现代分子生物学 复习内容

现代分子生物学 复习内容

一、DNA的变性（Denaturation）：指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。断裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA变性不涉及到其一级结构的改变。

1. DNA变形的条件：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。 2. DNA变性后发生的变化：DNA变性后原来隐藏在双螺旋内部的发色基团，成为单链而暴露出来，使DNA的物理和化学性质发生一些列的变化，这些变化包括：

（1）DNA溶液的浓度大大下降。DNA双螺旋是紧密的\刚性\结构,变性后代之以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。

（2）溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变, 使DNA溶液的旋光性发生变化。

（3）增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。 （4）生物活性丧失。 （5）浮力密度上升。

3. 引起DNA变性的主要因素： （1）加热（生理温度以上）。加热使DNA变性后，在260nm处的紫外吸收值明显上升，一般当DNA加热时，在260nm吸收值先缓慢上升，到达某一温度后又骤然上升，其特点是爆发式的，变性发生的范围很窄，其相变过程用Tm值描述。

（2）极端pH值。当pH为12时，碱基上的酮基变为烯醇基，影响氢键形成，从而改变Tm值，当pH为2～3时，碱基上的氨基发生质子化，也影响氢键形成。

（3）有机溶剂、尿素和酰胺等。当环境中存在酰胺或尿素时，它们可与DNA分子中的碱基形成氢键，从而使DNA分子保持单链状态，以利于分子克隆的操作。 4. Tm值大小的影响因素：

（1）DNA的均一性。有二种含义，首先是指DNA分子中碱基组成的均一性,如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段,与天然DNA比较,其Tm值范围就较窄。其次还包含有待测样品DNA的组成是否均一的意思,如样品中只含有一种病毒DNA,其Tm值范围较窄, 若混杂有其它来源的DNA,则Tm值范围较宽。

（2）DNA的(G+C)含量。在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C碱基对越多,Tm值越高。

（3）介质中离子强度：DNA在离子强度较低度介质中Tm值较低，范围较宽；在高离子强度时，DNA的Tm值较高，范围较小。所以DNA在含盐的缓冲溶液中较为稳定。 二、DNA的复性（renaturation）：指变性DNA 在适当条件下, 二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为\退火\。 1. DNA复性的条件：

（1）一定的离子强度：用以削弱两条链中磷酸基团之间的排斥力，通常用0.2－0.5M NaCl （2）较高的温度：避免形成无规则氢键，但是不能太高，否则不能形成有规则氢键以维持双链结构。

2. 影响DNA复性的因素：

（1）DNA分子的复杂程度。DNA序列越复杂，复性越慢，所需时间越长。

（2）DNA的浓度。同一种DNA分子，浓度越高，互补链碰撞机会越多，复性越快。

（3）DNA片段大小。DNA片段越大，复性越慢，因此，在复性研究时，一般要将其剪切成400bp大小的片段，以增加复性速度。

（4）温度。复性速度与温度直接有关，温度不宜过低，一般在Tm=25℃ （5）阳离子浓度。在小于0.5mol/L浓度时增加盐浓度有利于复性。 三、基因

1.基因的顺反子概念：现代分子生物学文献中，顺反子和基因这两个术语互相通用。一般而言，一个顺反子就是一个基因，1500～2000个核苷酸，它是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构（因为任何一个基因都是突变体或重组体）。有结构基因与调控基因的划分，还有重叠基因和断裂基因的发现。 2. 基因重叠的方式：

（1）大基因内包含小基因。 （2）前后两基因首尾重叠。 （3）三个基因之间重叠。 四、基因组

1. 基因组的概念：基因组是指细胞内遗传信息的携带者-DNA的总体。基因组中不同的区域具有不同的功能，有些是编码蛋白质的结构基因，有些是复制及转录的调控信号，有些区域的功能尚不清楚。基因组结构是指不同功能区域在整个DNA分子中的分布情况。 2. 细菌染色体基因组结构的一般特点：

（1）通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域为类核。只有一个复制起始点。

（2）具有操纵子结构，其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。

（3）在大多数情况下，结构基因都是单拷贝，但是编码rRNA的基因往往是多拷贝的。 （4）不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。 （5）具有编码同工酶的基因。

（6）在细菌中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。

（7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC，转录启动区和终止区等。

3. 真核生物基因组有以下特点：

（1）真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内的基因的基因组是双份的，即有两份同源的基因组。

（2）真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。

（3）存在重复序列，重复次数可达百万次以上。 （4）基因组中不编码的区域多于编码区域。

（5）大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。

（6）基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。 4. 真核生物基因组与原核生物基因组特点比较：

（1）真核生物的基因组远大于原核生物基因组，具有相当的复杂度。 （2）基因组中非编码区远远多于编码区。

（3）基因组中的DNA与蛋白质结合，形成染色体存在于细胞核内。 （4）大部分基因有内含子，因此基因的编码区域不连续。 （5）存在着重复序列，重复次数从几次到几百万次不等。 （6）基因组中以多复制起点的形式复制。

（7）转录产物为单顺反子。

（8）真核基因与原核基因相同，也存在着可移动的因子。 5. 基因家族的特点：

（1）基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇或串联重复基因。 （2）有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上。

（3）有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因成为假基因。 6. 假基因无表达活性的原因：

（1）缺乏有功能的调控区，使其不能进行正常转录。

（2）即使能转录，由于突变或缺失等引起mRNA加工缺陷。 （3）使mRNA翻译提前终止。 （4）产生无功能的肽链。 五、DNA复制

1. DNA 复制的起点：原核，单起点；真核，多起点。

2. 半保留复制实验证据：1958年，Meselson和Stahl利用同位素标记和密度梯度离心实验，将大肠杆菌放在15NH4Cl培养基中生长15代，使DNA被15N标记后，再将细菌移到只含有14

NH4Cl的培养基中培养。分别取0代、1代、2代、3代的细胞，提取DNA，进行密度梯度离心。结果发现：当含有15N-DNA的细胞在14NH4Cl培养液中培养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间，表明DNA一条链来自15N-DNA，另一条链为含有14N的新合成链；培养两代后则出现两条带，一条带在14N-DNA区，另一条带在14N-DNA和15N-DNA之间，按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N-DNA和14N，15N-DNA两种分子；培养三代后则出现三条带，一条带在14N-DNA区，一条带在14N-DNA和15N-DNA之间，还有一条带在15

N-DNA区，按照半保留复制方式培养三代，能出现14N-DNA、14N，15N-DNA和15N-DNA三种分子；随着代数的增加14N-DNA逐渐增加，而14N，15N-DNA区带逐渐减弱。 3. DNA复制的几种主要方式：

（1）线性DNA双链的复制：复制叉生长方式有单一起点的单向（如腺病毒）及双向（如T7噬菌体）和多个起始点的双向几种。DNA双向复制时，复制叉处呈“眼”型，因为已知的DNA聚合酶和RNA聚合酶都只能从5’端向3’端移动。

（2）环状DNA双链的复制：环状双链DNA的复制可分为型、滚环形和D-环形几种类型。 a. 型：环状DNA可以采取此种典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成θ样中间物，故又称θ型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。这种复制形式从E.coli的3H胸腺嘧啶核苷酸培养物和放射自显影结果得到了证实。 b. 滚环型（rolling circle）：这是单向复制的一种特殊方式。滚环复制在噬菌体中是很常见的，如Φx174的双链环状DNA复制型（RF）就是以这种方式复制的。这种复制方式的特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。 c. D-环型（D-loop）：也是单向复制的一种特殊方式。这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现，双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代。叶绿体DNA的复制也采取D环的方式。 六、参与DNA复制的酶

1. DNA聚合酶：以DNA为模板的DNA聚合酶，以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物，反应需要有模板的指导和3’-OH存在，DNA链的合成方向为5’→3’。 2. 原核生物（大肠杆菌）中的DNA聚合酶 比较项目 结构基因 相对分子质量 DNA聚合酶Ⅰ pol A 103000 DNA聚合酶Ⅱ Pol B 88000 DNA聚合酶Ⅲ Pol C 830000 3’→5’外切核酸酶 5’→3’外切核酸酶 功能 + + 切除引物，修复 + - 2400 修复 功能 + - 15000～60000 复制 聚合速度/（nt/min） 1000～1200 3. 大肠杆菌起点与复制起始有关的酶与辅助因子 参与复制的蛋白质和酶 Dna A Dna B Dna C HU 引物合成酶（Dna G） 单链DNA结合蛋白（SSB） RNA聚合酶 DNA旋转酶（拓扑异构酶Ⅱ） Dam甲基化酶 识别起点序列，在起点特异位置解开双链 解开DNA双链 帮助Dna B结合于起点 类组蛋白，DNA结合蛋白，促进起始 合成RNA引物 结合单链DNA 促进Dna A活性 释放DNA解链过程产生的扭曲张力 使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化 七、基因重组 1. 基因重组的分类：同源重组、位点特异性重组、转座重组和异常重组。 2. 同源重组的分子模型——Holliday模型

（1）步骤：a. 两个同源染色体的DNA排列整齐；

b. 两个DNA分子的同一部位两个单链发生断裂引发重组；

c. 断裂的单链游离末端彼此交换，每一条链与另一DNA对应的链连接，形成的连接分子成为Holliday中间体；

d. 通过分支迁移产生异源双链DNA。

（2）双链断裂模型：但是更多地事实证明，重组是由双链断裂断裂启动的。同源DNA分子之一发生双链断裂，经过核酸和解旋酶作用，产生具有3‘端的单链。它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应的链则被置换出来，与原来断裂的链配对，经过修复合成和链的再连接，形成两个交叉。而不是单链交叉形成一个交叉。

现在一般认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂地结果。DNA双链断裂才能够与同源分子发生链的交换，将同源染色体分配到子代细胞中去。 因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。 八、DNA的转座

1. 概念：DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。与DNA的同源重组相比，转座作用发生的频率要低得多，但仍然具有十分重要的生物学意义。 2. 转座子的分类和结构特征

（1）原核生物转座子包括4类： a. 插入序列（inserion sequence, IS）：两端有末端反向重复序列（IR），只编码转座酶。 b. 简单转座因子：结构同IS，但不能独立存在，只作为复合子的两端组件。

c. 复合转座子：两端由IS或类IS构成，带有某些抗药性基因或宿主基因，一旦形成复合转座子，IS就不能再单独移动，只能作为复合体移动。

d. TnA转座子家族：两端为IS，可编码转座酶、解离酶和抗性物质。 （2）真核生物转座子主要包括转座子和逆转座子两大类：

a. 转座子。①玉米中的可控制因子：可分为自主性因子和非自主性因子，如Ac-Ds。②果蝇中的转座子：如P因子，导致杂种不育。

b. 反转座子。①反转录病毒：RNA→DNA→整合宿主靶DNA位点。②病毒超家族：有LTR；

编码反转录酶或整合酶；可含有内含子。如：Ty、Co-pia、LINSL1。③非病毒超家族：不编码转座产物；无内含子，如SINSB1/Alu。 3. 转座子的转座机制

分为两种类型：复制型、非复制型。 复制型转座（replicative transposition）：转座元件在转座前先复制一份，而后拷贝转座到新的位点，在原先的位置上仍然保留原来的转座元件。在复制型转座过程中，转座和切离是两个独立事件。先是由转座酶切割转座子的供体和受体DNA分子，转座子的末端与受体DNA分子链接，并将转座子复制一份拷贝，由此生成的中间体及共整合体结构。共整合体含有转座子的两份拷贝。然后在转座子的两份拷贝间发生类似同源重组的反应，在解离酶的作用下，供体分子与受体分子分开，并且各带一份转座子拷贝。同时受体分子的靶位点序列也重复了一份拷贝。TnA是此类转座的例子。

非复制型转座（non-replicative transposition）：在DNA链的断裂与连续反应中只有靶位点发生重连，而供体链仍然断裂，不形成共整合体结构。在这种转座中，转座元件作为一个物理性实体，直接从一个位点转移到另一个位点，并且保守性很强，这种转座只需转座酶的作用。非复制型转座的结果是在原来位置上丢失了转座元件，而在插入位置上增加了转座元件，造成表型的变化。IS序列、Mu等以这种方式转座。 4. 玉米的Ac-Ds系统

在玉米中发现有激活因子-解离系统（Ac-Ds系统）。Ac和Ds这两个因子都位于玉米第9号染色体短臂，在色素基因C的附近。当C基因附近有Ac而没有Ds时，C基因处于活化状态，玉米籽粒内有色素生成，籽粒是有颜色的。当Ds因子插入基因C并且Ac也存在的情况下，虽然Ds抑制基因C的活性，但由于在玉米胚乳发育期间有些细胞里的Ds因Ac存在而切离转座，所以这些细胞仍能合成色素，因而玉米籽粒出现色素斑点。当Ac不存在时，Ds固定在C基因处，C基因不再合成色素。玉米籽粒就没有颜色。 九、RNA的转录合成 1. 转录的特点：

转录是在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程，是基因表达的核心步骤。经转录生成的RNA有多种，主要是rRNA、tRNA、mRNA、snRNA和hnRNA。除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都来自于DNA。RNA转录具有如下特点：（1）转录的不对称性。（2）转录的连续性。（3）转录的单向性。（4）有特定的起始位点和终止位点。 转录起始于DNA模板的一个起点，并在特定的终点处中止，这一转录的区域称为转录单位。 转录的起始主要由启动子（promoter）控制，而控制终止的部位称为终止子（terminater）。 2. 启动子（promoter）

启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DAN准确结合并与具有转录起始的特异性。启动子的结果影响到它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响基因表达的水平。

转录起始点是指DNA链上与新生RNA链第一个核苷酸相对应的碱基，通常为一个嘌呤。 （1）原核生物的启动子 a. 基本结构

绝大多数原核生物启动子都存在位于—10bp的TATA盒和位于—35bp的TTGACA盒，这两个区域是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。 b. 功能

不同启动子区域的主要功能是：

①－35区序列可以增强启动子与聚合酶σfactor 的识别作用；

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