11ml，同时接种3～4只，禁食3～4小时后用三氯甲烷麻醉，

取出全部肠管，称量肠管(包括积液)重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。

六、结果报告

综合上述牛化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。

八、其 他 属（肠道菌疾病检验—肠道属） (一)克雷伯菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

克雷伯菌属细菌一般不致病，当机体免疫力低下时，能引起多种感染。 对人类关系密切的有①肺炎克氏菌和②臭鼻克氏菌和③鼻硬结克氏菌。 肺炎克氏菌是形态较短粗的革兰阴性杆菌，常见端端排列，无鞭毛，多数有菌毛，有较厚的荚膜。营养要求不高，在普通培养基上生长的菌落大，呈粘液状，相互融合，以接种环挑之易拉成丝。

肺炎克氏菌是除大肠杆菌外的最重要条件致病菌，已成为医源性感染的重要细菌。

存在于人类肠道、呼吸道及水和谷物中，当机体免疫力降低或应用免疫抑制剂，也可因长期大量使用抗生素导致菌群失调而引起感染。常见有支气管炎、肺炎、泌尿道和创伤感染，有时导致严重的败血症、脑膜炎、腹膜炎等。

(二)变形杆菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

变形杆菌属中与医学关系密切的包括①普通变形杆菌和②奇异变形杆菌，为多形性的革兰阴性杆菌，可为球形或丝状，无荚膜，幼龄培养物中有周身鞭毛，运动活泼。有菌毛，可粘附至植物和真菌细胞表面，但不与动物组织细胞或红细胞表面吸附。

需氧或兼性厌氧。

营养要求不高。在固体培养基上常呈扩散生长，形成以菌接种部位为中心的厚薄交替、同心圆形的层层波状菌苔，称为迁徙xi(迁移的意思)生长现象。在血琼脂平板上有溶血现象。能迅速分解尿素，是本属的一个重要特征。个别菌株发酵乳糖。变形杆菌根据菌种抗原分群，再以鞭毛抗原分型，现至少分为100多个血清型。X19、X2、和XK菌株含有特殊菌体O抗原，可与某些立克次体的部分抗原发生交叉反应，

故可替代立克次体作为抗原与患者血清进行凝集反应，此称为外斐试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等立克次体病。

变形杆菌属在自然界分布广泛，人和动物肠道也经常存在。对人类一般不致病，在特定条件下可单独或与其他细菌混合感染。

变形杆菌是尿道感染最常见菌之一，其尿素酶可分解尿素产氨，使尿液pH增高，碱性环境有利于变形杆菌的生长。肾结石和膀胱结石的形成与变形杆菌属可能也有关，因该菌属可使尿碱化促进磷酸铵镁结石的形成。

变形杆菌还能引起皮肤、耳、乳突小房、眼等局部感染，以及腹膜炎、败血症等，有的菌株可引起食物中毒。

(三)肠杆菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

为革兰阴性的杆菌或球杆菌，具周鞭毛，能运动，有些菌株有荚膜，无芽胞。兼性厌氧，无特殊营养要求，最适生长温度为30℃。

在营养培养基中均匀浑浊，有菌膜。对大多数对糖类产酸产气，但44.5℃只产酸不产气，

IMViC(吲哚形成、甲基红反应、VP反应和枸橼酸盐利用试验) 反应大多为+ + - -。是肠杆菌科中最常见的环境菌群，但不是肠道的常居菌群。在水和日常食品中比埃希菌属更常见，常自尿道感染和败血症时分离出，为机会病原菌（肠杆菌）。（肠杆菌比大肠埃希菌感染更常见） (四)沙雷菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

与医学有关的是①粘质沙雷菌和②液化沙雷菌，革兰阴性菌，具周鞭毛、能运动，一般无荚膜，不产芽胞。

兼性厌氧，营养要求不高，菌落不透明，常呈白色、粉红色或红色。液体培养物形成菌膜。触酶强阳性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖产气或不产气，VP阳性，DNA

酶阳性，少数菌株可产生非水溶性红色色素，临床分离的粘质沙雷菌35℃大多不产色，转种22℃培养数天后可恢复产色。为环境常居菌群，常导致医院内感染，为机会病原菌。

(五)哈夫尼菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

只有1个种，即蜂房哈夫尼菌。革兰阴性杆菌，具周鞭毛，无荚膜，不产芽胞。兼性厌氧菌，菌落光滑、湿润、半透明，呈灰色带亮的表面和完整的边缘，最适生长温度为25℃～30℃，本菌的动力和许多生化反应在35℃时为阴性。触酶阳性，氧化酶阴性，发酵葡萄糖产酸产气。

为周围环境常居菌，常导致医院内感染，为机会性病原菌。 (六)普城菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

革兰阴性菌，两端钝圆，有多形性，有周鞭毛，运动活泼，无芽胞，无荚膜。兼性厌氧菌，在25℃时动力比35℃时好。菌落小而透明，

在含①胆盐培养基上较扁平和透明，在②SS琼脂上产硫化氢，中心黑色（普城菌培养基的生长特点SS）。

液体培养时，培养基均匀浑浊生长，表面有菌膜，管底有沉淀。尿素和苯丙氨酸酶阳性，乳糖阴性，枸橼酸盐和阿东醇阳性，而鸟氨酸阴性。

为常见的环境和肠道寄居的正常菌群，也是医院内感染常见的机会菌，常分离自腹泻和尿道感染。

(七)摩根菌属（肠道菌疾病检验—肠道属）

革兰阴性菌，在固体和液体培养基上的生长特性与普城菌属的一致。某些株30℃以上不形成鞭毛和不能运动。尿素和苯丙氨酸酶阳性，乳糖阴性，枸橼酸盐和阿东醇阴性，而鸟氨酸阳性。为常见的环境和肠道寄居的正常菌群，也是医院内感染常见的机会菌，常分离自腹泻和尿道感染。

九、寄生虫性腹泻（肠道菌疾病检验—肠道属）

(一)概述人体感染某些寄生虫后，会引起急性腹泻和慢性腹泻，多为慢性腹泻，或在急性发作后经常再发如艾滋病相关性腹泻中，以原虫尤其是最常见的隐孢子虫引起的感染性腹泻，往往病程迁延，治疗困难，已成为艾滋病死亡原因之一（寄生虫性腹泻）。

去某些地区旅游会导致较高的蓝氏贾第鞭毛虫感染性腹泻。现已知能引起寄生虫

性腹泻的寄生虫有50多种。

寄生虫性腹泻的发病机制主要为①渗出型、②渗透型、③分泌型、④脂肪泻及肠外致病等。寄生虫性腹泻与其他肠道病原体引起的腹泻往往难以鉴别，但有些流行病学和临床体征方面还是有差别的，主要表现在（寄生虫性腹泻）：潜伏期长，起病缓慢；呈地方性分布特征；发热少见；在艾滋病相关腹泻中常见；蠕虫性腹泻患者外周血嗜酸性粒细胞增多；确诊须依据病原学检查；针对病原治疗有效。 (二)阿米巴痢疾（寄生虫性腹泻—肠道菌疾病检验）

其病原体为溶组织内阿米巴，感染者中有90％为无症状的携带者，约10％的感染者由于阿米巴滋养体侵袭肠壁组织引起腹痛、腹泻、粘液血便等症状。本病易复发、迁延成慢性。如病原体由肠道借血流或直接蔓延而侵入肠外组织，则产生相应脏器的阿米巴病等肠外并发症。最常见为①阿米巴肝脓肿，其次还有②阿米巴肺脓肿、③脑脓肿及其他部位的脓肿。溶组织内阿米巴有①滋养体和②包囊二期。

滋养体又分为大小两型①寄生于结肠肠腔或肠壁内，以二分裂法繁殖。主要传染源为无症状带包囊者、慢性患者和恢复期患者其粪便中不断排出包囊。②急性期患者主要排出包囊，故不成为主要传染源。该病的传播主要通过包囊污染饮水、食物等而感染。污染的手、苍蝇、蟑螂等可携带包囊而传播。粪便中检出阿米巴滋养体或包囊是确诊的重要依据。

(三)蓝氏贾第鞭毛虫（寄生虫性腹泻—肠道菌疾病检验）

蓝氏贾第鞭毛虫属于寄生于肠道的一种鞭毛虫，营二分裂繁殖。其生活史分①滋养体和②包囊两个时期，与之相应，其形态也有这两种。

①滋养体如同纵切的半个梨，背面隆起，腹面扁平，其前半部向内凹陷形成吸盘，以此吸附于肠壁。虫体左右对称，有4对鞭毛，依靠这些鞭毛的摆动，虫体运动非常迅速。②包囊为椭圆形，囊壁厚，碘液染色后呈黄绿色。未成熟的包囊内有2个核，成熟的包囊内有4个核。囊壁内的虫体除游离的自由鞭毛消失外，其他结构与滋养体类同。蓝氏贾第鞭毛虫所致腹泻中，人是该病的主要传染源，该病发生多见于环境卫生差、医疗水平低的地区。该病多为自限性。人感染蓝氏贾第鞭毛虫后，临床表现多样。许多人不表现任何症状，出现症状者也有轻有重。该虫寄生于小肠上段，大量滋养体吸附于肠黏膜上，影响吸收功能，造成机械刺激以及破坏肠上皮微绒毛，出现的全身症状体征可有失眠、头痛、乏力、眩晕、神

经兴奋性增高等，

胃肠道症状有：腹泻、腹痛、厌食等，腹泻可为急性、更多见慢性，并由此可导致贫血、发育不良、体重下降。如不重视，这种腹泻可反复发作，病程可达数年。有些感染者会出现亚急性症状，主要表现为间歇性稀便、腹部疼痛、食欲不振等。本病为旅游者腹泻的常见原因之一（蓝氏贾第鞭毛虫）。另外该虫进入阻管系统可能会引起胆囊炎。在粪便或十二指肠液中检查到滋养体或包囊才可确诊（蓝氏贾第鞭毛虫），而且不能仅靠单份标本作出诊断。蓝氏贾第鞭毛虫引起的感染性腹泻中，在稀水样便中一般可用生理盐水涂片镜检查到滋养体，还可用碘液涂片法检查包囊。粪便阴性不能排除本病，直接镜检或离心浓缩后检查十二指肠引流液可提高检出率，对诊断胆道蓝氏贾第鞭毛虫病有特殊意义。另有还有①小肠活检、②肠检胶囊法等。 第二节 呼吸道疾病病原学检验 一、呼吸系统防御机制：

呼吸系统是机体与外界环境持续接触、表面积最大的器官和系统。呼吸系统的防御机制可分①为非特异性防御和②特异性防御两大类。 (一)呼吸系统的非特异性防御机制：

1、机械物理性防御①解剖屏障：鼻腔由假复层纤毛柱状上皮细胞组成，黏膜下层有很多浆细胞，富含IgA②气流动力沉积③粘液纤毛运输④咳嗽反射。2、体液性防御 ①溶菌酶：多核白细胞颗粒中存在高浓度的溶菌酶，肺泡内存在大量溶菌酶，是一种l，4-β-N-乙酰胞壁质酶；

②铁结合蛋白：有乳铁蛋白和转铁蛋白两种，其作用是犹如铁螯合物阻碍细菌对铁的利用，而起到抑杀菌的作用；

③纤维连接蛋白；④蛋白降解酶；⑤表面活性物质和游离脂肪酸；⑥干扰素；⑦补体；⑧抗体。

3、细胞性防御 吞噬细胞：主要包括①多形核白细胞、②嗜酸性粒细胞、③肺巨噬细胞等。

(二)呼吸系统特异性防御机制

1、免疫器官：①胸腺；②腔上囊；③淋巴结与淋巴小结；④脾。

2、免疫活性细胞 ①T淋巴细胞；②B淋巴细胞；③NK细胞；④巨噬细胞。 3、免疫球蛋白和淋巴因子 ①免疫球蛋白(1g)：B淋巴细胞表面有Ig，各类的

Ig的区别主要在于它们分子中重链氨基酸组成和抗原性的不同。 IgG是人血清中的主要抗体，IgG是固定补体，激活补体经典途径。

血清中IgA多为典型4链多肽单体结构，而外分泌液如呼吸道分泌物中的分泌型IgA（SigA）为双聚体IgA，是一种重要的局部抗体，其合成障碍是约有75％的患者并发呼吸道感染。

IgM是感染早期出现的抗体，有很高的结合价和凝集能力。IgE正常人血清中含量少，可引起过敏反应，可能对抗寄生虫感染有很大意义。

IgD功能尚不清楚。②淋巴因子：是活化淋巴细胞分泌的低分子多肽，具有广泛的生物学活性，在免疫应答和调节中发挥作用。 二、呼吸系统病原体的毒力

微生物的致病性是指其引起疾病或导致器官组织进行性病变的能力，是微生物种的特性。

致病力可分为①产毒性和②侵袭力，前者（①产毒性）表示微生物产生毒素的能力，

后者（②侵袭力）是微生物入侵宿主组织并在其中繁殖扩散的能力。

毒力以半数致死量(LD50)测定表示。毒力主要与毒素有关。毒素可分为①外毒素和②内毒素两类。

(一)外毒素（呼吸系统病原体的毒力）

外毒素是细菌分泌的、能从培养的上清液中提取并产生远隔部位作用的毒性物质，（外毒素）属蛋白质类。

按照其与宿主作用的机制可分为下列几类：

①细胞内作用毒素：以A、B白喉外毒素为代表，铜绿假单胞菌也可分泌A、B外毒素；

②膜作用毒素如金黄色葡萄球菌的σ毒素（属于外毒素）毒素，是金黄色葡萄球菌最强的毒力因子之一，

类似的还有化脓性链球菌的溶血素(O和S)等；

③诱导性物质：如金黄色葡萄球菌的中毒性休克综合征毒素和热原性外毒素； ④细胞外酶：某些化脓性细菌还分泌多种胞外酶类，可引起组织损伤，有助于细菌扩散。

(二)内毒素（呼吸系统病原体的毒力）

内毒素是革兰阴性杆菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分，为革兰阴性杆菌最重要的毒力因子，

○1螺旋体、○2衣原体、○3立克次体和○4个别革兰阳性细菌的细胞壁成分也具有内毒素活性。

内毒素具有下列共同特点：

内毒素大多数是属于细胞壁固有成分，少数几种内毒素存在于细胞质中，如百日咳杆菌、鼠疫杆菌等；

内毒素的共同化学结构是：○1由O异性多糖、②非特异性核心多糖和③类质A三部分组成，类质A是内毒素的主要毒性组分；

内毒素耐热，100℃作用l～2小时不被破坏，对酶有抵抗力（内毒素）； 内毒素的毒性较外毒素弱，缺少选择性； 内毒素的免疫原性较外毒素弱；

内毒素具有多种生物学活性如激活血凝系统等。

三、肺部感染的病原学诊断方法（呼吸道疾病）

肺部感染的病原学诊断技术包括临床标本采集和实验室对病原体的检测两部分，引起肺部感染的病原体有细菌、真菌、衣原体、支原体、病毒和原虫等。常用的检测方法有：包括涂片光镜检查、培养鉴定、组织病理检查、免疫学和分子生物学技术检测等。

临床上应按照疑似或需检测的肺部感染的病原体种类，采集相应的临床标本和采取相宜的实验室检测方法。 (一)病原学诊断标本采集：

人体喉以上呼吸道（肺部感染）黏膜表面及其分泌物含有众多微生物，这些称之为“正常菌群”的微生物有200种以上。

革兰阳性球菌：草绿色链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等；

革兰阴性球菌：非致病性奈瑟菌、卡他莫拉菌、脑膜炎球菌； 革兰阳性杆菌：乳酸杆菌、类白喉杆菌；

革兰阴性杆菌：流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、不动杆菌；

真菌：主要为念珠菌。一般真菌的标准培养基为沙堡培养基，适宜的生长pH为6.2～7.0。 (二)咳痰标本：

患者用清水反复漱口后，用力咳嗽，从呼吸道深部咳出新鲜痰送检。痰量少时，可用45℃10％氯化钠溶液雾化吸人进行导痰，痰标本采集后应及时送实验室。痰液在室温下延搁2～5小时会降低某些菌的分离率。痰涂片作革兰染色细胞学检查判断痰标本受到污染程度是一种较为可靠的方法。来自下呼吸道的合格的痰标本应是含有脓细胞和支气管柱状上皮细胞较多。通常将挑取的痰液在系列含有灭菌等渗氯化钠的平板培养皿内顺次漂洗后接种于培养皿内，根据中国《医院内获得性支气管—肺感染诊断标准》，痰定量培养分离的致病菌或条件致病菌浓度≥107cfu／ml，可认为是肺部感染的病原体；

≤104cfu／ml，则为污染菌，界于两者之间，建议重复痰培养。

1、环甲膜穿刺经气管吸引：用于细菌培养的分泌物仅数滴便可，尽量避免吸引前向气管内注射等渗氯化钠注射液。主要并发症为出血、纵隔或皮下气肿等，主要用于普通需氧菌和厌氧菌引起的肺部感染的病原学诊断，对肺部浸润病灶为感染或非感染因素的鉴别也有一定参考价值。

2、经胸部穿刺肺吸引：操作最好在X线透视定位下进行。针刺后数小时应做胸部X线透视以了解有无并发气胸。

3、支气管肺泡灌洗：作为肺部弥漫性病变以及免疫抑制患者肺部浸润性病变的病因诊断技术已广泛应用于临床。

4、血培养和胸水培养 为一种简单易行的肺部感染病原学诊断方法。但标本培养率相对较低。

四、肺部感染病原菌检测 (一)分枝杆菌属（呼吸道疾病）

分枝杆菌主要特点是细胞壁含有大量脂质，与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关，一般不易着色（分枝杆菌），若经加温或因延长染色时间而着色后能抵抗脱色剂盐酸酒精的脱色，故又名抗酸杆菌。

该菌属（分枝杆菌）无鞭毛、无芽胞、无荚膜，不产生外毒素或内毒素，其致病性与菌体成分有关。引起的疾病呈慢性，伴有肉芽肿。

分枝杆菌种类较多，（分枝杆菌）可分为①结核分枝杆菌、②非结核分枝杆菌与

③麻风分枝杆菌三类。

(二)结核分枝杆菌（呼吸道疾病）

经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，又是异烟肼影响细胞壁分枝酸的合成均可导致其变为L型。

（结核分枝杆菌）专性需氧，营养要求较高，生长缓慢。初次培养常用L-J培养基（用于结核分枝），一般10～30天可见菌落生长。

1、抗酸染色：痰涂片抗酸染色光镜检查，对肺结核及其他非典型分枝杆菌感染的及时、初步诊断十分重要。

抗酸染色操作简便、结果快速，是分枝杆菌感染最初的基本检验步骤，也是确认所检细菌为分枝杆菌的重要方法。

根据涂片方法不同可分为○1厚涂片法○2浮游集菌法和○3离心沉淀法三种。 ◇1厚涂片抗酸杆菌检查结果报告方式：

“一”代表“观察100—300视野未发现抗酸杆菌”，“ +”代表“全视野发现3～9条抗酸杆菌”，

“++”代表“全视野发现10～99条抗酸杆菌”， “+++”代表“每油镜视野发现1～9条抗酸杆菌”，

“++++”等表示“每油镜视野发现≥10条抗酸杆菌”。

2．分枝杆菌的培养：培养基可采用酸性改良罗氏培养基，用于分离培养，痰液中加入2％Na()H 2～4倍量，振荡使痰液化，取消化后痰液0.1ml，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2支酸性改良罗氏培养基，37℃孵育。 肺部常见感染的免疫血清学诊断方法：

包括凝集试验(AT)、间接免疫荧光试验(1FA)、直接免疫荧光试验(DFA)、乳胶凝集(LA)、ELISA（酶链免疫吸附试验）等，

分子生物学诊断手段如PCR（聚合酶链反应）等方法的应用越来越广泛。

(三)葡萄球菌属（肺部感染病原菌）

葡萄球菌为革兰阳性球菌，一般为需氧或兼性厌氧生长，营养要求简单，在血液琼脂平板上，菌落周围可有明显的完全溶血环。 现在多根据有无凝固酶将葡萄球菌分为三类：

金黄色葡萄球菌：能产生凝固酶，在琼脂培养基上菌落绝大多数呈金黄色，能产

生多种毒素，对人类具有极强的致病力；

表皮葡萄球菌：凝固酶阴性（不能产生凝固酶），该菌为条件致病菌（表皮葡萄球菌），在机体抵抗力差、免疫力低下时可引起严重感染；

腐生葡萄球菌：凝固酶阴性（不能产生凝固酶），呈白色菌落，该菌仅偶尔引起尿路感染。

葡萄球菌的毒力因子包括：①毒素、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素—1、肠毒素等；

②酶：凝固酶、纤维蛋白溶酶、耐热合算酶、透明质酸酶、脂酶等； ③其他：荚膜、胞壁肽聚糖等。

葡萄球菌具有天然的耐青霉素的特性，20世纪80年代后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)和耐苯唑西林(ORSA)的比例逐年增加。

正常人群体内和体表多处有葡萄球菌存在而不引起疾病。鼻腔是最主要的带菌部位（葡萄球菌带菌部位），其次为皮肤、咽喉及肠道。 肺炎患者痰标本为黄脓色、粘厚，应考虑为葡萄球菌感染。

金黄色葡萄球菌检验（葡萄球菌属的分类）现在多根据有无凝固酶将葡萄球菌分为三类：（金黄色葡萄球菌检验是其中的一类）（食品）

一、增菌培养法：(一)检样处理：称取25g(mL)样品，加入225m1灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。

(二)增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于7.5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养墓内，置36℃士l℃温箱培养24小时，转种血平板和Baird—Parker平板，36℃±1℃培养24小时，挑取金黄色葡萄球菌落进行革兰染色镜检及血浆凝固酶试验。

(三)形态：本菌为革兰阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，

无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5—1um。

(四)在肉汤中呈混浊生长：◇1在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，

◇2血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。

◇3在Baird—Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为

淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。

长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。

(五)血浆凝固酶试验：吸取l：4新鲜兔血浆0.5ml，放人小试管中，再加入培养24小时的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，振荡摇匀，放36℃±1℃温箱或水浴内，每半小时观察1次，观察6小时，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。

二、直接计数方法：1、吸取上述1：10混悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液lml，分别加入3块Baird—Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3ml、0.4ml，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，

可将平板放在36℃±1℃温箱l小时，等水分蒸发后反转平皿置36℃±1℃温箱培养。

2、在3个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36℃±1℃ 24小时培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。

3、菌落计数 将3个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。

(四)链球菌属（肺部感染病原菌）

革兰阳性球菌，引起人的疾病主要有各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎和风湿热、肾小球肾炎等变态反应性疾病。

根据溶血现象的分类可分为3类（链球菌）：①甲型溶血性链球菌：菌落周围有1～2mm宽的草绿色溶血环，称甲型溶血或α溶血，因而这类菌也称做草绿色链球菌，这类链球菌多为条件致病菌；

②乙型溶血性链球菌：菌落周围形成一个2～4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，称做乙型溶血或β溶血，因而这类菌多称做溶血性链球菌。这类链球菌致病性强；

③丙型溶血性链球菌：不产生溶血素，因而也称做不溶血链球菌，无致病性。 (五)肺炎链球菌（肺部感染病原菌）

肺炎链球菌为革兰阳性球菌，习惯上称为肺炎球菌，直径0.5一1.25um。无鞭毛、无芽胞、有荚膜，需氧或兼性厌氧、营养要求高，在含有血液或血清的培养基上才能生长。主要寄生于人的上呼吸道，仅部分菌株有致病力，主要引起大叶性肺炎（肺炎链球）。

肺炎链球菌在血琼脂培养基上基本呈灰白色，半透明，周围有草绿色溶血环（在血液琼脂平板上葡萄球菌的菌落周围可有明显的完全溶血环而

肺炎链球菌在血琼脂培养基的周围有草绿色溶血环这是与葡萄球菌的区别）。菌落在普通琼脂培养基上呈绿色，易与草绿色链球菌相混淆（甲型溶血性链球菌也称做草绿色链球菌）。肺炎球菌感染患者痰标本为铁锈色。肺炎链球菌不产生内、外毒素（葡萄球菌能产生毒素），而其致病力主要是荚膜的侵袭作用（因为肺炎链球有荚膜），有荚膜的菌株有毒力，失去荚膜的菌株毒力减低或丧失。根据荚膜多糖抗原性的不同，可分型。

同时，荚膜肿胀试验可用于肺炎链球菌的快速诊断。青霉素为治疗肺炎链球菌的标准药物。（而葡萄球菌耐青霉素，葡萄球菌与肺炎链球菌的区别）

溶血性链球菌检验（肺部感染病原菌）（食品）

一、样品处理：称取25g(m1)检样，加入225ml灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

二、一般培养：吸取上述混悬液5ml，接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤；或自接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克肉汤，经36℃±1培养24小时，接种血平板。置36℃±1培养24小时，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。 三、形态与染色

本菌（溶血性链球菌）呈球形或卵圆形，直径0.5～1um，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养中常呈短链。不形成芽胞，无鞭毛，不能运动（溶血性链球菌特点）。 四、培养特性

该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光（溶血性链球菌在血平板的特点），直径约0.5～0.75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血性链球菌（链球菌属根据溶血现象的分类可分为3类，其中的一类是乙型溶血性链球菌）周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。 这类链球菌致病性强（乙型溶血性链球菌 ） 五、链激酶试验：

○1致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成为血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

○2吸取草酸钾血浆0.2ml，加0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入18～24小时36℃±1℃培养的链球菌培养物0.5ml及0.25％氯化钙0.25ml(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3％～0.35％)，振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10分钟，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝块重新完

全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24小时后不溶解即为阴性。

○3草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放人灭菌小试管中，再加入5m1人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。 六、杆菌肽敏感试验

挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04u的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于培养36℃±1℃培养18～24小时，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知菌株作为对照。

(六)奈瑟菌属

革兰阴性双球菌。无鞭毛、无芽胞，有菌毛，需氧，具有氧化酶和触酶。对人致病的只有○1脑膜炎奈瑟菌和○2淋病奈瑟菌。

除淋病奈瑟菌寄居于尿道黏膜外，其他奈瑟菌均存在于鼻腔黏膜。 (七)脑膜炎奈瑟菌（对人致病的奈瑟菌有两种○1脑膜炎奈瑟菌）

通称脑膜炎球菌（脑膜炎奈瑟菌），是流行性脑脊髓膜炎的病原菌。革兰阴性双球菌，需氧，非常脆弱，遇干、冷空气均可死亡。人是惟一宿主，生长营养要求高，需要在巧克力琼脂平板生长（脑膜炎奈瑟菌通称脑膜炎球菌培养的特点），发酵葡萄糖、不发酵乳糖，氧化酶阴性。 有荚膜结构，根据荚膜多糖可分为9个血清群。

采取患者○1脑脊液、○2血液或其他○3渗出物，进行微生物学检查。（脑膜炎奈瑟菌采取患者部位）

(八)淋病奈瑟菌（对人致病的奈瑟菌有两种○2淋病奈瑟菌）

通称淋球菌（淋病奈瑟菌）。为淋病的病原菌，严格的人体寄生菌。革兰阴性球菌。无芽胞、无鞭毛、有荚膜和菌毛。

分解葡萄糖，产酸不产气，不分解麦芽糖与蔗糖，氧化酶试验和过氧化酶试验阳性。营养要求高，

一般不易培养，培养时培养基中需加入腹水、血液或阴囊水肿液。 (九)肺炎克雷白杆菌

革兰阴性杆菌，兼性厌氧，不活动，常具有荚膜，营养要求低，分解葡萄糖。大多数社区及医院内获得性肺炎杆菌是内源性感染，

原发性肺炎克雷白杆菌肺炎呈大叶性分布。肺炎患者痰标本为砖红色胶胨样痰，

应考虑为肺炎克雷白菌感染。 (十)铜绿假单胞菌（称为绿脓杆菌）

即通常所称的绿脓杆菌，是一种重要的条件致病菌。由于本菌固有的和极易产生的获得性耐药，加之它不易为呼吸防御机制彻底杀灭，故治疗困难，病死率高（铜绿假单胞菌）。

其为（铜绿假单胞菌）革兰染色阴性杆菌，全需氧，有鞭毛，无芽胞，无荚膜，营养要求低，

在琼脂血平板上生长有特殊气味，典型的气味为生姜味（铜绿假单胞菌称为绿脓杆菌的特殊的气味）。

菌落呈灰绿色或蓝绿色。铜绿假单胞菌分离培养时宜选用NAC培养基。 主要毒力因子为（假单胞菌铜绿）：○1菌毛、○2粘液外多糖、○3内毒素、○4蛋白酶类、○5外毒素、○6溶血素、○7绿脓素等。铜绿假单胞菌感染患者咳痰颜色为翠绿色或黄脓色（这是（铜绿假单胞菌又一特点）。 (十一)不动杆菌

是一类氧化酶阴性，厌氧下不能利用葡萄糖，无动力的革兰阴性杆菌。 根据最新分类系统，不动杆菌属分6个种，其中以鲍曼不动杆菌、硝酸盐阴性杆菌为多见（不动杆菌）。

不动杆菌感染治疗可采用氨基糖甙类抗生素加第三代头孢菌素。

白喉棒状杆菌（属于不动杆菌属其中一种）：○1革兰阳性杆菌，菌体染色不均匀，有异染颗粒。无荚膜、无鞭毛。不产生芽胞。需氧或兼性厌氧。

○2其致病性与其产生的白喉毒素有关。在含有凝固血清的Loffler培养基上生长迅速。

○3调查人群对白喉的免疫力可用白喉毒素做皮内试验，又称锡克试验（白喉的免疫力可用白喉毒素做皮内试验）。

○4体外毒力鉴定可采用琼脂平板毒力试验和豚鼠试验。 (十二)百日咳鲍特菌

革兰阴性球杆菌（百日咳鲍特菌），光滑型菌株有荚膜和菌毛。无芽胞或鞭毛。需氧，初次培养多用鲍—金培养基，培养基上生长时，菌落颜色为银灰色（在初次培养多用鲍—金培养基菌落颜色为，培养基上生长时银灰色）。革兰染色为阴性杆菌（培养基上生长时菌落颜色为银灰色做革兰染色为阴性杆菌），在普通血

平板上不生长（这是百日咳鲍特菌的特点只有在初次培养多用鲍—金培养基上才能生长）。

(十三)嗜血杆菌（流感嗜血杆菌）

流感嗜血杆菌引起的肺炎主要发生在6个月至5岁的婴幼儿，常并发化脓性脑膜炎（流感嗜血杆菌引起），近年来，流感嗜血杆菌在成年人中引起感染的机会呈增高趋势。本菌为革兰阴性小杆菌，不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不能运动，部分菌株有多糖荚膜，与流感嗜血杆菌的毒力有密切关系。本菌为需氧菌，营养要求高，在一般培养基上不容易生长，需要X和V两种生长因子才能生长。 ○1X因子为存在于血红蛋白中的一种血红素，为含铁的卟啉，是细菌合成过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素氧化酶的辅基。

○2V因子为一种维生素B类物质，血液中所含的V因子通常处于被抑制状态，经加热后，可使V因子释放。

流感嗜血杆菌在巧克力培养基上生长较佳。培养24小时后菌落可呈三种状态：M型、R型和S型。有荚膜的菌株菌落呈M型，粘稠并有光泽，对人的毒力强（这是M型特点）。流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共同生长时，因后者能合成V因子（金黄色葡萄球菌），可见“卫星现象”（只有在流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂培养基上共同生长时才能出现“卫星现象”）。即葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，远离者较小。 与流感嗜血杆菌相比，○1副流感嗜血杆菌培养时，培养基中不需要血红素及其衍生物，○2而溶血嗜血杆菌培养时，菌落周围有β溶血环现象。

○3而杜克嗜血杆菌主要引起软性下疳疾病，并且杜克嗜血杆菌培养时只需要X（不需要V因子）。

○4有荚膜的流感嗜血杆菌含有荚膜多糖抗原又称M抗原，具有型特异性，能刺激机体产生保护性抗体。

可应用型特异性免疫血清作特异性抗血清凝集试验进行血清学分型，通常将流感嗜血杆菌分为6个型。其中以b型致病力最强。

人类是流感嗜血杆菌的惟一宿主，它寄生于正常人的上呼吸道，无荚膜型菌株和b型流感嗜血杆菌均视为上呼吸道的正常菌群。

感染流感嗜血杆菌的婴幼儿肺炎患者并发症通常为脑膜炎。氨苄西林为流感嗜血杆菌肺炎的首选抗菌药物。

目前流感嗜血杆菌菌苗的研制主要有以下三种：○1荚膜多糖菌苗、○2多糖—载体蛋白结合菌苗和○3荚膜寡糖—变异性白喉类毒素结合菌苗。 (十四)军团菌（主要是嗜肺军团菌引起疾病）

1976年，美国首次报道了军团菌病，在费城一家宾馆举行58届退伍军人大会期间和会后一个较短时间内，与会的退伍军人代表和其他成员中突然发生一种不明原因但临床表现相同的疾病。CDC等单位经过13个月的研究，最后证明本病为一种细菌性肺炎，并以会议的名称将其命名为退伍军人病或军团病1982年我国首次发现军团菌感染患者，经美国CDC间接免疫荧光抗体检测（IFA-间接免疫荧光检测，这个方法测抗体），证实为嗜肺军团菌感染。

军团菌为革兰染色阴性杆菌，无荚膜，不产酸，有鞭毛，能运动。需氧，生长时需要L—半胱氨酸和铁盐，氧化酶阴性或弱阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，液化明胶，水解马尿酸是嗜肺军团菌的特征。细胞壁上有支链脂肪酸。利用氨基酸作为能量来源，不发酵碳水化合物，可从地表水、泥土和热水中分离到本菌。军团菌主要以嗜肺军团菌为主引起人类疾病。嗜肺军团菌可分解淀粉，但不发酵葡萄糖或其他碳水化合物，需氧，对碳水化合物的利用可能是通过氧化途径而不是发酵途径。

嗜肺军团菌在F—G琼脂上生长时，其菌落呈现褐色（嗜肺军团菌在F—G琼脂上生长时，其菌落呈现褐色）。除米可戴德军团菌外所有军团菌种均能产生褐色色素。氨基酸是嗜肺军团菌的主要能源其中，谷氨酸为主要来源。军团菌具有独特的细胞脂肪酸，支链脂肪酸图谱可作为军团菌分类的依据。军团菌在自然界中普遍存在。嗜肺军团菌和其他菌种的军团菌曾从○1河水、○2溪水、○3污染的热水、○4天然温泉水中分离到。

同时军团菌又是人工管道水源中常见的一群微生物，可在人工管道水源中定居、生长、繁殖，并以气溶胶的方式传播感染人群。近年来，空调的广泛使用对于军团菌的定居和感染提供了一个良好的条件。空调冷却塔中的冷却水如果被军团菌污染，随着送风管道，军团菌将对人造成感染。天然环境中及人工管道系统中的阿米巴是军团菌的天然宿主，阿米巴存在于水、水龙头、淋浴器和空调冷却塔水中，世界上目前暴发的多次军团菌病与空调系统的冷却塔水有关。目前，豚鼠是实验性军团菌病的最佳动物模型。军团菌引起病灶的主要部位不是上呼吸道而是肺泡。临床上军团菌感染主要有三种形式：◇1肺炎型、◇2发热型和◇3肺外感染型。

◇1肺炎型主要表现为体温迅速上升，高达39℃～41℃，一般不超过39.5℃，发冷、不适、头痛、呼吸困难、呕 吐、 腹泻等，咳嗽并有少量粘痰。X线检查，显示有肺炎。◇2发热型又称庞蒂亚克热，潜伏期短，仅1—3天，症状为发热、发冷、咳嗽、头痛、腹泻、呕吐等，但无肺炎。可自愈预后良好，无死亡。◇3肺外感染型主要为继发感染，通过菌血症散布。

军团菌的诊断有赖于病原菌的○1分离或○2直接荧光抗体法(DFA)检测或○3以患者双份血清间接荧光法(1FA)做回顾性诊断，同时也是WHO推荐的检测军团菌经典的方法。○3IFA检测试验中，前后两次抗体滴度增长达到4倍增长达l：128以上：具有诊断意义。ELISA（酶联免疫吸附实验）、试管凝集方法、尿抗原检测等方法对于军团菌病的诊断具有良好的前景。临床上进行鉴别诊断时，应注意军团菌与支原体肺炎的区别。尿液中抗原的检测有助于军团菌病的早期诊断，感染后第1天至35天，尿中都可以测出抗原。

β-内酰胺类和头孢菌素类抗生素治疗军团菌病无效，这是因为军团菌能产生内β-酰胺酶和酰基转移酶分别使上述两类抗生素水解。

大环内酯类药物如红霉素、螺旋霉素等（这是军团菌治疗上用的抗菌药大环内酯类药物如红霉素、螺旋霉素等）对军团菌有效。

对于重症患者可联合使用利福平治疗。军团菌的培养需要特殊的培养基，BCYE琼脂培养基为目前推荐使用的培养基，L-半胱氨酸和焦磷酸铁为必需成分，BCYE培养基中加入α-酮戊二酸即为BCYE-a培养基，一般军团菌的分离培养时，培养基中需加人万古霉素、多粘菌素等成分以抑制杂菌的生长。在MH—IH培养基上生长时，能产生褐色色素。军团菌进行β-内酰胺酶试验时，基质的颜色将变为红色。

第三节 衣原体疾病检验

衣原体是一类能通过细菌滤器，严格细胞内寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物，其特征是：

①革兰阴性、圆形或椭圆形体；②有细胞壁，无肽聚糖，只含有大量胞壁酸；③具有独特的发育周期，类似细菌以二分裂方式繁殖；

④含有DNA和RNA两种核酸；⑤有核蛋白体，能进行多种代谢，但不能合成带高能键的化合物；⑥对某些抗生素敏感。

衣原体在宿主细胞内生长繁殖，具有特殊的发育周期，可观察到两种不同的颗粒结构，一种小而致密，称为原体；另一种大而疏松，称为网状体。

原体有胞壁，是发育成熟的衣原体，Gimsa染色为紫色，当进入宿主易感细胞后，逐渐发育增大为网状体。

网状体无胞壁，代谢活跃，以二分裂方式繁殖，在空泡内发育成许多子代原体，不具有感染性。

衣原体属主要包括◇1沙眼衣原体、◇2肺炎衣原体和◇3鹦鹉热衣原体。 一、沙眼衣原体（衣原体疾病检验的分类其中一种）

人是其主要自然宿主，沙眼衣原体有三个变种：○1沙眼生物变种、○2沙眼淋巴肉芽肿生物变种和○3鼠生物变种。

沙眼衣原体可采用直接涂片染色法进行检测，◇1姬姆萨染色后，上皮细胞内涵体呈蓝色、深蓝色或紫色。◇2碘液染色结果上皮细胞内包涵体呈棕色，其他细胞不着色。另外，鸡胚卵黄囊内接种法也可用于沙眼衣原体的分离和检测。利用此项技术，1956年，中国学者汤飞凡首次发现并报道了沙眼衣原体。沙眼衣原体是沙眼的病原体。侵犯眼结膜和角膜，引起颗粒性结膜炎、角膜炎。有些衣原体尚可引起泌尿生殖系统感染。

二、肺炎衣原体（衣原体疾病检验的分类其中一种）

肺炎衣原体寄生于人类，无动物储存宿主，人与人之间通过飞沫或呼吸道分泌物传播，扩散缓慢，潜伏期平均为30天左右。

肺炎衣原体可引起○1肺炎、○2支气管炎、○3咽炎、○4扁桃体炎和○5鼻窦炎等，老年人多见（肺炎衣原体）。

衣原体抗体的存在与慢性冠心病和急性心肌梗死有关，目前诊断肺炎衣原体感染的最敏感的方法是用微量免疫荧光试验检测血清中抗体。 三、鹦鹉热衣原体（衣原体疾病检验的分类其中一种）

首先从鹦鹉体内分离出，为鸟类胃肠道及呼吸道感染的病原体。哺乳动物(常见家畜)也可发生感染，尤其是幼年动物。 鹦鹉热衣原体可从鸟类传给人，使人发生肺炎。

多从呼吸道途径侵入，经过1—2周可急骤发病，有寒战、发热、咳嗽等症状。亦有徐缓发病或呈隐性发作。 第四节 螺旋体疾病检验

一、螺 旋 体

螺旋休是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物， 其基本结构（（螺旋体）与细菌类似，有细胞壁、核质，以二分裂方式繁殖和对抗生素敏感等（螺旋体）。

根据螺旋数目、大小与规则程度以及两螺旋间的距离，分为5个属，

对人和动物致病的行3个属。（○1疏螺旋体属、○2密螺旋体属、○3钩端螺旋体属） ○1疏螺旋体属：螺旋稀疏，有3～10个螺旋，不规则呈波纹状。对人致病的有○1回归热螺旋体、○2伯氏螺旋体、○3奋森螺旋体。

○2密螺旋体属：螺旋体细蜜，有8～14个规则螺旋，两端尖。对人致病的有○1梅毒螺旋体、○2雅司螺旋体、○3品他螺旋体等。

○3钩端螺旋体属：螺旋更细蜜而规则，数目较多。菌体一端或两端弯曲成钩状。对人致病的有○1黄疽出血型钩端螺旋体、○2流感伤寒型和○3肺出血型 二、钩端螺旋体属（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中一种） 钩端螺旋体属有两个种，○1一个是致病性钩体——肾脏钩端螺旋体。○2另一个非致病性钩体一一双曲钩端螺旋体。

钩端螺旋体的感染分为3个阶段，检测时应在不同阶段取不同标本。发病早期(第l周内为钩体败血症期)采集血液标本进行检测。发病第8大后(一直持续到第35天或更长时间)为钩体尿症期，可采集尿标本进行检测。有眼发病的患者可采集眼房水送检。有脑膜刺激症状者，可以无菌方式作腰椎穿刺，采集脑脊液送检。 观察钩端螺旋体时一般使用暗视野显微镜观察。一般培养螺旋体时常使用的培养基为Korlhof培养基，适宜的生长温度为28℃。

钩端螺旋体病是一种自然疫源性传染病，自然界中钩体可感染野生动物和家畜(鼠、猪、犬、牛、马、羊等)。钩体在其肾小管中长期繁殖，从尿排出，肾脏长期带菌和排菌的鼠类和猪是钩体的重要储存宿主和传染源。本病的发生常与某些工种有关，并有—定的季节性，常在多雨、水稻成熟田间鼠类活动频繁的夏秋季节流行。钩体具有较强的侵袭力，能通过皮肤的微小伤口、眼结膜、鼻或口腔侵入人体，迅速进入血液并繁殖。

临床上钩体病常见以下几个型：黄疽出血型、流感伤寒型和肺出血型。 三、回归热螺旋体（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中的疏螺旋体属分类其中一种）

回归热螺旋体属于疏螺旋体属，以节肢动物为传播媒介，可引起以周期性反复发作为特征的记性传染病—一回归热。其病原体有两种：

○1回归热螺旋体，以虱为媒介，引起虱传播型回归热；○2杜通疏螺旋体，以蜱为媒介，引起蜱型回归热。

四、伯道疏螺旋体（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中的疏螺旋体属分类其中一种）

引起莱姆病，经蜱传播。临床上以皮肤出现慢性游走性红斑、神经系统和心脏受损和一过性、复发性、多发性关节炎为特征的自然疫源性疾病。

中国于1985年在黑龙江林区首次发现本病（伯道疏螺旋体的引起莱姆病）。 五、梅毒螺旋体（属于螺旋体对人和动物致病的行3个属其中的密螺旋体属分类其中一种）

梅毒螺旋体是性病梅毒的病原体，属于密螺旋体属中不能培养的螺旋体，接种家免睾九或眼前房，能保持其繁殖和毒力。抵抗力弱，对青霉素、四环素、红霉素敏感。检查梅毒螺旋体最适合的标本是下疳渗出液。通常用暗视野显微镜观察（观察钩端螺旋体时一般使用暗视野显微镜观察）。人是梅毒螺旋体的惟一传染源。 第五节 支 原 体（无细胞壁是支原体的特点）

支原体是一群介于细菌、立克次体和病毒之间，能营独立生活，有细胞结构，但无细胞壁的最小的原核细胞型微生物。

其特点是：◇1没有细胞壁，◇2呈高度多形性，◇3最小的个体自径200nm左右，◇4可通过滤器，◇5在无生命的人工培养基上能生长繁殖的最小微生物。

支原体在固体培养基上生长时可形成典型的“荷包蛋”样菌落（这是支原体在固体培养基上生长时最典型的特性）。其基因组是一个环状双股DNA，

革兰染色阴性。支原体在自然界中广泛存在。污水、土壤等有腐生株，多数人和动物的病变或正常黏膜处可分得寄生株，泌尿生殖道分离率较高，

而眼标本中分离率低。营养要求比较高，大多需要胆固醇，在适宜的培养基上易分离和传代。集落小，直径大多为0.1～0.3mm。圆形透明，大多中央部分深埋于琼脂，形成明显的“油煎蛋’’状集落这是支原体在固体培养基上生长时又一个最典型的特性）。

除牛、羊、大鼠支原体以及人肺炎支原体能引起原发性疾病外，其他在致病性上尚未肯定。应与细菌L型相区别。

肺炎支原体肺炎引起原发性非典型性肺炎，(支原体)主要以飞沫形式感染，大多发生于夏末秋初，发病率以5～19岁青年最多。

支原体的诊断方法靠分离培养和血清学检测，但肺炎支原体生长缓慢，与血清学检查一样，均不能达到早期诊断的目的。

国外应用较多的是补体结合试验，双份血清抗体4倍以上升高或单份血清大于1：32可判断为阳性。

解脲支原体的基础培养基为U—9基础培养基，与一般基础培养基相比，其培养基中添加了尿素成分。 第六节 细菌药敏试验

1．稀释法(全量法)：一般采用Mueller—Hinton液体培养基(MH)。测定抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)或最小杀菌浓度(MBC)。

2．脂稀释法制备：MH（Mueller—Hinton液体培养基）琼脂平板时，当琼脂温度在50℃左右时加入抗菌药物，琼脂厚度为3mm。

3、纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer法)：纸片含药浓度的对数与抑菌环的半径平方值呈直线相关。

抑菌环直径的分界点分为四级：耐药(R)、中介度(1)、中度敏感(MS)和敏感(S)。MIC是指细菌的最小抑菌浓度，抑菌环直径越大，MIC越小。

第二节 菌落总数测定

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。

菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这—方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 一、检样稀释及培养

1、 以无菌操作，将检样25g(或m1)剪碎放子含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或

研磨做成1：10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8 000—10 000转／分的速度处理1分钟，做成1：10的均匀稀释液。

2、 用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液lml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液

3、 另取lml灭菌吸管，按上条操作顺序，做l0倍递增稀释液，如此每递增稀释1次，即换用1支1mL灭菌吸管。

4、 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。

5、 稀释液移人平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置46℃±1℃水浴保温)注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾人加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。

6． 待琼脂凝固后，翻转平板，置36温箱内培养(48℃±2℃)小时。 二、菌落计数方法

作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

三、菌落计数的报告

1．平板菌落数的选择：选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总数测定标准。

一个稀释度使用2个平板，应采用2个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可汁算半个平板后乘以2以代表全平皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有1条链，可视为1个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为1个菌落计。 2．稀释度的选择：

(1)应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。 (2)若有2个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视两者之比值来决定。若其比值小于或等于2（≤2），应报告其平均数； 若大于（＞2）2则报告其中较小的数字。

(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300【＞300 】，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于【30＜】，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之

(5)若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。 (6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

3． 菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。 第三节 大肠茵群测定

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 一、大肠菌群检验方法 (一)检样稀释

1、以无菌操作将检样25ml(g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，

经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000—10000转／分的速度处理1分钟，做成1：10的均匀稀释液。

2．用lml灭菌吸管吸取1：10稀释液lml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。

3．另取lml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释1次，换用1支lml灭菌吸管。

4．根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个

稀释度接种3管。 (二)乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在lml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lml及lml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。

每一稀释度接种3管，置36℃±1℃温箱内，培养(24℃±2℃)小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气。则可报告为大肠菌群阴性， 如有产气者，则按下列程序进行。 (三)分离培养：

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并做革兰染色和证实试验。 (四)证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃温箱内培养(24℃±2℃)小时，观察产气情况。 凡乳糖管产气、革兰染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 (五)报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。 二、粪大肠菌群检验方法

1、用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内，置44.5℃±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，

培养(24±2)小时，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℉培养18～24小时，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。 2．结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)粪大肠菌群的MPN值

第四章 免疫血清学知识 第一节：血清学：一、基础知识：

1、Ag-Ab反应结合力： 有4种力致使Ag-Ab结合，其中一以静电引力为最重要。

2、Ag-Ab反应特点（1）特异性、（2）阶段性（两个阶段）、（3）可逆性、（5）比例性（Ag与Ab结合比例以3：2为最佳）（Ag=3，Ab=2）。

3、影响Ag-Ab反应的因素：（1）温度（多数情况下反应适宜温度为37℃）、（2）PH值（一般反应适宜PH值6～8）、

（3）电解质（多用0.85%盐水）。

当温度升高反应加快，电解质浓度加大时反应敏感性升高，无电解质时Ag与Ab基本上不反应。

参加反应的Ag也有影响，Ag浓度超出适宜量使反应的敏感性下降，过量的Ab会使反应出现前滞现象。

（4）血清交叉反应：出现血清交叉反应是说明有共同抗原存在。 二、血清检验技术：

1、血清凝集反应：采用颗粒状Ag（死菌或活菌，多用死菌）进行的血清反应。 ①玻片凝集是其中一种，有许多优点，最重要的优点是报告结果快，多用于快速诊断。

②试管凝集是最多用的一种方法，从温箱中放24小时后取出反应管在室温放2个少时再判定为宜，判定凝集滴度以凝集程度为（+ + ）而定。

③协同凝集用SPA（葡萄球菌A蛋白）与IgG的Fc结合后进行的凝集反应。SPA与IgG结合具有种属性，（容）易与兔血清中的IgG结合。用此试验主要查Ag。 2、抗球蛋白试验：是用检查不完全Ab（半Ab），在试验中所用第二Ab是双价抗体。基本方法是以试管凝集试验为基础。

3、沉淀反应：其中包括①环状反应、②絮状反应、③琼脂扩散反应等。沉淀反应是用可溶性Ag。Ag-Ab沉淀反应用的电泳是琼脂电泳和对流电泳。 环状沉淀反应的沉淀环是在Ag与Ab两液面交界处形成，判定时间是3～7分钟（环状沉淀反应）。

用琼脂扩散反应做Ag分析时，其反应温度在4℃～6℃下进行为宜，一般是72小时后判定结果。（琼脂扩散反应）

用其进行诊断时多在18℃～22℃下进行，琼脂浓度多在1%～2%。

4、电泳： 用电泳做诊断多为琼脂电泳和对流电泳。这类电泳反应本质属于Ag-Ab

沉淀反应。

5、CFT（补体）： 参与CFT有两个反应系统 5种成分参加 。其中补体（CFT用的补体是豚tun鼠血清中补体）是此反应的纽带。

它（CFT）与两个系统的结合是非特异性的。在CFT中用豚鼠血清中补体，常用灭活温度是56℃ 30分钟，不同动物的血清补体灭活温度是不同的。 CFT又分为①温CFT、②冷CFT。

温CFT：是指反应温度37℃ 30分钟，主要是查IgG类Ab。反应管出现不溶血现象是阳性反应。补体是多为1：15-1：20稀释度。

冷CFT：是在4℃～6℃（琼脂扩散反应做Ag分析时温度也是4℃～6℃）进行此反应多用于查Ag。

此外，补体（CFT）还参与溶血反应和溶菌反应。 第二节免疫学基础：

抗原（Ag）：Ag是指能够刺激机体产生免疫应答（产生Ab、细胞免疫等）物质。 完全Ag是指既有免疫原性又有反应原性的物质，而只有反应原性无免疫原性的物质称为半抗原。

决定Ag特异性的最小化学亚单位称为决定基（蔟cu），又称为表位。依其与胸腺的关系又分Ti抗原和TD抗原。

Ti抗原刺激机体产生IgM抗体，TD抗原产生需有T细胞辅助。 蛋白质是抗原性最强的物质，其次是多糖、核酸、类脂是抗原性最弱物质。

人类血型抗原有A和B抗原，它们（A抗原和B抗原）刺激机体产生抗A和抗B抗体。

人类血型抗原是同种异型抗原（同一种属不同个体间的遗传标记不同）。器官移植所产生的排异反应。也是因同种异型抗原所致。

佐剂在免疫中常常采用，它主要的机制是增强机体对Ag的免疫应答。 抗体（Ab）：Ag物质刺激机体产生Ab，Ab本质是Ig（免疫球蛋白）。Ig（免疫球蛋白）分为五大类：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。

Ig（免疫球蛋白）的基本结构是：四条肽链（2条轻链-L链，2条重链-H链），由双流键连接。

L链（轻链）：可分为 可变部分（V）和恒定部分（C），即 V（可变部分）L（轻链）+ C（恒定部分）L（轻链）即VL + CL。

H链（重链）：也分可变部分（V）和恒定部分（C），即VH + CH，但CH（恒定部分、重链）部分又分为CH1、CH2、CH3。 IgM和IgE还有CH4部分。CH1与CH2区 之间为绞链区。

如果用木瓜酶水解后，将IgG水解2Fab和Fc。Fab是Ig与Ag结合部位，Fc是可结晶部分。

用胃蛋白酶水解IgG，可分为F(ab,)2和Fc部分，F(ab,)2是2个Fab连在一起的部分。

Ig（免疫球蛋白）的分类是根据H链（重链）结构特点，主要依Fc部分（CH）。Ig同种型是指H链所具有的特性。

Ig（免疫球蛋白）分型是依据L链（轻链）结构特点，可分为κ和λ型。Ig的Fc段部分可与某些细胞的Fc受体结合，如巨噬细胞。

F(ab,)2部分是与Ag结合部 ，VH （重链）+ VL（V可变部分L轻链）是F(ab,)2中的高变区，直接与Ag能结合的部位。

人类5种Ig（免疫球蛋白）各具特色：IgG-血清中含量最高；IgM-分子量最大； IgG：①在血清中含量最高；②它还是唯一能通过人类胎盘的；③IgG是抗感染的主要Ig(IgG抗病毒抗体)；○4结合补体；

○5起到条理作用；○6结合SPA（葡萄球菌A蛋白）；○7起到沉淀反应；○8中和反应；○9溶解细菌。

10H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体；○○11肥达试验IgG类H抗体出现较晚；12○IgG是人血清中的主要抗体○13 IgG是固定补体

IgM、①分子量最大；②早期多为IgM（IgM早期诊断）；③IgM是种属发育过程中最原始的Ig（早期出现抗体的是IgM）；

④IgM有很高的结合价和凝集能力。⑤IgM是动物机体在受到初次抗原刺激后最早产生的一种抗体球蛋白。

○6()抗原刺激机体产生IgM类抗体。○8肥达试验IgM类()抗体出现较早。○9 IgM是感染早期出现的抗体

IgA、①有分泌型存在；②局部Ab；③IgA抗蛋白酶的水解作用。④IgA对大肠杆菌有一定抑制作用；⑤其含量仅次于IgG。

⑥呼吸系统的非特异性防御机制机械物理性防御富含IgA

IgE、①与肥大细胞膜上Fc受体结合（结合肥大细胞）；②是血清中含量最少的一类Ig；介导第Ι型过敏反应；

IgD。①在血清中含量很少；②因其性质很不稳定、半衰期很短，所以对其了解尚少。

补体（C）：补体是存在于人和动物血清中，即可参加特异免疫又可参与非特异免疫 作用的大分子物质。它有9种成分，11种蛋白组成。

9种成分是：C1（q.r.s）、C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9。它们对温度很敏感，易破坏。

补体系统包括补体及D、P、B等因子组成，约有20种成分。 补体的激活有两个途径：（1）传统途径（第一途径）和旁路（第二途径）。 传统途径（第一途径）：可被Ag-Ab免疫复合物（IC）活化。活化顺序是：C1、C4、C2、C3、C5 C6 C7 C8 C9。

免疫系统：1、免疫组织器官：（1）中枢：骨髓、胸腺、法氏囊（禽类）； （2）周围器官：脾脏、淋巴结、皮肤免疫系统、黏膜免疫系统。

2、免疫细胞：干细胞系、淋巴细胞系（TH、TC、TS、TDH、BC、浆细胞等）、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等。

单核细胞及巨噬细胞产生IL-l。3、免疫分子：TCR、BCR、CD、MHC、Ig、补体、细胞因子（IL-l、IL-2）

五、各免疫细胞特点：1、T细胞：是由一群细胞组成。T细胞定位于淋巴结副皮质区。

可分几群，其中TH细胞是很重要的免疫细胞，

CD+4可被PHA、ConA、PWM、花生凝集素刺激活化进行有丝分裂，帮助产生Ab，司管细胞免疫。

TS细胞是抑制细胞，CD+8参加免疫调节。TC是细胞毒细胞。TH是成熟需要胸腺加工处理。

2、B细胞：B淋巴细胞主管体液免疫细胞。表面有抗原抗体受体（SmIg）。B细胞成熟骨髓中（相当于禽类法氏囊）。

未成熟的B细胞最初可查到Ig的u链，活化B细胞可衍（yan）变成浆细胞，浆细胞能产生Ab和分泌Ab。

PWM是可以刺激B细胞有丝分裂。人类外周血中T细胞和B细胞之比为2：1。

3、单核类细胞：无Ag受体，但能处理Ag，加工Ag，并向T细胞递呈Ag。 六、过敏反应（变态反应）：国际公认的过敏反应（变态反应）是四个型： Ⅰ型（速发型）、Ⅱ型（溶细胞型）、Ⅲ型（免疫复合物或血管炎型）Ⅳ型（迟发型）。

Ⅰ型（速发型）：是由IgE抗体所致，IgE与肥大细胞的IgE的Fc受体结合产生一系列变化，出现Ⅰ型过敏。

如青霉素过敏（皮内注射过敏原），患有慢性寄生虫感染患者。IgE抗体升高显著。

Ⅱ型（溶细胞型）、Ⅲ型（免疫复合物或血管炎型）：过敏系由IgM、IgG抗体及补体等参与介导。

Ⅳ型（迟发型）：过敏反应是由T细胞中TDTH细胞释放淋巴因子所致。如结核菌素过敏试验（皮内注射过敏原）

七、毒素变成类毒素：使毒素的毒力减弱，病理作用减弱，但免疫原性仍保留。

第五章 病毒及立克次体检验 第一节：病毒检验： 一、病毒学总论：

（一）、病毒的特点：病毒属于微生物界，其不同于其他微生物的特性如下：

1、病毒一般只含有一种核酸DNA或RNA，而其它微生物，包括细菌、支原体、衣原体、立克次体，则都同时含有两种核酸。

2、病毒通过基因组复制和表达产生子代病毒的核酸和蛋白质，随后装配完整的病毒粒子。

3、病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并借助宿主细胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸编码的蛋白质，乃至直接利用细胞成分。 4、某些RNA病毒的RNA经反转录合成互补DNA（cDNA），与细胞基因组整合，并随细胞DNA复制而增殖，即所谓的DNA前病毒。 5、病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，因此对于干扰微生物的这些代谢过程而影响微生物结构和功能的抗生素，具有明显的抵抗力。

一个简单的病毒粒子，实质上只是一团遗传物质（DNA或RNA）和它外围的一层蛋白外壳。这层蛋白外壳就是衣壳，

衣壳和核酸一起总称为核衣壳。病毒不含氨基酸，这是病毒与其他微生物，包括细菌、衣原体、立克次体等又一明显区别。

（二）、病毒的分类和命名：病毒的分类系统采用 目、科、亚科、属和种的等级制度。

属名应是一个以“virus”结尾的单词；亚科“virinae”； 科“viridae”；目“virales” 结尾的单词。

动物病毒“种”的名称大多引用其所引起疾病的名称，后加“病毒”，

兽医学上则常再加上宿主（动物的名称）种类，也有的在病名前再加最初发现该病毒的地名。

毒珠名称至少应能反映该毒珠的分离地点和时间以及该毒珠的类别。 根据其病毒核酸组成还可以将病毒分成DNA病毒和RNA病毒。 RNA病毒可分为（1）正链RNA病毒；（2）负链RNA病毒，

正链RNA病毒可以直接呈现mRNA的作用，同时又是合成互补链的模板； 一般情况下，正链RNA病毒的基因组RNA具有感染性。

负链RNA病毒不能直接呈现mRNA的作用，即不能直接指导合成互补链。

（三）、病毒的增殖：病毒缺乏自身增殖所需的完整酶系统，增殖时必须依靠宿主细胞合成核酸和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成分，这就决定了病毒在细胞内专性寄生的特性。

病毒的增殖过程大致可以分为：（1）吸附与侵入、（2）脱壳、（3）病毒成分的合成及装配、（4）释放等4个主要阶段。 二、病毒学技术：

（一）病毒的培养：（1）实验动物、（2）鸡胚、（3）体外培养的器官、（4）细胞，这4种都可以作为人工增殖病毒的基本工具。

而大量病毒的，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。

1、组织培养：病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象

以及通过“指示病毒”的干扰等方法加以识别。组织培养用的玻璃器皿要用（硫酸、重酪lao酸钾）。

常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助生长因子等。

常用的人工综合营养液为：MEM和RPM1640。

用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入○1适量血清和谷氨酰胺溶液，○2还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，

○3加入碳酸氢钠溶液修正PH，○4根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的PH缓冲能力。

能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA， EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。

动物血清中具有细胞生长所必须的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，且有很强的酸碱缓冲能力。

细胞培养液在细胞培养过程中可分为（1）细胞生长液（2）细胞维持液两种。 细胞生长液：是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；

细胞维持液：用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。

细胞生长适宜的PH范围是 PH 7.2～7.6。细胞培养技术全过程的关键是防止污染。

2、 细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作，二甲基亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂，

含10%二甲基亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。 3、 病毒学上常用的细胞类型可分为（1）原代细胞、（2）二倍体细胞、（3）传代细胞，三大类，

原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。 4、细胞的纯化：细胞的纯化可以用细胞克隆技术。

克隆是指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。 （二）、病毒病的常规实验室诊断：

1、病毒的分离和鉴定：（P219）病毒对细胞的感染性具有严格的选择性和特异性，因此用组织培养细胞接种病毒必须首先选择敏感细胞。

（1）病毒增殖的判定：（略）（2）细胞病变（CPE）：大部分病毒在敏感细胞系均可出现CPE（细胞病变），CPE（细胞病变）可以表现为严重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成合胞体或无明显的细胞变化等。CPE（细胞病变）经常具有病毒“种”的特性，因此常常作为病毒坚定依据。

（3）病毒蚀(shi)斑技术（又称空斑）：病毒蚀(shi)斑是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶，

主要用于病毒的纯化或病毒悬液中感染病毒含量的测定。（用病毒蚀斑技术测定含量-病毒纯化或病毒悬液中感染的病毒）

（4）病毒感染力的滴定：有两种，一种方法是用实验动物测定LD50(半数致死量)；另一种方法是在组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量。 （5）病毒的保存：分离或鉴定后的病毒经过冷冻干燥后可以长期保存。 2、免疫-血清学实验：免疫-血清学实验是利用抗原和抗体的特异性结合的原理进行的，主要用于两个目的：

从病料获得病毒株后，应用已知的抗病毒血清或单克隆抗体进行免疫-血清学试验，鉴定病毒的种类乃至型别；

②由发病动物采集血清标本，应用全病毒或特异性病毒抗原，测定发病动物体液中的特异性抗体，或进一步比较发病动物的急

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