DGGE术在土壤微生物分子生态学研究中的应用

生物技术通报

技术与方法

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ

２００６年第５期

DGGE/TGGE技术在土壤微生物分子生态学研究中的应用＊

周琳１，３

张晓君２

李国勋１

张杰３＊＊

（１河北农业大学植物保护学院，保定０７１０００；２上海交通大学生命科学学院，上海２００２４０；３中国农业科学院植物保护研究

所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京１０００９４）

摘要：传统的微生物生态学研究方法只限于环境样品中极少部分（０．１％￣１％）可培养的微生物类群，极大程度

地限制了对土壤微生物群落结构的研究。综述了以１６ＳｒＤＮＡ为主要研究对象的ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔ

ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ／Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＴＧＧＥ）技术原理，以其为主要手段结合ＰＣＲ扩

增、克隆建库、序列测定以及种系分析对土壤微生物的群落结构和多样性研究的最新动态。ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术极大地作物生长跟踪监测等提供了技术支撑，在土壤微生推动了土壤微生物分子生态学的发展，同时也为实际问题的诊断、物分子生态学研究和生产实践中起着越来越重要的作用。

关键词：

变性梯度凝胶电泳

温度梯度凝胶电泳

土壤

１６ＳｒＤＮＡ微生物分子生态学

ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＧＧＥ／ＴＧＧＥＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ

ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙｏｆＳｏｉｌ

ＺｈｏｕＬｉｎ１，３

ＺｈａｎｇＸｉａｏｊｕｎ２

ＬｉＧｕｏｘｕｎ１

ＺｈａｎｇＪｉｅ３＊＊

２

（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ０７１０００；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏＴｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４０；

３

ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄ

ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄ

ＩｎｓｅｃｔＰｅｓｔｓ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４）Ａｂｓｔｒａｃｔ：

Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｌｉｍｉｔｅｄｉｎｔｈｅｉｒｃａｐａｃｉｔｙｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｓｏｉｌｓ

ｂｅｃａｕｓｅｏｎｌｙａｓｍａｌｌｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｎｈａｂｉｔａｎｔｓ（０．１％￣１％）ｉｎｓｏｉｌｓｃａｎｂｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ．Ｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ

（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ／Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＴＧＧＥ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ

ｆｏｒ１６ＳｒＤＮＡｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｎｄｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ．ＴｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｐｏｗｅｒｆｕｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐｒａｃｔｉｃａｌｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｙｎａｍｉｃｓａｎｄｗｉｌｌｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙｏｎｓｏｉｌｒｅｓｅａｒｃｈ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＤＧＧＥＴＧＧＥＳｏｉｌ１６ＳｒＤＮＡＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ

土壤中的微生物与其周围生物、非生物环境之间的相互关系，以及这些相互关系对其周围的特定环境、区域和全球的影响，是微生物生态学家关注和重视的新热点研究领域。传统的微生物生态学研究方法只限于环境样品中极少部分（０．１％￣１％）可培养的微生物类群，这种局限严重影响了绝大多数微生物的分类地位和系统发育关系的深入研究［１］。

育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方荧光原位法，如ＰＣＲ－ＲＦＬＰ、ＰＣＲ－ＲＡＰＤ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、基因芯片（Ｍｉｃｒｏａｒｒｙ）、磷脂脂肪酸杂交技术（ＦＩＳＨ）、

图谱分析（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｆａｔｔｙａｃｉｄ，ＰＬＦＡ）、稳定同位素探针（ＳｔａｂｌｅＩｓｏｔｏｐｅＰｒｏｂｉｎｇ，ＳＩＰ）、ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／

ＴＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ／Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＴＧＧＥ）等，使

得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性

２０世纪８０年代以来，逐步建立起了以分子系统发

收稿日期：２００６－０３－２３

基金项目：９７３计划课题（２００１ＣＢ１０９００５和２００３ＣＢ１１４２０１）资助

作者简介：周琳（１９８１－），女，硕士研究生，从事生防微生物分子生态研究＊＊通讯作者：Ｔｅｌ：０１０－６２８９６６３４，Ｅｍａｉｌ：ｊｚｈａｎｇ＠ｉｐｐｃａａｓ．ｃｎ

６８生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００６年第５期

进行研究。以下将对ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术及其在土壤微生物分子生态学研究中的应用进行介绍。

传标记。扩增的ＳＳＵｒＤＮＡ片段的ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ条带数目和光密度可以反映一个样品中的微生物类群组成情况。因此对样品中所含的微生物的１６Ｓ

１ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ原理

变性梯度凝胶电泳ＤＧＧＥ是ＤＮＡ指纹分析法

ｒＤＮＡ序列进行测序和分析，已经成为环境微生物

研究的重要手段，在土壤微生物检测中也获得广泛应用［５，６］。

中的一种，最先是用于分析遗传突变的。１９９３年

Ｍｕｙｚｅｒ等首次用来研究自然环境微生物群落的多

样性与群落结构之后，该分析法就越来越广泛地被用于微生物分子生态学研究。温度梯度凝胶电泳

２

２．１

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ在土壤微生物分子生态学研

究中的应用

ＰＣＲ与ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合对土壤样品进行

研究

在ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ应用于微生物分子生态学的

ＴＧＧＥ是在ＤＧＧＥ的基础之上发展起来的［２］。二者

工作原理是根据ＰＣＲ扩增的基因或基因片段核苷酸序列的不同进行片段的分离。以同一套ＰＣＲ引物从混合的微生物扩增的ＤＮＡ片段，只要存在碱基的差异，解链特性也就会有差异，它们在含有化学变性剂尿素（Ｕｒｅａ）和甲酰胺（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）梯度的聚丙烯酰胺凝胶中泳动时（ＤＧＧＥ），在相应的变性剂浓度下在解链点（Ｍｅｌｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ）发生部分解链，造成各片段构象的不同，最终导致迁移率的不同并形成一定的带型；ＴＧＧＥ使用固定浓度的尿素和甲酰胺以促进ＤＮＡ解链，电泳时ＰＣＲ产物是在以线性温度梯度的凝胶中迁移，而造成不同ＤＮＡ片段解链时间的差异。理论上能够利用ＤＧＧＥ将只存在单碱基差异的小片段ＤＮＡ分开。在ＤＧＧＥ操作中，通常要利用引物在ＰＣＲ产物的一端加上一个富含ＧＣ碱基的片段，使ＰＣＲ产物的一端不能解链，从而不形成单链ＤＮＡ［３］。以１６ＳｒＤＮＡ基因为分子标记的ＰＣＲ－ＴＧＧＥ／ＤＧＧＥＤＮＡ指纹图技术可以同时对多个样品的微生物组成进行分析，一般种群数量超过１％的类型会在图谱中出现其代表性条带。ＤＮＡ指纹图技术适合于动态跟踪群落结构与功能在环境扰动下的动态变化情况。

在微生物分子生态学研究中最常用的基因对象是小亚基（ＳＳＵ）ｒＤＮＡ，如原核生物的１６ＳｒＤＮＡ和真核生物的１８ＳｒＤＮＡ或２８ＳｒＤＮＡ（以及ＩＴＳ序列）。目前对于１６ＳｒＤＮＡ已具有非常庞大的数据库，储存了大量的序列信息，截止到２００６年２月２日，ＲＤＰ数据库中１６ＳｒＤＮＡ序列的信息已经有

初期，通常是结合ＰＣＲ与ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术对环境土壤样品进行分析，以了解环境中的微生物群落的结构及其变化。首先提取微生物环境样品的总

ＤＮＡ，然后通过ＰＣＲ扩增特定类群的保守基因，扩

增产物进行ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ凝胶电泳分析，

观察

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图谱的带型差异。

Ｈｅｕｅｒ等利用ＰＣＲ结合ＤＧＧＥ分析方法对可

培养放线菌及自然环境微生物群落放线菌进行系统研究。结果表明，英国和古巴的两份土壤样品放线菌都超过１０６ＣＦＵ／ｇ土，但是它们的群落ＤＧＧＥ带型（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｐａｔｔｅｒｎ）或群落指纹（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ古巴土壤样品中存在相似的、ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）明显不同。

较多数量的高Ｇ＋Ｃ带，说明古巴的土壤样品放线菌的多样性较高，特别是非链霉菌类群［７］。Ｆｅｌｓｋｅ等扩增１６ＳｒＤＮＡ的Ｖ６～Ｖ８区，将得到的产物进行

ＴＧＧＥ分析，并根据ＴＧＧＥ图谱上带型及条带亮度

估计草地土壤样品中各类细菌１６ＳｒＤＮＡ的比例

［８］

。Ｓｍｉｔ分别以引物对ＥＦ４－ＥＦ３和ＥＦ４－ＮＳ３ＧＣ与引

物ＥＦ４－ｆｕｎｇ５和ＥＦ４－ＮＳ３ＧＣ结合ＴＧＧＥ分析小麦根际土壤真菌的组成、多样性和种群动态，获得了很好的带型和重复性［９］。Ｐｅｉｘｏｔｏ等通过ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术分别以编码ＲＮＡ聚合酶β亚基的ｒｐｏＢ和１６Ｓ

ｒＤＮＡ基因为标记来分析热带土壤中的细菌多样

性。ｒｐｏＢ基因的ＤＧＧＥ图谱条带组成较１６ＳｒＤＮＡ基因相对简单，便于描述和分析。Ｐｅｉｘｏｔｏ认为，１６Ｓ

２０５１６５种

［４］

，ＳＳＵｒＤＮＡ序列片段中存在着若干高

ｒＤＮＡ基因在细菌基因组上的多拷贝数使从ＤＧＧＥ

图谱的多样性评估复杂化，而ｒｐｏＢ基因在细菌基因组上为单拷贝，其ＤＧＧＥ图谱能够更易于分析［１０］。

冯炘以能够以呋喃丹为惟一碳源和氮源生长

保守区和高可变区碱基序列，它携带着物种的系统发育地位信息，不同的物种具有不同的ＳＳＵｒＤＮＡ序列，这些序列可用来作为区分生物系统进化的遗

２００６年第５期

周琳等：ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术在土壤微生物分子生态学研究中的应用

６９

的假单胞菌ＡＥＢＬ３作为生物强化菌对模拟呋喃丹污染的土壤环境进行了生物修复试验，１６Ｓ

（Ｆ９８４ＧＣ－Ｒ１０５７）可变区核苷酸探针，分别与等量的来自于克隆和细菌纯培养物的１６ＳｒＤＮＡ进行杂交，鉴定转基因马铃薯根围土壤样品群落指纹图中与分离到的菌株相对应的条带

［１４］

ｒＤＮＡ

扩增产物的变性梯度电泳结果揭示了生物修复过程中土壤微生物菌群结构的动态变化［１１］。任馨在实验室条件下通过秸杆还土试验，比较了转苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因（ｃｒｙ）水稻中ｃｒｙ基因表达最高期，秸杆和同一时期亲本稻秸杆的添加对水淹土壤可培养厌氧细菌数量和细菌群落组成的影响。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ指纹图谱和主成份分析（ＰＣＡ）结果表明，两种秸杆处理土壤细菌群落结构在培养的第

。由此，对于

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ电泳胶上重要的条带（如高丰度条带

或与某种环境因素变化相关的条带）可以采用标记方法与克隆文库或已知纯菌ＤＮＡ进行杂交，从而确定该条带所对应的微生物的分类地位。这对于土壤中不能培养的重要微生物的分析鉴定具有重要意义。

３周和第５周达到显著性差异，随着培养时间的延

长，两种秸杆处理土壤间细菌群落结构的差异逐渐减小，到培养的第１１周差异基本消失［１２］。卜元卿等模拟稻秸原位还田条件，对１６ＳｒＤＮＡＶ３可变区扩增产物进行ＤＧＧＥ分析，结果说明稻秸能够增加土壤细菌多样性，随着培养期的延长，施有稻秸的处理中土壤细菌群落多态性的变化远远复杂于对照土壤；同时发现在稻秸刺激下，不同土壤类型的细菌群落多态性高峰期出现时间不同［１３］。

以上研究表明ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ可以反映不同生境中或同一生境不同时段、不同处理下微生物群落的差异与变迁，从而分析环境条件、生物修复、秸杆还土等因素对土壤微生物的影响；同时也可结合相应类型的ＰＣＲ对群落组成成员进行量化分析。利用除１６ＳｒＤＮＡ外的、在某些微生物范围内具有一定变异性的单拷贝基因（如ｒｐｏＢ基因等）为对象进行ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ分析，可以有效降低指纹图谱的复杂度，便于分析。

２．３ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合克隆测序及种系分

析对土壤样品进行研究

随着土壤微生物分子生态学研究的不断深入，

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ与克隆测序及种系分析相结合，

对土壤样品进行研究，推动了土壤微生物分子生态学的进一步发展。该技术的一种方法是首先进行特定类群的保守基因的ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ凝胶电泳克隆建库和测序，从分析，对于目的条带进行回收、

而对环境中的重要微生物种群或受外界影响而显著变化的种群进行鉴定，监测它们的变化；另外一种方法是直接以ＰＣＲ产物建立克隆文库，然后将各克隆再以ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ引物扩增后，与环境样品扩增产物一起进行ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ电泳，根据电泳位置将样品中所有条带与特定的克隆一一对应，从而达到鉴定样品中条带的目的。

Ｋｏｗａｌｃｈｕｋ等采用嵌套式ＰＣＲ策略扩增得到５＇端携带ＧＣ夹的５６９ｂｐ的１８ＳｒＤＮＡ片段，对此

片段进行变性梯度凝胶电泳分析并进行克隆建库、测序和系统分类分析，鉴定了侵染滨草（Ａｍｍｏｐｈｉｌａ

２．２

标记技术与ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合对土壤样品

进行研究

ａｒｅｎａｒｉａ）的真菌种类主要为担子菌门和子囊菌门

的真菌［１５］，从而为滨草的防护提供了可靠准确的理论指导。Ｅｌｓａｓ等采用真菌特异性引物分析了经含有二苯并噻吩的石油处理的、随后接种了真菌哈茨木霉菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）和少孢节丛孢菌（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）的土壤样品中的真菌群落，ＰＣＲ－ＤＧＧＥ结果表明，随着时间的延长，二苯并噻吩处理过的土壤中，一些特异真菌的量不断累积，而未经过处理的对照土壤却没有反映出这种趋势；经过克隆测序分析，经过处理过的土壤中含量不断提高的条带均为丛赤壳属的甘薯根腐病菌

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ还可以与标记技术联合使用，其

技术流程是首先提取微生物环境样品的总ＤＮＡ，

ＰＣＲ扩增特定类群的保守基因，扩增产物进行ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ凝胶电泳分析，以从ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图

谱上回收的条带为原始模板，制备带有标记的核苷酸探针，再与来自于已知纯培养物的相应基因扩增产物进行杂交，来确定ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图谱上的特定条带的微生物种类，使ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ的技术更加完善。如，Ｈｅｕｅｒ等以ＴＧＧＥ图谱上回收的条带为原始模板，制备带有地高辛标记的１６ＳｒＤＮＡＶ６～Ｖ８

７０生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

２００６年第５期

（Ｎｅｃｔｒｉａｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）和镰孢属的茄病镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）的近缘种；而在培养基上菌落数增加的却为木霉属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）

和柱孢属

（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）［１６］。Ｇｏｍｅｓ等对热带种植的两个玉米品种的土壤和根际样品进行分析，在玉米的整个生长阶段都观察到了根圈效应，同时在不同的生长阶段真菌群落组成有明显的改变，但两个玉米品种间的真菌指纹图谱没有明显差异；在玉米幼苗期根际主要的真菌种群为子囊菌目的格孢腔亚目，而在成熟植株和衰老植株的则为子囊菌和担子菌酵母真菌

［１７］

是研究土壤微生物群落结构的一种可行方法［２０］。

综上所述，ＰＣＲ－ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ结合克隆测序及种系分析对土壤样品进行研究可以明确土壤样品中微生物群落的总体组成结构、具体成员的分类地位及相互之间的亲缘关系、种群动态变化，便于从整体上全面地分析，较传统培养法可提供更多、更全面、更准确的信息。此外，ＲＴ－ＰＣＲ－ＤＧＧＥ可以反映出土壤微生物群落在转录水平上的状况，能够进一步推测具体组成成员代谢活性的情况。总之，该方法在明确土壤中微生物组成以及动态变化的具体信息的同时，也对实际问题的诊断、作物生长跟踪监测、根际效应以及秸秆还田等农事操作都具有重要理论和实用价值。

更为重要的是，ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ图谱分析及克隆测序分析需要适宜的和强有力的生物信息学方法来分析和处理，以使结果更加清晰、明确和数字化，增加其可信度和提高实用性。目前使用较为广泛的主成分析方法包括聚类分析（Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ）［１８￣２１］、分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）［１２，２２，２３］、多维等级分析（Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｃａｌｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ，

。Ｄｕｉｎｅｖｅｌｄ也分别用常规ＰＣＲ和反转录

ＰＣＲ结合ＤＧＧＥ技术分析菊花不同生长发育阶段

中根际土壤和根尖的细菌群落结构和组成，结果表明优势细菌主要为假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、丛毛单胞菌属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、贪噬菌属（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）、醋杆菌属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、节杆菌属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ），而且总土壤的图谱要比根尖样品更复杂，图谱中各样品的条带回收克隆测序和聚类分析表明所有根尖样品的菌群聚为一簇，在此聚簇内幼苗根尖的菌群又都聚在一个亚聚簇内；而ＲＴ－

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ证实一些可检测到的优势菌群并不一

定具有很高的代谢活性，其克隆测序结果却显示了更为广泛的分类状况，表明根圈活性可能只是一些特定的种群引起的［１８］。

在实验室条件下，小麦秸秆粉和油菜秸秆粉还土试验的ＤＧＧＥ图谱分析表明，对照土壤（Ｓ，不经任何处理）以及处理土壤（ＳＷ，小麦秸秆粉还田处理和ＳＲ，油菜秸秆粉还田处理）培养过程中，β－

ＭＤＳ）［２４，２５］等。各种分析方法各具优缺点，可根据具

体的图谱信息和研究内容进行选择。

３

结语

在土壤微生物生态学的研究工作中，免培养

ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术的引入，虽然克服了培养过程中

的困难，提高了研究结果的真实性，但土壤中微生物种类和数量的变化本身就是一个极其多变的内容，面临的可变因素也是极为复杂的

［２６］

。土壤总

Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ类细菌组成都在发生变化，对其中一

个样品的ＤＧＧＥ条带进行了割胶测序，测序结果表明，大部分条带代表的微生物是未培养的或不可培养的，说明秸秆还田具有良好的土壤综合效应［１９］。王岳坤等对土壤的１６ＳｒＤＮＡＶ３片段进行ＰＣＲ－

ＤＮＡ提取的质量、效率以及后续的ＰＣＲ扩增都存

在一定的问题，要求熟练的技术和稳定的重复性。近年来诸多公司如ＭＯＢＩＯ公司等都开发了快速、高质量的土壤总ＤＮＡ提取及纯化试剂盒，大大加快和促进了ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术的广泛使用，同时也推动了土壤微生物分子生态学的飞速发展。

总之，ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术是以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法，在土壤微生物分子生态学研究中显示了其独特的优越性，已成为一个快速分析微生物群落结构的有力工具，大大拓展了人们对土壤微生物群落组成、结构及多样性的深入了解。

ＤＧＧＥ分析１６ＳｒＤＮＡＶ３片段的多态性分析，发现

地域因素和红树品种都是影响土壤细菌群落结构的因素。通过对杯萼海桑土壤１６ＳｒＤＮＡＶ３片段

ＰＣＲ产物两个ＤＧＧＥ条带进行分子克隆和序列测

定分析，发现每个ＤＧＧＥ条带包含着许多不同的

１６ＳｒＤＮＡＶ３片段，并且其中多数为ＧｅｎＢａｎｋ未收

录的序列。这表明ＤＧＧＥ和克隆技术相结合的方法

２００６年第５期周琳等：ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ技术在土壤微生物分子生态学研究中的应用

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ＨｅｕｅｒＨ，ＨａｒｔｕｎｇＫ，ＷｉｅｌａｎｄＧ，ｅｔａｌ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉ－

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（上接第５３页）

１０ＧｒａｙＷＲ，ＬｕｑｕｅＡ，ＯｌｉｖｅｒａＢＭ，ＢａｒｒｅｔｔＪ，ＣｒｕｚＬＪ．ＪＢｉｏｌ

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１１ＺｈａｎｇＲ，ＳｎｙｄｅｒＧＨ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０（４７）：１１３４３￣１１３５６．１２ＧｅｈｒｍａｎｎＪ，ＡｌｅｗｏｏｄＰＦ，ＣｒａｉｋＤＪ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，１９９８，２７８（２）：

４０１￣４１５．

１３ＫａｅｒｎｅｒＡ，ＲａｂｅｎｓｔｅｉｎＤＬ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，３８：５４５９￣５４７０．１４ＦｕｌｌｅｒＥ，ＧｒｅｅｎＢＲ，ＣａｔｌｉｎＰ，ＢｕｃｚｅｋＯ，ＮｉｅｌｓｅｎＪＳ，Ｏｌｉｖｅｒａ

ＢＭ，ＢｕｌａｊＧ．ＦＥＢＳＪｏｕｒｎａｌ，２００５，２７２（７）：１７２７￣１７３８．１５ＯｌｉｖｅｒａＢＭ．ＡｎｎｕＲｅｖＥｃｏｌＳｙｓｔ，２００２，３３：２５￣４７．

１６ＢｕｌａｊＧ，ＢｕｃｚｅｋＯ，ＧｏｏｄｓｅｌｌＩ，ＪｉｍｅｎｅｚＥＣ，ＫｒａｎｓｋｉＪ，Ｎｉｅｌｓｅｎ

ＪＳ，ＧａｒｒｅｔｔＪＥ，ＯｌｉｖｅｒａＢＭ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（２）１４５６２￣１４５６８．

１７ＲａｔｔｅｎｈｏｌｌＡ，ＲｕｏｐｐｏｌｏＭ，ＦｌａｇｉｅｌｌｏＡ，ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００１，

３０５（３）：５２３￣５３３．

１８ＷｅｉｓｓｍａｎＪＳ，ＫｉｍＰＳ．Ｃｅｌｌ，１９９２，７１（５）：８４１￣８５１．

１９ＩｋｅｍｕｒａＨ，ＴａｋａｇｉＨ，ＩｎｏｕｙｅＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９８７，２６２（１６）：

７８５９￣７８５４．

２０ＷｉｎｔｈｅｒＪＲ，ＳｏｒｅｎｓｅｎＰ．ＰｒｏｃＮａｔｉＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９１，８８

（２０）：９３３０￣９３３４．

２１ＢｕｃｚｅｋＯ，ＯｌｉｖｅｒａＢＭ，ＢｕｌａｊＧ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，（４３）：１０９３￣

１１０１．

２２ＢｕｃｚｅｋＰ，ＢｕｃｚｅｋＯ，ＢｕｌａｊＧ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００５，８０（１）：５０￣５７．２３ＦｒｅｅｄｍａｎＲＢ，ＨｉｒｓｔＴＲ，ＴｕｉｔｅＭＦ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ，１９９４，１９

（８）：３３１￣３３６．

２４ＫｕｂｏＳ，ＣｈｉｎｏＮ，ＫｉｍｕｒａＴ，ＳａｋａｋｉｂａｒａＳ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９９６，

３８（６）：７３３￣７４４．

２５ＤｅＬａＣｒｕｚＲ，ＷｈｉｔｂｙＦＧ，ＢｕｃｚｅｋＯ，ＢｕｌａｊＧ．ＪＰｅｐｔＲｅｓ，

２００３，６１（４）：２０２￣２１２．

２６ＡｎｆｉｎｓｅｎＣＢ．ＰＳｃｉｅｎｃｅ，１９７３，１８１（９６）：２２３￣２３０．

２７ＨｅｍｍｉｎｇｓｅｎＳＭ，ＷｏｏｆｏｒｄＣ，ＥｌｌｉｓＪ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３３

（６１７１）：３３０￣３３４．

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