RNAi 综述1

RNA干扰（RNAi）及其应用

摘要：本文介绍了RNAi原理、 产生、 发展历史、 现状、 发展趋势、 理论或实践意义，以及RNAi在植物中的应用。

关键词：RNAi，应用

RNAi是指一些小的与靶基因序列同源的双链RNA ( dsRNA)，可以高效、特异性地阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被赋予不同的名称， 在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression）， 在真菌中被称为基因阻抑（qulling） ，在动物体内被称为RNA干扰。

1.原理

其可能的作用机理是：

较长ds RNA在ATP参与下被RNAseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21 ～23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA ( small interfering RNA, siRNA ) 。siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA 诱导的沉默复合体(R ISC) ,沉默同源靶基因。转基因真核生物中的dsRNA尚可引起相应基因的甲基化和染色质重构、凝集、异染色质化,最终导致基因沉默。

2.产生

小RNA 主要包括小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) 和微RNA (microRNA, miRNA)两类。

siRNA是一种短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的m RNA 。siRNA 是RNAi作用中不可缺少的重要环节, 这一发现进一步揭示了RNAi的作用机制,这个过程也就是前面提到的RNA干扰。

miRNA 是一类广泛存在于真核生物中,大小约21～23个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA 前体, 经过Dicer酶加工后生成,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控。

2.1它们的共同点包括:

①miRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成; ②都是Dicer酶的产物;

③在起干扰、调节作用时都会和R ISC复合体结合; ④都可以在转录后和翻译水平干扰抑制靶基因的翻译。 2.2它们之间的区别点有:

①形式不同：

siRNA 为双连RNA,而miRNA 为单链RNA 分子。 ②来源不同:

siRNA通常是外源的,如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后产生外源基因进入细胞。而miRNA是内源性的,是一种非编码的RNA,由miRNA基因表达出最初的pri - miRNA分子加工后形成的。

③形成过程不同:

siRNA是外源的长链dsRNA经过Dicer酶切割形成双链siRNA,而且每个前体dsRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段。而miRNA是在细胞核中转录的较大的p ri - miRNA经由Drosha (一种RNAse Ⅲ酶)和Pasha (含有双链RNA结合区域)加工成为单链p re- miRNA;接着,发夹状、部分互补的p re - miRNA在细胞质中被Dicer (一种RNAse Ⅲ酶)酶切割形成miRNA。

④作用机制不同:

siRNA与R ISC (RNA诱导的沉默复合物,使用的AGO蛋白家族的成分为AGO2)结合,以RNAi途径行使功能,即通过与序列互补的靶标mRNA完全结合(与编码区结合) ,从而降解mRNA以达到抑制蛋白质翻译的目的。miRNA和R ISC形成复合体(利用的AGO蛋白家族成员为AGO1)后与靶标mRNA通常发生不完全的结合, 并且结合的位点是mRNA的非编码区的

3’端;它不会降解靶标mRNA,而只是阻止mRNA的翻译。

⑤功能不同:

siRNA通常用于沉默外源病毒、转座子活性。miRNA能够调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。 2.3作用特点

①普遍性

②RNA干扰的高效性和浓度依赖性 ③高度特异性

④可遗传性和时间效应 ⑤可传播性 ⑥ATP依赖性 3.发展历史

RNAi现象早在1993年就有报道: 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中,希望得到紫色更深的花,可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能, 称这种现象是“共抑制”。直到1998 年, Fire 等的研究证明,在正义RNA阻断了基因表达的试验中, 真正起作用的是双链RNA,使基因“沉默”了。研究人员将这一现象称为RNA干扰(RNA interference, RNAi) 。研究者因此获得了2006 年诺贝尔生理学或医学奖。 4．现状

由于几乎所有的物种都保留着RNA干扰的机制，这揭示了RNA干扰很可能是出现于生命进化的早期阶段，而且起着重要的作用，RNA干扰也越来越为人们所重视。 5．发展趋势

随着RNA干扰机制研究的深入和完善，应用RNA干扰技术，必将大力推动人类疾病的治疗和人类功能基因组学的发展。

6．理论或实践意义 6.1 基因功能研究上的应用

RNAi能够在真核生物细胞中抑制特异性基因的表达，产生类似基因敲除的效果。随着现代生物基因测序技术的发展，大量未知功能的新基因不断被发现，研究这些基因的功能是当前生物科学研究的主要方向之一。RNA干扰技术将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基敲除技术相比，RNA干扰技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。随着对RNA干扰机制研究的不断深入，RNA干扰技术将成为研究基因功能不可或缺的工具。 6.2 RNAi在基因治疗方面的应用

RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动等作用。因此RNAi可用不同病毒转录序列中高度同源区段相应dsRNA抵抗多种病毒。肿瘤的发生是多个基因相互调控作用“失灵”的结果，当前对肿瘤的治疗是通过物理和化学的方法抑制DAN复制及细胞分裂增殖，进而杀死癌细胞，然而这些方法不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长。而RNAi可以利用同一基因家族中多个成员具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可以使多个基因同时沉默，从而捉使癌细胞生长停滞。 6.3 RNAi功能基因组研究上的应用

在功能基因组研究中，需要对特定基因进行沉默使其功能丧失。利用RNAi高度序列专一性的特点，设计出dsRNA可以特异地使特定基因沉默，从而使特定基因的功能丧失。因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 7．RNAi在植物中的应用

植物RNAi具有特异性、高效性、系统性以及可遗传性等特点。可利用RNAi技术进行基因功能研究的初步筛选，或直接利用RNAi创造的特殊性状变异体进行植物改良，同时在植物

发育的不同阶段抑制特定基因的表达，对发育生物学研究也具有重要意义。另外利用RNAi的系统性等特征，也有望在植物防虫、抗病、抗逆等方面取得突破。 7.1基因功能的研究

后基因组的主要工作是将已经测序的大量基因进行功能性分析。构建RNA干扰文库显然是对传统基因功能研究方法的重要补充。RNAi文库技术进行功能基因组研究的基本思路：根据已测基因序列，预测设计对应各个基因序列的有效siRNA或dsRNA，构成基因组的RNAi文库，将文库中不同序列的siRNA或dsRNA分别导人不同个体的细胞内，通过观察对应的缺失表型可以大致确定基因功能。RNAi文库技术作为高通量基因功能分析工具，具有操作简单，周期短，成本低、高特异性和高效性等特点。

现今用于植物RNAi技术按导入方式的不同有粒子轰击、病毒诱导基因沉默(virus—induced gene silencing，VIGS)、农杆菌介导等方式。 a.粒子轰击指用基因枪将包裹有siRNAs或dsRNAs的金粉或钨粉直接轰击整合入细胞组中；b.VIGS是通过对已知植物病毒的改造，将合适的目标序列整合入病毒载体中，然后感染寄主植物体内并超表达目标序列的正义链或反义链，或通读表达其反向重复序列形成dsRNA，诱发RNAi途径。前两种方法多用于瞬时基因沉默效应的研究，而要获得长效并稳定遗传的基因沉默效果，则需要利用到农杆菌介导体内表达dsRNAs。c.农杆菌介导体内表达dsRNAs。一般做法是针对靶基因，设计反向重复序列构建成含发夹结构的双链RNA(hairpin RNA，hpRNA)T—DNA质粒或含内含子的ihpRNA(intron-containing hairpin RNA)表达载体，然后利用农杆菌介导转化整合到植物染色体中，通读反向重复序列转录形成dsRNA，进而诱导RNAi的产生。 7.2植物遗传改良

将RNAi技术应用于植物遗传改良的基本思 路：分析目的基因的功能和表达途径，利用RNAi技术抑制相关基因的表达，使目的基因产物表达受阻或向特定的方向富集。如Davuluri等引采用果实特异启动子结合RNAi技术来抑制番茄内源光形态建成调节基因DETl的表达，结果显示再生植株中DETl的表达下降，类胡萝卜素和类黄酮含量明显升高，而果实的其它品质 参数没有发生大的改变。如日本和澳大利亚研究者就利用RNAi沉默玫瑰中二氢黄酮醇4．还原酶基因，培育出了蓝色玫瑰。 7.3植物抗性研究

在植物抗病毒方面，RNAi一开始就被认为是真核生物中普遍存在的外源核酸(如病毒)入侵的防御机制，即利用基因转化系统将表达与病毒同源的dsRNA的载体整合到植物基因组，表达后就能够引起病毒基因组的特异性降解，阻止病毒的复制扩散，并可获得稳定遗传的抗病毒植物。Shimizu等Ⅲ1利用RNAi，沉默了水稻矮缩病毒的一个病毒原质基质蛋白基因Pnsl2，

结果获得了病毒抗性的转基因水稻双链RNA作为昆虫的可食成分可以有效地下调目标基因。更重要的是，针对合适的靶基因表达双链RNA在转基因抗虫植物中已经显示出获得性虫害防御，这为新一代抗虫作物的研制开辟了道路。 7.4展望

如由于RNAi的高特异性，在进行基因功能的研究时，其他冗余基因可能弥补RNAi造成的功能缺失，引起表型不明显(假阴性)。

目前，与RNAi途径相关的核酸、蛋白等成分及作用模式并不是特别清晰，如DCL精确的剪切机制、RISC对siRNA正反两条链准确识别的问题、系统性RNAi效应的机制及其信号分子等，这给该技术在应用方面，带来一些不可预知的后果。

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