_阿片受体激活诱导心肌细胞增殖的信号转导途径

阿片类药物

δ阿片受体激活诱导心肌细胞增殖的信号转导途径

赵　敏,王洪新,崔　蕾

(辽宁医学院药理学教研室,辽宁锦州　121001)

摘要:目的　研究δ阿片受体激活剂D2丙(2)2D2亮(5)脑啡肽(DADLE)诱导心肌细胞增殖的可能信号途径。方法　体外培养乳大鼠心肌细胞,采用结晶紫法和[H]TdR检测心肌细胞的增殖;-平。结果　磷酸化,,δ-1

吲哚10μmol L,蛋白激酶C(PKC)特异性抑制剂

-1

星形孢菌素1μmol L和ERK特异性抑制剂

3

3

受体和其他G蛋白耦联受体可激活细胞外信号调节

[6]

(2ERK)。(mitogen2activa2)家族中的一员

[7]

,参与细

资料也表明,ERK激活可使培养的心肌细

[8]

胞增殖;内源性阿片肽在低浓度可作用于δ阿片受体,通过MAPK2ERK通路对培养的PC12细胞有保护作用

[9]

。ERK的2个亚型,ERK1和ERK2均在新生

[10]

的哺乳动物的心肌细胞中存在。ERK1/2传导通路是。因此,ERK通路

对心肌细胞的增殖作用很关键,但δ阿片受体激活对MAPK家族最基本的信号通路

U012610nmol L明显降低ERK磷酸化水平,抑制DADLE的促心肌细胞增殖作用。结论　DADLE可

-1

能通过δ阿片受体活化PKC,进而激活有丝分裂原激活蛋白激酶ERK通路诱导心肌细胞增殖。关键词:受体,阿片样,δ;心肌;细胞,培养的;细胞增殖;细胞外信号调节激酶中图分类号:R962文献标识码:A

文章编号:100023002(2007)0520377204

阿片受体在中枢水平的研究较多,对外周阿片受体的研究近年来才逐渐起步。已证实心肌细胞本身可以产生和释放阿片肽,而且已证实大鼠心

δ和μ3种阿片受体。也已证肌组织上主要存在κ、

实,δ阿片受体激动剂D2丙(2)2D2亮(5)脑啡肽([D2Ala,D2Leu]2enkephalin,DADLE)对培养的

2

5

[1-2]

培养的心肌细胞生长的信号转导机制尚未见报道。

本实验采用体外培养的乳大鼠心肌细胞,研究δ阿片受体激活剂DADLE诱导心肌细胞增殖中ERK的作用,并分析其作用机制。

1　材料和方法

1.1　动物、药品与试剂

出生2～3d的SD乳大鼠,雌雄不拘,由锦州医学院实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(辽)200320007。DADLE,纳曲吲哚(naltrindole),1,42二

氨基22,32氰基21,42双(22氨基苯基硫代)丁二烯,U0126〔1,42diamino22,32dicyano21,42bis(o2amino2phenylmercapto)butadiene〕,星形孢菌素(staurospo2rine),十二烷基硫酸钠(SDS),低糖培养基DMEM

鸡胚心肌细胞有正性肌力作用胞可出现增殖现象

[4]

[3]

。培养的心肌细。据报道,阿片

均购自美国Sigma公司;小牛血清为杭州四季青生物材料研究所产品;[H]TdR为上海原子核研究所产品;其他试剂均为分析纯。

1.2　乳大鼠心肌细胞原代培养、分组及给药方法

3

,本室的研究也表明,DADLE

[5]

对培养的心肌细胞有增殖作用

收稿日期:2006209214　接受日期:2007202212　　基金项目:辽宁省自然科学基金(20042170)

作者简介:赵　敏(1979-),女,山东省滨州市人,药理学硕士,主要从事心血管药理学研究;王洪新(1964-),男,辽宁省锦州市人,教授,医学博士,主要从事心血管药理学研究。　　3联系作者　E2mail:Jyhxwang@　Tel:

13304169343

在无菌条件下,开胸取出心脏,用D2Hanks液洗涤3次后,剪成1mm小块,加入0.8g L胰蛋白酶消化细胞,将消化完毕的细胞置入含有10%小牛血清及90%DMEM培养基的100mL大培养瓶中,置于通以5%CO2的CO2孵育箱中,37℃静置培养1.5～2h,根据心肌细胞及非心肌细胞(主要为成纤

3

-1

阿片类药物

维细胞)贴壁速度的不同,及心肌细胞搏动,

可区分获得心肌细胞。非心肌细胞贴壁的速度较快,首

先附在瓶底,而心肌细胞仍存在于细胞悬液中,将细

8-1

胞悬液吸出,吹打均匀后以5×10L密度接种于24孔板中,每孔1mL,置入CO2孵育箱中培养。培养基的组成如下:15%小牛血清,84%DMEM培养基

-1-1

及1%双抗液(含100kU L青霉素,100mg L链霉素)。常规培养心肌细胞2～3d后,更换含0.4%小牛血清的培养基,以减少血清成分对实验结果的影响。再培养48h后分组,分别给予DADLE、DADLE+纳曲吲哚、DADLE+孢菌素。48h1.3　[12[11]

漂洗后加显色剂氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium

bluechloride,NBT)5min。显影条带经1200Pro型图像扫描仪扫描,CAMIAS2008图像分析系统处理,根据积分吸光度值对比分析条带的强弱。以磷酸化ERK/ERK比值表示磷酸化水平。1.6　数据处理实验数据均以x ±s表示,采用单因素方差分析及LSD法进行统计学处理。

2.E及其他处理因素对培养心肌细胞增

给药48h,,加

入5%戊二醛液0.5mL固定细胞15min,去离子水冲洗3遍后,用新配制的0.1%结晶紫液(pH6)染色20min。用去离子水冲洗3遍后,每孔加入0.5mLTritonX2100以提取被细胞核吸收的结晶紫液。

殖的影响

-1

图1结果所示,DADLE(1μmol L)处理细胞48h,A570nm相对于正常对照组增高116.4%。同时加入δ阿片受体拮抗剂纳曲吲哚组的A570nm比DADLE组下降60.8%,表明DADLE通过δ阿片受体发挥增殖作用。同时加入ERK特异性拮抗剂U0126可以抑制DADLE诱导的心肌细胞增殖,A570nm相对于DADLE组下降了76.6%,说明ERK的激活在心肌细胞增殖中有重要作用。蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)特异性抑制剂星形孢菌素也明显抑制心肌细胞增殖,A570nm较DADLE组下降82.0%

。

用分光光度计在波长570nm处测量每个培养孔的吸光度(A570nm)值,A570nm值与细胞数目成正比。1.4　[H]TdR法测定细胞增殖

3

培养板各孔加入37TBq L[H]TdR,同时给予不同的处理因素,48h后弃去培养液,用冷D2Hanks液快速冲洗3遍,每孔加10g L

-1

-13

SDS1mL

溶解细胞,用20%三氯醋酸1mL沉淀蛋白,应用49型玻璃纤维滤膜(GF/C)过滤,再用D2Hanks液冲洗3遍,烘干滤膜,用液闪仪(Paclard,Tricard2200CA,

3

USA)测量[H]TdR的结合,进行DNA合成的分析。根据计数,每孔的细胞数约为5×10个,实验

5

结果以1×10个细胞的cpm值计算(实验组cpm值-空白对照组cpm值)。

1.5　Western印迹法测心肌细胞ERK磷酸化水平

细胞加药作用48h后,用细胞刮刀刮下细胞,用PBS冲洗下来,90×g离心15min,弃上清,将细胞沉淀置于-70℃冰箱备用,测定指标时,取出样品,每份样品取样50μg,变性SDS2聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳,电压积压胶80V,分离胶120V,半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜,恒压电泳95V,室温1h,4℃封闭过夜,按0.1mL cm膜面积加入1∶2000稀释的一抗(兔抗ERK和兔抗P2ERK,购自Sigma

-2

公司)杂交2h,封闭液漂洗后按0.1mL cm膜面

-2

5

Fig1.　Effectsofdifferentagentsonproliferation

ofculturedmyocardialcellsofneonatalrats.After

5thecells(5×10cellsperwell)wereculturedfor2-3d,themediumwaschangedtoDMEMsupplementedwith0.4%calf

-1

serum.Forty2eighthourslater,DADLE(1μmol L),naltrin2

-1-1

dole(10μmol L),U0126(10nmol L)andstaurosporine

-1

(1μmol L)wereaddedrespectivelytothemediumatthesametimeandculturedfor48h.1:control;2:DADLE;3:DADLE+naltrindole;4:DADLE+U0126;5:DADLE+stau2rosporine.Cellproliferationwasdeterminedbycrystalviolet

3

stainingmethod.x ±s,n=6.P<0.05,comparedwithcon2

#

trol;P<0.05,comparedwithDADLE.

2.2　DADLE及其他处理因素对心肌细胞DNA合

积加入1∶2000稀释的二抗(抗兔IgG抗体,购自北京中山金桥生物有限公司),室温下摇床杂交1h,

成的影响

图2结果可见,细胞加入DADLE和相关抑制剂

阿片类药物

Fig2.　EffectofdifferentagentsonDNAsynthesisinculturedmyocardialcellsofneonatalrats.The

experimentalprotocolwasthesameasinFig1.[3H]TdRwasaddedtothemediumatthesametimewiththeagentsandcul2

3

turedfor48h.cpm:countperminute.x ±s,n=6.P<0.05,

#

comparedwithcontrol;P<0.05,comparedwithDADLE.

及[H]TdR33

[H]TdR[H]TdR的结合,78.0%,纳曲吲哚抑

3

制心肌细胞与[H]TdR的结合,与DADLE组相比减少了44.4%,U0126和星形孢菌素均对DADLE

3

增加心肌细胞[H]TdR的结合有抑制作用,与DADLE组相比分别减少了67.7%和73.9%。结果表明,激动δ阿片受体能促进心肌细胞的DNA合成,而阻断δ阿片受体,抑制ERK和PKC均抑制激动δ受体所致的DNA合成增加。

2.3　DADLE及其他处理因素对ERK磷酸化水平的影响

图3结果表明,DADLE明显增强ERK磷酸化,ERK磷酸化水平增高138.9%,纳曲吲哚抑制ERK磷酸化,相对于DADLE组磷酸化水平下降了70.3%,U0126显著降低ERK磷酸化水平,相对于DADLE组磷酸化水平下降了79.7%。PKC抑制剂星形孢菌素作用后,ERK活性减低,ERK磷酸化水平大大降低,相对于DADLE组磷酸化水平下降了92.6%。

3

Fig3.　Effectsofdifferentagentsonextracellularsignal2regulatedkinase(ERK)phosphorylationin2

6

10cellspercreasedbyDADLE.Apartfromthecells(1×

flask),methodandtimeofcellculturewerethesameasinFig

-1-1

1.DADLE(1μmol L),naltrindole(10μmol L),

-1-1

U0126(10nmol L)andstaurosporine(1μmol L)wereaddedtothemediumatthesametimeandculturedfor48h.A:WesternblotofERKandphospho2ERK(p2ERK);B:relativelevelsofp2ERKexpressedasabsorbanceratioofp2ERK∶ERK.

3

SeeFig1forthetreatment.x ±s,n=4.P<0.05,compared

#

withcontrol;P<0.05,comparedwithDADLE.

3　讨论

推断δ阿片受体激动剂DADLE使心肌细胞增殖的可能机制之一为DADLE通过δ阿片受体主要活化PKC,从而激活MAPK2ERK通路起到增殖作用。本实验结果表明,DADLE明显增强心肌细胞内ERK磷酸化,对心肌细胞有增殖作用,而其增殖作用可被δ阿片受体拮抗剂纳曲吲哚明显抑制,说明DADLE可能通过δ阿片受体发挥细胞增殖作用。在有PKC抑制剂星形孢菌素或ERK特异性拮抗剂U0126作用时,ERK磷酸化水平大大降低,DADLE促心肌细胞增殖的作用被抑制,这提示DADLE

通

过活化PKC,进而激活MAPK2ERK通路诱导心肌细胞增殖。PKC活化可以激活ERK,诱导心肌细胞增殖,但PKC如何调控ERK的机制还不清楚,需要进一步探求。DADLE对心肌细胞的增殖作用由δ阿片受体介导。尽管2个δ阿片受体亚型早已公认,

[9]

但只有一个基因(DOR21)被克隆,近来有报道,去除DOR21的大鼠δ1和δ2亚型被废除。这说明DOR21基因编码δ1和δ2亚型。可能翻译前的蛋白质修饰和(或)交替拼接造成δ受体两个亚型的不同药理学特性。　　本研究阐述DADLE通过δ阿片受体,主要活化PKC,通过MAPK2ERK通路引起心肌细胞增殖。对DADLE的研究表明,激动内源性δ阿片肽可能促进心肌细胞增殖,内源性阿片肽对心肌组织的生长发育有重要作用。4　参考文献:

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proliferationofculturedmyocardialcells

ZHAOMin,WANGHong2Xin,CUILei

(DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalCollege,Jinzhou　121001,China)

3

Abstract:AIM　Tostudysignaltransduction

inculturedmyocardialproliferationinducedby

25

[D2Ala,D2Leu]2enkephalin(DADLE),aδ2opioidreceptoragonist.METHODS　Myo2cardialcellsofneonatalratswereculturedinvitro.Thecellularproliferationwasdetermined

3

bycrystalvioletuptakeand[H]TdRthymi2dineincorporation.Thedegreeofextracellularsignal2regulatedkinase(ERK)phosphorylationwasdeterminedbyWesternblot.RESULTS

-1

DADLE(1μmol L)promotedthemyocardi2alcellsproliferation.Naltrindole(10μmol -1

L),aselectiveδ2opioidreceptorantagonist,

-1

staurosporine(1μmol L),aselectivepro2teinkinaseC(PKC)antagonist,andU0126

-1

(10nmol L),aselectiveERKantagonist,obviouslyinhibitedthedegreeofERKphospho2rylationandthemyocardialproliferationin2ducedbyDADLE.CONCLUSION　DADLEmaypromotemyocardialproliferationthroughactivatingPKCbyδ2opioidreceptorandthenactivatingtheMAPK2ERKpathway.Keywords:receptors,opioid,δ;myocardi2um;cells,cultured;cellproliferation;extra2cellularsignal2regulatedkinase

Foundationitem:TheprojectsupportedbyNaturalSci2enceFoundationofLiaoningProvince(20042170)　　3Correspondingauthor.

(本文编辑　董立春)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/lm2q.html