CRISPRCas9敲除PES1基因质粒构建

CRISPR/Cas9敲除PES1基因质粒构建

摘要：设计针对人的PES1基因的单导向RNA （single-guide RNA，sgRNA)，其包含的序列可以介导Cas9蛋白致靶DNA双链断裂。 关键词：PES1，Adenovirus vector

一、 实验原理

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，其中II型CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。在这一系统中，crRNA

（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA，其中Cas9的HNH核酸酶结构域剪切互补链，其RuvC-like结构域剪切非互补链。具体如下图所示：

为了实验方便，把crRNA与tracrRNA通过一段Linker loop连接起来得到单导向RNA （single-guide RNA，sgRNA)可得同样的结果。在

pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9载体中U6启动子启动sgRNA的表达，另外，CMV启动子启动Cas9基因的表达。载体图谱如下：

二、实验目的

构建带有PES1基因sgRNA和Cas9基因的表达质粒。 三、 实验步骤

根据人的PES1基因设计sgRNA序列，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入BsmB I酶切线性化的表达载体。菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤： 1. sgRNA设计和引物合成：

根据sgRNA设计的一般原则以及和元生物的丰富经验，设计sgRNA序列，安排引物合成。sgRNA序列如下

GN19GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC

其中GN19共20nt是和基因DNA互补的，一般GN19序列之后是NGG的PAM序列。GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC序列已经在表达载体了，需要插入的是GN19序列 2. 引物退火形成带粘性末端的双链片段：

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存。 3. 线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。 4. 干扰片段连接入表达载体：

连接反应体系

试剂 退火的双链oligo 10mM 线性化的干扰载体 40ng/μl 10×T4 DNA ligase Buffer

T4 DNA ligase dd H2O

阳性对照( μl )

1 3 2 1 Up to 20

自连对照 ( μl )

- 3 2 1 Up to 20

连接组 ( μl )

1 3 2 1 Up to 20

于16℃ 连接过夜。 说明：阳性

对照所加的退火的双链oligo是以前退火好的验证好用的片段，和连接组所加的退火的双链oligo长度一样，但序列无关。 5. 感受态细胞的转化：

DH5α感受态细胞的转化，详见《精编分子生物学实验指南》。 6. 菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

7. 阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析。 8. 质粒小提：

经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果

1. sgRNA 序列和引物合成：

使用U6启动子表达sgRNA 序列，基因组DNA序列一般为GN19NGG，需要插入载体的序列为GN19序列，合成的引物退火后得到如下的序列，和BsmB I酶切后的表达载体粘性末端互补，可连接入表达载体。

DNA引物片段：

Pes1-1 ACCGCTGTGCCGCCGGCTCACTGG pes1-2 AAAACCAGTGAGCCGGCGGCACAGC

2. 表达载体的线性化：

用BsmB I对表达载体进行酶切得到318bp的无关序列和8.6kb的载体片段，酶切图谱如下：

1 2 3

1. 未酶切的质粒 2. 经BsmB I酶切的质粒

3. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：

用菌落PCR鉴定转化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6启动子序列中，反向引物pY-SEQR： CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5’序列，阳性克隆得到381bp的片段，阴性对照得到674bp的片段。

H2031克隆菌落PCR鉴定图

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1. 阴性对照（空载体）

2. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp 3-10. 挑取的8个转化子

4. 测序结果分析：

ATAAAGATATTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTGTGCCGCCGGCTCACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTAC

CGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACACGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAGATGGCCCCAAAGAGAGCGATGTCGTATCACGAGTCCAGCAGCGACAGGAGTACTCATGGCTCGATATCGCACAAACAGCGTCGCCTGGTGTCATAACGAACGAGTTACAGTGCGAGCCAAAAGTCAGGTCTGACATACCGATCGCCCAAGCTAGAGACTCTATGCTCTCGTCGATCAGGAAACGTGAGTCAAGCGGCCCA

五、 参考文献

1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社 2. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, et al. Multiplex genome engineering using

CRISPR/Cas systems.Science. 2013 ; 339(6121):819-823.

3. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, et al. RNA-guided human genome

engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121):823-826.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/llfr.html