肝糖原的提取、鉴定与定量

肝糖原的提取、鉴定与定量

一、实验目的

1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意

事项，掌握其操作方法。

3. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 4. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

（1）肝糖原的提取

糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

（2）肝糖原的鉴定

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，而葡萄糖具有还原性，实验可利用呈色反应和葡萄糖的还原性，从而判定肝组织中糖原的存在

呈色反应具体如下：

CuSO4 + 2NaOH == Na2SO4 + Cu(OH)2↓

2Cu(OH)2 + C6H12O6 == 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH == Cu2O↓(红色) + H2O Cu(OH)2 == CuO↓(黑色) + H2O

（3）肝糖原的定量

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10～100μg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。

利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分而保留肝糖原。

三、材料与方法：

（1） 实验材料 如下表所示

类别 实验样品 实验试剂

材料 鸡肝 1) 95％乙醇

2) 0.31mol/L(5％)三氯醋酸溶液 3) 0.15mol/L NaCl溶液

4) 12mol/L HCl：浓HCl原液（36%～38%）。 5) 12.5mol/L(50％)NaOH

6) 碘试剂：碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中（注：实

验室已配好）。

7) 班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O7?5H2O）173g和无水碳酸钠

（Na2C03）100g溶于蒸馏水800mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3％硫酸铜（CuSO4?5H2O）l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存（注：实验室已配好）。 8) 5.35mol/L(30％)KOH溶液

9) 标准葡萄糖液(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，

加蒸馏水溶解至500 mL（注：实验室已配好）。 10) 17mol/L(90％)H2SO4

11) 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100

mL。（即配即用，实验室已配好）

仪器及器材 1) 普通离心机，室温至100℃恒温水浴箱，722型分光光度计，

托盘天平两个

2) 剪刀，镊子，研钵，100mL容量瓶，白瓷反应板

3) 试管架，10mL离心管（2支）（注：实验中用玻璃试管代替离

心管），（15×100）mm试管（6支）

4) 刻度吸量管（2mL×1，5 mL×2），1000μL微量可调取液器

（2）实验步骤 1．实验流程：

肝糖原的提取与鉴定 鸡肝约1.0 g，剪碎

＋5ìl3COOH 1 ml

研磨至乳状

＋5ìl3COOH 3 ml

研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心3分钟（4000 r / min）

沉淀（弃去） 上清（取2 ml）

＋3ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟

离心5分钟（4000 r / min）

上清（弃去） 沉淀

＋蒸镏水1 ml

沸水浴2分钟，溶解沉淀

白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml

＋浓HCl 5滴

加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟，冷却 糖原溶液2滴 ＋50%NaOH 5滴

呈色对比 糖原水解液2滴 糖原水解液

＋班氏试剂4滴

混匀

沸水浴2分钟，观察变化

糖原的定量测定 鸡肝0.10 g

＋30%KOH 1.5ml

沸水浴15分钟

冷却，全部转入100 ml容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

糖原的测定

（2）实验步骤 1.糖原的提取与鉴定

1) 称取肝脏：称取约1.0g鸡肝。

2) 肝匀浆准备：在研钵中将肝脏组织剪碎，加入5%三氯醋酸1ml，将肝组织研磨至糜状，再加入5%三氯醋酸3ml。后以4000r/min 转速离心5min，取上清液。

3) 提取糖原：于上清液中加入等量95%乙醇，混匀后静置10min，后以4000r/min 转速离心5min，弃去上清液，白色沉淀即为糖原。加入1ml蒸馏水，并加热溶解。

4) 糖原鉴定：取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中，加入糖原溶液2滴，同时另一孔穴只加碘试剂2滴，做呈色对比。

5) 另取糖原溶液1ml并加入浓盐酸5滴于沸水浴中水解15min后使用班氏试剂在沸水浴中加热2min并观察现象。

2.糖原的定量测定

1) 糖原提取：称取0.15g鸡肝并置于试管中，在试管中加入30%KOH 1.5ml，沸水浴15min，取出后冷却，将管中内容物全部转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀。

2) 糖原测定：取洁净试管3支，分别为空白管、标准管、样品管，按下表加入相应试剂 试剂（ml） 蒸馏水 标准葡萄糖溶液 糖原提取液 0.2%蒽酮溶液

空白管 1.0 - - 2.5

标准管 - 1.0 - 2.5

样品管 - - 1.0 2.5

混匀后，沸水浴10min，冷却后在分光光度计620mm波长处使用空白管调零后测定各管吸光度（A），记录实验数据。 计算公式如下：

肝糖原(g/100 g肝组织) =

A

（3）注意事项： 1. 肝糖原提取：

向上清液中加入5mL95％乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95％乙醇，溶液分成两层。加之上清液已3mL多，总量接近9mL，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吹吸混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

2. 肝糖原鉴定：

糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20至30个之间呈紫色，60个以上的呈蓝

标准

A样品

×0.05

100

肝组织重(g)

100

×1.11 1000

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/lh17.html