总黄酮含量测定

1 总黄酮含量测定

1． 1 紫外可见分光光度法严赞开［1］综述了紫外分光光度法测定植物中黄酮含量的方法． 重点介绍了单波长法、差示法、双波长法、三波长法、导数法等紫外分光光度法测定黄酮类化合物含量的原理及分析特性。

1． 1． 1 紫外可见分光光度法: 是以分子吸收光谱为基础的紫外－ 可见分光光度法，利用某些物质的分子在峰带I( 300 ～400 nm) 和峰带Ⅱ( 220 ～ 280 nm) 光谱区的吸光度来进行分析测定的方法。具有简便、适用性广、准确度、精密度和重现性较好等特点，在总黄酮含量分析中发挥着重要作用。 1． 1． 2 比色法: 是一些药典最常用的总黄酮含量检测方法，它主要以Al( NO3 ) 3 为显色剂，在碱性条件下，利用其与总黄酮形成红色螯合物为特征。常用于总黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al( NO3 ) 3、AlCl3 等。

1． 1． 3 差示分光光度法简称ΔA 法: 使用稍高于样品或稍低于样品的标准作参比，测量样品和参比间的相对吸光度。而此相对吸光度又与样品和参比间的浓度差成比例关系，借差示工作曲线而求出样品的含量。

1． 1． 4 双波长和导数分光光度法: 用于测定吸收光谱曲线重达的混合物的含量而不须用解联立方程，还可分析高浓度及混浊样品，其灵敏度和准确度比普通分光光度法好。在选择波长时，原则上除了要干扰物有相等吸光度外，还要求两波长比较接近，被测组分在该两波长处的摩尔吸收系数相差大些，这样方法的灵敏度会更高。如果将上述双波长分光光度计上两个波长尽可能指近，使只相差1 ～ 2 nm，并且同时进行扫瞄，能得到试样一阶导数吸收光谱-吸光度对波长的变化率曲线，即导数分光光度法。

2 药理作用

2． 1 镇痛作用赵铁华等［4］研究结果显示灌胃、腹腔注射、皮下注射适宜剂量的黄芩茎叶总黄酮，对实验动物经化学和热刺激导致的疼痛反应皆有一定的抑制作用，其镇痛作用机制与中枢作用相关。银杏总黄酮( TFG) 腹腔内注射可显著抑制甲醛致小鼠疼痛反应，延长小鼠舔足潜伏期并减少小鼠扭体反应数。 2． 2 对心血管系统的作用

2． 2． 1 对抗心肌损伤的保护作用: 李乐等［5］研究发现绞股蓝总黄酮能减轻犬心肌梗死时的心肌缺血程度，降低缺血范围和心肌酶学指标的活性，可保护缺血心肌。广枣总黄酮( TFCA)对阿霉素( ADR) 引起大鼠心肌过氧化损伤具有保护作用。水杉总黄酮可在不明显降低血压的情况下，防止肾性高血压大鼠左心室肥厚的发生。银杏叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注血管内皮损伤有保护作用，对抗心肌缺血所引起的心肌电生理的变化，从而预防心肌缺血所致的心律失常的发生。蒲黄总黄酮对实验性心肌缺血犬心肌具有保护作用［6］。黄蜀葵花总黄酮 药理性预适应可通过抑制心肌脂质过氧化、抑制心肌炎症反应，对缺血; 再灌注损伤的心肌具有保护作用; 显著降低心脑组织中丙二醛和NO 含量，提示黄蜀葵花总黄酮对心脑缺氧有显著保护作用; 对小鼠急性心肌缺血、缺氧损伤具有保护作用［7］。

2． 2． 2 抗心率失常作用: 苦参总黄酮能明显对抗乌头碱、哇巴因及氯仿诱发的心率失常。黄芩茎叶总黄酮对实验性心率失常有显著拮抗作用。

2． 2． 3 降血脂: 银杏叶总黄酮具有降低甘油三酯和胆固醇，升高高密度脂蛋白胆固醇和降低低密度胆固醇的作用。抗动脉粥样硬化作用实验显示麦胚总黄酮类提取物( FEWG) 能显著提高实验性高脂血症大鼠血高密度脂蛋白胆固醇含

量，同时显著降低血清总胆固醇和三酰甘油含量［6］。荞麦种子总黄酮能抑制喂饲固醇和高脂食物大鼠血清总胆固醇和三酰甘油的升高，抑制肝脏脂质过氧化。山楂总黄酮对氧化型低密度脂蛋白( oxLDL) 诱导的人内皮细胞损伤具有显著的拮抗作用，对氧化型低密度脂蛋白促MC-EC 黏附作用有显著的抑制性，降低动 脉粥样硬化发生的危险性，起到预防动脉粥样硬化发生发展的作用。

2． 2． 4 抗高血压、血管壁扩张作用: 银杏叶总黄酮其对血管紧张素转化酶活性具有明显的抑制作用。并对轻、中、重度妊娠高血压患者的血压均有下降，内皮素活性及NO 含量降低，尿蛋白减少［8］。淫羊藿总黄酮对大鼠血清中内皮素有抑制作用，一氧化碳含量明显降低，提示淫羊藿总黄酮扩张血管。

2． 3 抗凝血作用银杏黄酮、蚓激素酶均具有很好的抗凝作用，但凝激酶溶栓效果优于银杏黄酮，两者合用后溶血作用无加强，但具有较好的抗凝效果［9］。水杉总黄酮有抗血小板聚集活性，改善血液流变性的作用，穿心莲黄酮可明显抑制二磷酸腺苷，花生四烯酸和肾上腺素诱导的血小板聚集，明显降低凝血酶诱导的GMP-140 水平，抑制AA 诱导的血小板TXB2 的释放，并可明显升高血小板内cAMP 的含量。

2． 4 利胆及肝脏保护作用各种黄酮类化合物对化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤、酒精性肝损伤、缺血/再灌注性肝损伤等实验性肝损伤均有不同程度的保护作用［10］。知母总黄酮对溴酸钾诱发的小鼠肝损伤具有一定的保护作用，可以明显降低因溴酸钾引起的小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶水平，保护因溴酸钾诱发的肝损伤其作用机制可能部分来自于清除自由基和抑制脂质过氧化过程［11］。苦菜总黄酮对四氯化碳、乙醇所致肝损伤有明显保护作用，提示可能与苦菜总黄酮减少肝脏谷胱甘肽耗竭，抑制肝脂质过氧化作用有关。

2． 5 抗氧化、清除氧自由基作用黄欣等［12］研究发现枸杞总黄酮能明显延长小鼠力竭游泳运动时间，抑制丙二醛的产生及提高小鼠体内抗氧化酶活性，说明枸杞总黄酮具有提高小鼠运动耐力及清除活性氧的作用。苦荞麦麸皮类黄酮与天然超氧化物歧化酶在清除氧自由基方面有着相同的作用一枝蒿总黄酮对的作用表现高浓度清除，低浓度增强的双向作用; 对( ·OH) 自由基的作用始终表现为浓度依赖性地清除作用，而且清除作用很强［13］。另有研究发现竹叶的总黄酮含量及其清除活性氧自由基的能力均与银杏叶具有可比性。黄芪总黄酮在实验中对( ·OH) 及( O2) 均有较强的清除作用，且清除能力与浓度呈明显的显效关系。 2． 6 抗肿瘤作用黄酮类化合物抗肿瘤作用的靶点包括细胞周期蛋白依赖性激酶、硫氧还蛋白还原酶、基质金属蛋白酶、丝裂原激活的蛋白激酶等。肿瘤细胞凋亡研究依据: ( 1) 黄酮类化合物抑制细胞增殖，主要是使细胞周期停止，对肿瘤细胞有细胞毒作用，而对正常细胞无毒性和致突变作用，反而有抗氧化和正向的免疫调节作用; ( 2) 黄酮类化合物促进肿瘤细胞凋亡; ( 3) 黄酮类化合物能抑制细胞信号转导过程中的酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇3 激酶活性; ( 4) 黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化压力和促进抑癌基因表达而抑制癌基因表达的作用。汉黄芩素是从中药黄芩中提取分离得到的一个化合物，研究表明其能促进鬼臼毒甙诱导的HL260、Jurkat 和肺癌细胞的凋亡。芫花根总黄酮对小鼠S180 肿瘤生长有显著的抑制作用，其抗肿瘤活性是通过选择性杀死肿瘤细胞和提高外周血淋巴细胞数量、促进淋巴细胞的增殖和提高NK 细胞的杀伤活性来实现的［14］。木犀草素具有很强的诱导肝癌细胞凋亡活性。

2． 7 对脑血管疾病的作用李晓红等［15］银杏叶总黄酮对局部缺血再灌注脑组织中NR1mRNA 的表达增强，与细胞凋亡密切相关，银杏叶制剂可以明显抑制

NR1mRNA 的表达，减轻细胞凋亡。文继月等［16］黄蜀葵花总黄酮预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤具有缺血预适应样的保护作用; 其机制可能与促进NO 合成及抑制前列腺素E2产生有关。山楂叶总黄酮可抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡，其机制可能与抑制线粒体细胞色素C 通路的凋亡有关［8］。 2． 8 其他

2． 8． 1 对神经系统的作用: 黄酮对M-胆碱能抑制樟柳碱所致小鼠脑记忆获得障碍、蛋白生物合成抑制剂环己酰亚胺致小鼠脑记忆巩固障碍、中枢抑制剂乙醇致小鼠脑记忆再现障碍、小鼠脑缺血再灌注致学习记忆功能障碍，均有明显的改善作用，能显著提高小鼠的近期记忆和长期记忆功能。

2． 8． 2 延缓衰老作用: 淫羊藿总黄酮对于皮质酮大鼠T 细胞过度凋亡均有明显下调作用，并能对促凋亡及抗凋亡基因群进行适度地调控。蜂胶黄酮既能明显提高脑组织抗氧化酶的活性，又同时显著降低脑组织NO 含量，提示蜂胶黄酮可以抑制NO 的细胞毒作用，达到延缓衰老之目的。

2． 8． 3 对骨科方面的作用: 淫羊藿总黄酮具有促进体外成骨细胞增殖及分化成熟的作用，还可提高去势大鼠骨密度，对骨质疏松起防治作用。杜仲总黄酮能直接促进体外成骨细胞的增殖。野菊花总黄酮可恢复大鼠滑膜细胞具分泌功能细胞器形态，降低滑膜细胞分泌炎性介质的功能。

2． 8． 4 对免疫方面的作用: 淫羊藿总黄酮对免疫功能低下小鼠有良好免疫促进作用。黄芩茎叶总黄酮对小鼠的特异性和非特异性免疫功能皆有一定的影响。 2． 8． 5 改善肾功能作用: 黄蜀葵花抑制肾内髓ATP 酶活性，从而减少肾小管对钠的重吸收，发挥利钠利水效应。

2． 8． 6 抗乙型肝炎病毒( hepatitis Bvirus，HBV) 作用: 黄蜀葵花总黄酮中提取的金丝桃苷在体内外均有抗HBV 的作用，且呈剂量依赖性。

2． 8． 7 修复口腔黏膜作用: 黄蜀葵花中的多种黄酮类成分具有抑菌、镇痛及抗炎消肿的作用，能治疗口腔溃疡，对疼痛也有较好的缓解作用。沙棘叶总黄酮对细菌有较强的抑制作用，在相同时间内，总黄酮提取液的浓度越大，抑菌率越大。同一浓度的沙棘叶总黄酮的作用时间越长，其抑菌率也越大［17］。 参考文献

1 严赞开． 紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法． 食品研究与开 发，2007，28: 164-165．

4 赵铁华，邓淑华，石艳华，等． 黄芩茎叶总黄酮镇痛作用的实验研究． 中国中医药科技，2001， 12: 23．

5 李乐，孙晓东，高小利，等． 绞股蓝总黄酮对犬急性缺血心肌的保护 作用． 中国病理生理杂志，2008，24: 388-389．

6 章红燕，侯桂兰，何福根． 银杏叶总黄酮和银杏内酯对心脑血管作用 的研究进展． 浙江临床医学， 2008， 10543．

7 范丽，袁丽萍，陈志武，等． 黄蜀葵花总黄酮对小鼠急性心肌缺血缺 氧损伤的保护作用． 中国药房，2005， 16: 176．

8 纪影实，曲极冰，李红等． 山楂叶总黄酮对大鼠脑缺血再灌注后细胞 凋亡的保护作用． 吉林大学学报( 医学版) ，2008， 34: 590-592．

9 陈健康，王雷，李珂，等． 银杏黄酮与蚓激酶的抗凝溶栓作用． 心脏杂 志，2001，13: 3081．

10 郭菁菁，杨秀芬． 黄酮类化合物对动物实验性肝损伤保护作用的研 究进展． 中国药理学通报，2008，24: 5-10．

11 李满妹，江涛，黄杰昌． 知母总黄酮对溴酸钾诱发小鼠肝损伤的保 护作用． 中草药， 2008，39: 252-253．

12 黄欣，赵海龙． 枸杞总黄酮对运动小鼠腓肠肌抗氧化能力的影响． 现代中西医结合杂志，2008，17: 2280-2281．

13 吴冰，徐贵发，赵秀兰，等． 麦胚黄酮提取物对荷瘤大鼠的抗氧化作 用． 卫生研究，2001，30: 2151．

14 魏志文，高晓雯，郑维发． 芫花根总黄酮抗肿瘤活性研究． 解放军药 学学报，2008，24: 116-120．

15 李晓红，张峰，赵明霞，等． 银杏叶制剂对大鼠脑缺血再灌注后N-甲

基-D-天冬氨酸受体表达的影响及脑保护作用． 神经科学通报，2005，210-213．

16 文继月，陈志武． 黄蜀葵花总黄酮预处理对大鼠脑缺血再灌注性损 伤的保护作用． 安徽医科大学学报，2006， 41: 667．

17 张益娜，翁琴． 沙棘叶总黄酮的抑菌性研究． 农产品加工·学刊， 2008， 25: 25-27．

1. 3 标准曲线及回归方程确定 以芦丁为对照品,用

Al(NO3)3-NaNO2比色法求取总黄酮标准曲线。准确称取干 燥至恒重的芦丁对照品0.152 0 g,用30%的乙醇溶解后,转 入250ml容量瓶中,用30%的乙醇定容为0.282 mg/ml。准 确移取上述芦丁溶液0, 0. 40, 0. 80, 1. 20, 1·60, 2·00, 2. 40和 2.80ml于25ml锥形瓶中,加30%的乙醇至12. 5 m,l加入 0·8ml5%的NaNO2溶液,摇匀,放置5min,加入0·8 ml5% 的Al(NO3)3溶液,放置6 min,再加入5ml4% NaOH溶液, 用30%的乙醇定容至刻线,摇匀放置10min,显色稳定后,再于 510 nm处测定吸收度,平行测定3次,取平均值,以质量浓度为 横坐标,吸光度值(A值)为纵坐标绘制标准曲线。回归方程: A=0.011 01C+0.000 89(R=0.999 1)。

1.4 总黄酮的紫外分光光度法测定 准确量取提取液10ml 于25 ml锥形瓶中,加30%的乙醇至12. 5 m,l摇匀后加入 0·8ml的5%NaNO2溶液,放置5 min,加入0·8 ml的5% Al(NO3)3溶液,摇匀后放置6min,加5ml4%的NaOH溶液, 用30%乙醇稀释至刻线,放置10min后,于510 nm处测定吸 收度,计算总黄酮含量。 总黄酮的百分含量(% )=

样品中总黄酮的含量(mg/ml)×稀释倍数×体积(ml)×100% 样品重(g)

三氯化铝显色分光光度法测定中药中总黄酮的 含量,是根据黄酮类化合物分子中含有的3-羟基、 4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基可以与铝盐 定量结合,形成有色络合物的原理,通过测定有色 络合物的吸光度,来测定中药中总黄酮含量的方法

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