天然产物实验指导

实验一水蒸气蒸馏法提取萜类及挥发油

一、实验目的

1、了解水蒸汽蒸馏的基本原理和应用，掌握水蒸汽蒸馏的方法。 2、掌握萜类和挥发油的提取原理及方法。

二、基本原理

水蒸汽蒸馏的操作是将水蒸汽通入有机物中，或将水与有机物一起加热，使有机物与水共沸而蒸馏出来的过程。水蒸汽蒸馏是分离和提纯有机物质的常用方法。当两种互不相溶的液体混合在一起时，混合物的蒸气压应为各组分蒸气压之和。由于两种组分互不相溶，彼此相互影响很小，混合物中每一组分在某温度下的分压等于其纯态时在该温度下的蒸气压。当混合物受热至各组分的蒸气压之和等于外界大气压时混合物即沸腾。

例如，把苯胺和水的混合物加热至98.4℃，混合物开始沸腾。因为在98.4℃时，苯胺的蒸气压为42mmHg，水的蒸气压为718mmHg，两者相加等于760mmHg。显然，苯胺—水混合物的沸点既低于苯胺的沸点（184.4℃），也低于水的沸点。因此，沸点高于100℃的有机物，利用水蒸汽蒸馏，可以在低于100℃的温度下蒸馏出来。根据气体分压定律，水蒸汽蒸馏的混合蒸气中个别气体分压（PA、P水）之比等于它们的摩尔数之比（nA、n水表示这两种物质在一定容积的气相中的摩尔数），即：PA：P水= nA：n水，因为馏出液是由蒸气冷凝而来的，馏出液中A与水的摩尔数之比同样是nA：n水。而nA = WA / MA，n水= W水/ M水，（MA、M水为A和水的分子量；WA、W水为A和水的重量）。因此有：WA/ W水= (MAnA) / (M水n水) = (MAPA) / (M水P水)由上式可见，馏出物中有机物和水的相对重量与其蒸气压和分子量成正比。式中P 水可通过手册查得，PA可近似地以大气压与P水之差计算（PA=P大气－P水），P大气可由气压计上读得。

例如，将苯胺与水的混合物进行水蒸汽蒸馏，混合沸腾（98.4℃）时，查水的蒸气压为718mmHg，大气压为760mmHg，P苯胺= 760－718 = 42mmHg。苯胺的分子量为93，所以馏出液中苯胺与水和重量比为：W苯胺/ W水= （93×42）/（18×718）=1 / 3.3，即每蒸出3.3g水能够带出1g 苯胺。由于苯胺略溶于水，这个计算所得的仅为近似值。

从以上公式和计算可以看出，水蒸汽蒸馏的效率与有机物的分子量MA和蒸气压PA有关，MA愈大；PA愈高，水蒸汽蒸馏的效率也愈高。但由于分子量愈大的物质其蒸气压愈低，因而实际上很难两全。

由上述原理可见，使用水蒸汽蒸馏分离提纯有机物应具备以下条件：

(1) 不溶于水或难溶于水；

(2) 与水长时间煮沸不发生化学变化；

(3) 在100℃左右，必须具有一定的蒸气压（至少5mmHg 以上，（一般不少于1.3332 kPa）。）；

水蒸汽蒸馏常用于下列几种情况：

(1) 某些沸点高的有机物，在常压下蒸馏虽可与副产品分离，但其本身易破坏； (2) 混合物中含有大量树脂或不挥发性杂质，采取普通蒸馏、萃取等方法都难以分离； (3) 从较多固体反应物中分离出被吸附的液体； (4) 从天然物中提取精油等。

三、基本操作

1、水蒸汽蒸馏装置

如图所示，主要由水蒸汽发生器，长颈圆底烧瓶、直形冷凝管和接受器组成。水蒸气蒸馏有两种方法：—种是将水蒸气发生器产生的水蒸气通入盛有被蒸物的烧瓶中，使被蒸物与水一起蒸出；另一种方法是将水加入到装有被蒸物的烧瓶中，与普通蒸馏方法相同，直接加热烧瓶，进行蒸馏，这是一种简化了的水蒸气蒸馏方法；当蒸馏时间较短，不需耗用大量水蒸气时，可采用这种方法。

（1）水蒸汽发生器A

是金属制品，也可用圆底烧瓶代替。器内盛水约一半（1/2-2/3）。长玻璃管B 为安全管（0.5-1m），管的下端几乎插到发生器的底部（距底部1cm）。当容器内气压太大时，水可沿着玻璃管上升以调节内压。如果蒸馏系统发生阻塞，水便会从玻璃管的上口喷出，此时应检查圆底烧瓶内的蒸气导管下口是否被堵塞。 （2）长颈圆底烧瓶D

是蒸馏器（加入样品体积不超过1/3），用铁夹在颈下部夹紧，并和桌面成450角，以免飞溅起的液体被蒸气带进冷凝管中。瓶口配双孔软木塞，一孔插入水蒸汽导管C（弯成约125°

角与T形管相连），其末端应弯曲，使之垂直正对瓶底中央并接近瓶底，以便水蒸汽和被蒸馏物质充分接触并起搅动作用。此管的外径一般不小于7mm，以保证水蒸汽畅通。另一孔插入水蒸汽导出管E（为30°角），此管应略为粗一些，其外径约为10mm，以便蒸气能畅通地进入冷凝管中。若管E的直径太小，蒸气的导出将受到一定的阻碍，这会增加烧瓶D 的压力，导管E在弯曲处前的一段应尽可能短些，在弯曲处后一段则允许长些，因它可起部分的冷凝作用。

由于许多反应是在三口瓶中进行的，直接用该三口瓶作为水蒸气蒸馏的蒸馏瓶就可避免转移的麻烦和产物的损失。 （3）长的直型冷凝管F

可以使蒸气充分冷却。由于水的蒸发热较大，所以冷却水的流速也宜稍大一些。 （3）T 形管

发生器A的支管和水蒸汽导入管C 之间用一个T 形管相连接，在T 形管的支管上套一段短橡皮管，用螺旋夹旋紧，打开螺旋夹，可以及时放掉蒸气冷凝形成的水滴。在操作中，如果发生不正常现象，应立刻打开T 形管的夹子，使之与大气相通。 2、其它连接方法

A—水蒸气发生器；B—液面计；C—安全管；D—T形管；E—弹簧夹；F—蒸馏瓶；G—导气管；H—Y形管；I—蒸馏头；J—直形冷凝管；K—尾接管；L—接收瓶

3、操作

仪器安装好后，把要蒸馏的物质倒入烧瓶D 中，其量约为烧瓶容量的1/3，操作前，水蒸汽蒸馏装置应经过检查，必须严密不漏气。开始蒸馏时，先把T 形管上的夹子打开，用直接加热法将发生器内的水加热至沸。当有大量的水蒸汽从T 形管的支管流出时再旋紧夹子，让水蒸汽通入烧瓶中，这时可以看到瓶中的混合物翻滚不息，不久就会在冷凝管中出现蒸气冷凝为乳浊液，流入接受器。调节火焰，使瓶内混合物不致飞溅得太厉害，并控制馏出液的速度约为2～3 滴/s。为了使水蒸汽不致在烧瓶内过多的冷凝，（如被蒸馏的物料较多，温度又较低），可先在圆底烧瓶下放一石棉网，用小火加热。在操作时，要随时注意安全管中的水柱是否发生不正常的上升现象以及烧瓶中的液体是否发生倒吸现象。一旦发生这种现象应立刻打开T 形管上的夹子，移去火源，找出发生故障的原因，才可继续蒸馏。当馏出液澄清透明不再含有有机物质的油滴时，一般即可停止蒸馏。此时应首先打开T形管的夹子，然后移去火源，否则D中的液体会倒吸到A中。蒸馏期间，应及时排出T形管中冷凝水。

四、仪器药品

1、仪器设备

水蒸馏发生器，长颈圆底烧瓶，蒸馏装置（减压），直形冷凝管，接引管，长玻璃管，T 形管，橡皮管（附螺旋夹），三角烧瓶，分液漏斗、研钵等。 2、试剂

蒸馏样品（八角茴香或橙皮），二氯甲烷，无水亚硫酸钠。

五、实验步骤

1、设备安装 参照实验原理部分。 2、样品准备

（1）10g干果（固体物质）于研钵中粉碎，倒入蒸馏瓶，加入蒸馏水30mL。 （2）2-3个橙子皮，剪碎，加入到蒸馏烧瓶，并加入水约30mL。 3、水蒸汽蒸馏

先把T形管上的夹子打开，加热水蒸汽发生器使水迅速沸腾，当有水蒸汽从T形管的支管冲出时，再夹上止水夹，让水蒸汽通入烧瓶中，与此同时，接通冷却水，用100mL 三角烧瓶收集馏分。蒸馏期间，应及时排出T形管中冷凝水。当馏分澄清透明不再有油状物时，即可停止蒸馏，先打开止水夹，然后停止加热，把馏分倒入分液漏斗中，静置分层，将水层弃去。（以下为选做部分）

4、收集馏出夜60-70mL，于分液漏斗中每次用10mL二氯甲烷萃取3次，合并。倒入锥形瓶中，加入适量无水亚硫酸钠干燥30min以上，除去部分水分。

5、干燥完毕的样品，于50mL蒸馏烧瓶水浴加热蒸馏（二氯甲烷沸点40.4℃），待快完毕后，改用水泵减压蒸馏。除去残留的二氯甲烷，留下橙黄色油状液体（橙皮产物）。

六、思考题

1、与普通蒸馏相比，水蒸汽蒸馏有何特点？在什么情况下采用水蒸汽蒸馏的方法进行分离提取？

答：与普通蒸馏相比，水蒸汽蒸馏多了一个水蒸汽发生装置，蒸馏部分不再保持垂直，而是倾斜30~45°。其余部分一样。使用水蒸汽蒸馏提纯的有机物应具备下列条件：不溶或难溶于水；与水长时间煮沸不发生化学反应；在1000C左右时，待提纯物应具有一定的蒸汽压。 2、安全管为什么不能抵至水蒸汽发生器的底部？ 答：安全管是用来调节水蒸汽发生器内部的压力，内部 压力过大，水就会从安全管的上口喷出。如果抵至发生器 的底部，则安全管失去调节压力的作用。

3、蒸馏过程中若发现水从安全管顶端喷出或发生倒吸现象，应如何处理？

答：应迅速打开螺丝夹，让体系与大气相通。进而再进一步检查导致压力过大的原因，排除故障后，继续实验。

实验二人参中人参皂苷的提取分离及鉴定

一、实验目的

1、通过实验进一步掌握三萜类化合物的理化性质及提取、分离和检识方法。

盖紧瓶塞保存，备用。

（2）蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶中，冰箱内保存备用。 5.2测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）

（1）样品提取：取适量样品，相当于原样1～5g（含胡萝卜素约20～80μg）匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，置100ml带塞锥形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100ml5%硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10ml丙酮--石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。如此提取2～3次，直至提取液无色为止。

植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品（<10g），加脱醛乙醇30ml，再加10ml1:1氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。

（注：原国标方法中，不是所有的样品均进行皂化处理。但是许多植物性样品由于细胞壁较厚，在匀浆或研磨过程中不易完全破坏，使胡萝卜素无法完全释放。并且尽管植物性样品中脂肪含量较少，但仍含有一定脂质成分，如果不进行皂化，会出现提取不完全和提取时出现乳化现象；浓缩时残留脂质，使定容体积不准确；纸层析展开不完全，造成测定结果偏移。所以建议除酒类、饮料外所有样品均进行皂化处理。）

（2）洗涤：将提取液静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15ml，直至下层水溶液清亮为止。 将皂化后样品提取液用水洗涤至中性。

将提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。（注：经过无水硫酸钠辅助过滤，提取液中应不含水分。）

（3）浓缩与定容：将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60℃，蒸发至约1ml时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00ml石油醚定容，备层析用。 （4）纸层析（滤纸先在饱和水蒸气的空气中吸收水分后(一般吸收约70％)，其一部分生成水合纤维素配位化合物，固定在滤纸上作固定相）

点样：在18cm×30cm滤纸下端距底边4cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点，吸取0.100～0.400ml浓缩液（6.3）在AB和CD间迅速点样。（注意：保持滤纸干燥，点样应该快速细致，在基线上形成细窄直线）

展开：待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。（注：层析缸应事先用石油醚饱和，并且防止水分进入。）

洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入试剂中。

（5）比色测定：用1cm比色杯，以石油醚调零点，于450nm波长下，测吸光度值，以其值从标准曲线上查出β胡萝卜素的含量，供计算时使用。

（6）标准工作曲线绘制：取β胡萝卜素标准使用液（浓度为50μg/ml）1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00ml，分别置于100ml具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行提取、洗涤、纸层析等操作，点样体积为0.100ml，标准曲线各点胡萝卜素含量依次为2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00μg。为测定低含量样品，可在0至2.50μg间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 6.计算

X2=

c ×

V2 V1

×

100 m

×

1 1000

………………（2）

式中： X2--样品中胡萝卜素的含量，以β胡萝卜素计，mg.100g； c --在标准曲线上所查得的胡萝卜素含量，μg； V1--点样体积，ml；

V2--样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，ml； m --样品质量，g。 7.注意事项

同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值≤10%。 二、柱色谱法 1. 原理和适用范围

同纸层析法，只是将纸层析换成中性氧化铝柱层析。 2.试剂

（1）中性氧化铝：80～100目。用前180℃烘干4小时至恒重。 （2）其余试剂同纸层析法。 3.仪器及设备

（1）色谱柱：为1.0cm×25cm的玻璃柱，底端收缩变细，并有一活塞，用于调控液体流速；距底端上1cm处有一筛板，孔径为16～30μm。用前需干燥。 （2）其余设备同纸层析法。 4.操作步骤

4.1样品采集和处理同纸层析法。 4.2测定步骤

（1）样品提取、洗涤等步骤同纸层析法。 （2）将洗涤后提取液浓缩并定容至10ml。

（3）柱色谱：将已干燥的中性氧化铝浸泡于石油醚中，以湿法填充色谱柱至高度为15cm，其上端加2cm无水Na2SO4，使石油醚自由流下，保证其水平高于Na2SO4平面0.5cm。（注意色谱柱填充时应避免水分，不要有气泡进入。）将样品提取液加入色谱柱上，自由流下，待提取液流至柱面时，分次加入石油醚2ml，洗涤柱壁，再加入石油醚洗脱，收集流出液至黄色带全部流出。流出液经60℃水浴减压蒸馏后，N2吹干，定容。 （4）比色法测定同纸层析法。 5.注意事项

（1）柱色谱法的优点是在测定胡萝卜素的同时可测定其他类胡萝卜素和色素。类胡萝卜素、色素和胡萝卜素的极性不同，胡萝卜素极性最小先被极性小的石油醚洗脱，增加洗脱液极性（如加入乙醚、丙酮）可先后将极性稍大的类胡萝卜素（如叶黄素、叶红素）、叶绿色洗脱。 （2）纸层析法和柱色谱法均不能区分α-、β-和γ-胡萝卜素，虽然标准品为β-胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。不过天然食品中大部分为β-胡萝卜素，对结果影响不大。两种方法测定结果相当。

（3）HPLC的原理、适用范围、样品前处理及操作同纸层析法，浓缩定容后的样品液不经过纸层析，而进入HPLC的C18柱，经流动相洗脱后，用紫外分光光度计检测。HPLC可分离α-、β-胡萝卜素并可同时测定多种脂溶性维生素，是目前国内外常用的测定方法。

中草药化学成分检出试剂配制法 一、生物碱沉淀试剂：

1．碘化铋钾（Dragendorff）试剂：取次硝酸铋3g溶于30%硝酸（比重1.18）17ml中，在搅拌下慢慢加碘化钾浓水溶液（27克碘化钾溶于20ml水），静置一夜，取上层清液，加蒸馏水稀释至100ml。 附：改良的碘化铋钾试剂：

甲液：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。 乙液：8g碘化钾溶于20ml水中。

溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间，可作沉淀试剂用，如作层析显色剂用，则取上述混合液1ml与醋酸2ml，混合即得。

目前市场上碘化铋钾试剂可直接供配制：7.3g碘化铋钾，冰醋酸10ml，加蒸馏水60ml。 2．碘化汞钾（Mayer）试剂：氯化汞1.36g和碘化钾5g各溶于20ml水中，混合后加水稀释至100ml。

3．碘一碘化钾（Wagner）：试剂：1g碘化钾液于50ml，加热，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。

4．硅钨酸试剂：5g硅钨酸溶于100ml水中，加盐酸少量至pH2左右。 5．苦味酸试剂：1g苦味酸溶于100ml水中。

6．鞣酸试剂：鞣酸1g加乙醇1 ml溶解后再加水至10ml。

7．碱酸铈——硫酸试剂：0.1g硫酸铈混悬于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加热至沸，逐滴加入浓硫酸至澄清。 二、苷类检出试剂：

（一）糖的检出试剂：

1．碱性酒石酸铜（Fehiling）试剂：本口分甲液与乙液，应用时取等量混合。 甲液：结晶硫酸酮6.23g，加水至100ml。

乙液：酒石酸钾钠34.6g，及氢氧化钠10g，加水至100ml。 2．ɑ-萘酚（Molisch）试剂。

甲液：ɑ-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。 乙液：浓硫酸

3．氨性硝酸银试剂：硝酸银1g，加水20ml溶解，注意滴加适量的氨水，随加随搅拌，至开始产生的沉淀将近全溶为止，过滤。 4．ɑ-去氧糖显色试剂

（1）三氯化铁冰醋酸（Keller-Kiliani）试剂 甲液：1%三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。 乙液：浓硫酸。

（2）占吨氢醇冰醋酸（Xanthydrol）试剂：10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸（含1%的盐酸中） （二）酚类

1．三氯化铁试剂：5%三氯化铁的水溶液或醇溶液。 2．三氯化铁一铁氰化钾试剂： 甲液：2%三氯化铁水溶液 乙液：1%铁氰化钾水溶液

应用时甲液、乙液等体积混合或分别滴加。

3、4一氨基氨替比林一氨氰化钾（Emerscn）试剂： 甲液：2%4-氨基安替比林乙醇液

乙液：3%铁氰化钾水溶液，（或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液）。 4．重氮化试剂：本试剂系由对硝基苯胺和亚硝酸钠在强酸下经重氮化作用而成，由于重氮盐不稳定很易分解，所本试剂应临用时配制。

甲液：对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml，加水至50ml。 乙液：亚硝酸钠5g，加水至50ml

应用时取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。

5．Gibb试剂：

甲液：0.5%2，6-二氯苯醌-4氯亚胺的乙醇溶液。 乙液：硼酸一氯化钾一氢氧化钾缓冲液（pH9.4）。

[注]试剂配制法中：1.水是指蒸馏水；2.不指出溶剂的即为水溶液；3.醇指95%；4.试剂配制后应澄清，如不澄清可过滤。 （三）内酯、香豆素类 1．异羟肟酸铁试剂

甲液：新鲜配制的1N羟胺盐酸盐（M=69.5）的甲醇液。 乙液：1.1N氢氧化钾（M=56.1）的甲醇液

丙液：三氯化铁溶于1%盐酸中的浓度为1%的溶液。

应用时甲、乙、丙三液体按次序滴加，或甲、乙两液混合滴加后再加丙液。 2．4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂（见二一（二）-3）。 3．重氮化试剂：（见二一（二）-4）。

进行2、3试验时样品应先加3%碳酸钠溶液加热处理，再分别滴加试剂。 4．开环一闭环试剂 甲液：1%氢氧化钠溶液。 乙液：2%盐酸溶液。 （四）黄酮类：

1．盐酸镁粉试剂：浓盐镁和镁粉 2．三氯化铝试剂：2%三氯化铝甲醇溶液 3．醋酸镁试剂：1%醋酸镁甲醇溶液

4．碱式醋酸铅试剂：饱和碱式醋酸铅（或饱和醋酸铅）水溶液。 5．氢氧化钾试剂：10%氢氧化钾水溶液。 6．氧氯化锆试剂：10%氧氯化锆甲醇溶液。 7．锆一枸橼酸试剂： 甲液：2%氧氯化锆甲醇液。 乙液：2%枸橼酸甲醇液。 （五）蒽醌类：

1．氢氧化钾试剂：10%氢氧化钾水溶液。

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