生物技术专业大实验实验指导

《 生物技术专业大实验 》课程

课程编号：0741524966

实 验 指 导 书

主撰人 韩军丽 王雪青 金玉莲 赵培 审核人 王素英

天津商业大学 生物技术与食品科学学院

二零零九 年 十一月

前 言

1． 实验总体目标 使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，

提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。

⒉ 适用专业年级 生物技术专业第6学期

⒊ 先修课程 生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程 ⒋ 实验课时分配

实验项目 实验一 目的基因的PCR扩增 实验二 DNA片段的回收 实验三 DNA的连接 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验五 重组DNA的转化 实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒 实验七 重组质粒的酶切鉴定 实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测 实验九 细胞凝集反应 实验十 细胞膜的渗透性 实验十一 细胞工程基础实验技术 实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验十三 微藻规模化培养 实验实验每组实验 要求 类型 人数 学时 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 4 4 2 3 3 3 4 12 2 2 4 4 4

⒌ 实验环境 生物技术专业实验室 ⒍ 实验总体要求

进入实验室，必须穿实验服。保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。

⒎ 本实验的重点、难点及教学方法建议

本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。

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目 录

实验一 目的基因的PCR扩增 实验二 DNA片段的回收 实验三 DNA的连接

实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验五 重组DNA的转化

实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒 实验七 重组质粒的酶切鉴定

实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测 实验九 细胞凝集反应 实验十 细胞膜的渗透性 实验十一 细胞工程基础实验技术 实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验十三 微藻规模化培养

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实验一 目的基因的PCR扩增

一、实验目的

目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术之一。应用PCR技术分离目的基因是常用的方法之一。通过本实验的学习，要求学生掌握PCR技术的基本原理；掌握用PCR技术扩增目的基因的方法。 二、实验内容

设计特异引物，以含有目的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增目的基因。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR反应体系包括五种成分：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液（提供Mg2+、pH、离子强度）。PCR反应的基本步骤包括：（1）变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃）；（2）退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃）；（3）延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃）。 PCR反应体系的总体积一般为25μl～100 μl 。

为了提高PCR的扩增效率，PCR反应体系中各成分的浓度按如下原则调控：

（一）反应缓冲液：由纯水、KCl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。 Mg2+终浓度为1.5～2.0 mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。

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（二）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

（三）dNTPs：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。用量一般为0.5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

（七）引物：引物浓度一般为0.1～0.5 μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

为了提高PCR的扩增效率，PCR反应温度以及温度持续时间按如下原则确定：

（一）变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）预变性3～10min，然后再进入循环程序94℃变性30～60s。

（二）退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

（三）延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min即可。

PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预实验确定。

六、实验条件

1. 生物材料和试剂

质粒DNA，引物，Taq DNA聚合酶，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液，dNTPs，ddH2O

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1.将手洗净，用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作 2.点燃酒精灯，将镊子在酒精灯下烤干 3.取一无菌培养瓶，打开烧瓶口

4.用无菌镊子从已培养的长春花愈伤组织中

5.取出2mm2左右的愈伤组织5块，分别接种在新的MS培养基上 6.快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期 7.接种后的三角瓶置于25°C条件下，黑暗培养

八、思考题

怎样保证愈伤组织传代过程中不被污染？

九、实验报告

填写长春花愈伤组织诱导情况统计表

编号 1 2 3 4 每瓶接种数 愈伤组织成活率（%） 愈伤组织的状态（颜色、状态） 污染率（%） 要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。

十、注意事项及其它说明

规范使用实验仪器，并注意电源安全。

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实验十三 微藻规模化培养

一、实验目的

了解海洋微藻的生长环境及其生物活性物质的应用，观察海洋微藻的形态 二、实验内容 利用生物反应器生产微藻

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

海洋微藻是海洋生态系统中的最主要初级生产者,也是海洋生物资源的重要组成部分，具有种类多、数量大、繁殖快等特点,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。微藻本身营养丰富,富含蛋白质，可以作为单细胞蛋白（SCP）的一个重要来源，同时微藻含有丰富的生物活性物质,尤其是一些有独特医疗功效的物质（如β-胡萝卜素、藻兰素等色素类、抗生素类、抗病毒类、抗真菌类、细胞毒素和抗癌类，还有微藻脂肪酸、多糖、维生素、甾醇等），它们对生物体内的代谢过程和各种生化反应有活性作用，对人类的多种疾病（如肿瘤、癌、心血管疾病、艾滋病等）具有特殊的疗效，是重要的药物资源；有些还可直接或经加工后用于化工、食品工业和饲料工业等。因此，海洋微藻是一个巨大的生物资源，微藻的培养就成为各方面探索的基础。摸索出微藻生长的最适条件就可以大量的培养以满足日益增长的研究需要。

六、实验条件

（一）仪器

1三角瓶（100ml ～ 1000ml的规格不等） 2烧杯 3分析天平 4加热器 5蒸汽灭菌锅 6净化超净台

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7移液枪（1000ul） 8酒精灯 9离心机等 （二）材料 实验室现有藻种 （三）试剂 已配好的f/2培养基

七、实验步骤

1仪器灭菌：将微藻培养用的三角瓶以封膜封口，121℃湿热灭菌20分钟，冷却备用。 配制人工海水：按照海水配方（配方见附录）配制人工海水，装入三角瓶（每瓶1000ml），加热灭菌后，冷却备用。

2配制f/2培养基：以人工海水为基础，加入f/2培养基营养盐，制备培养基。

海洋微藻接种：在250 ml的三角瓶中，加入100 ml f/2培养基，按照10%的接种量接种藻液。 3微藻的培养：接种后的藻液瓶置于装有日光灯的架台上，培养温度25～30℃，光照周期12：12，每日摇瓶2～3次，同时观察藻种的生长情况，随时进行适当的调整。

4藻体细胞的收集：微藻培养7～10天就进入对数生长期，可以回收藻体细胞，将藻液以4500 r/min的速度离心15分钟收集藻体，冻存藻泥或真空冻干成藻粉保存已备后续分离活性物质实验。

八、思考题

1影响微藻生长的因素有哪些？ 2微藻的实际应用有那些？

九、实验报告

要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。

十、注意事项及其它说明

规范使用实验仪器，并注意电源安全。

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3．比较蛋白质检测方法中染色法与印迹法的异同 4．比较ELISA和western blotting的异同

5．Western blotting中如何减少非特异性条带的出现？

九、实验报告

要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。

十、注意事项及其它说明

规范使用实验仪器，并注意电源安全。

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实验九 细胞凝集反应

一、实验目的

观察细胞凝集现象并了解其原理。 二、实验内容

用土豆凝集素对鸡血细胞进行凝集反应。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分支状糖分子有关。

凝集素（lectin）是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合或的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子廉洁，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

六、实验条件

1． 土豆块茎

2． 显微镜，粗天平，载玻片，滴管2支，离心管2支 3． PBS缓冲液 4． 2%红细胞液

七、实验步骤

1．称取土豆去皮块茎2g，加10mL PBS缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素。

2．用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞各一滴，置载玻片上充分混匀。静置20min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。

3．以PBS液代替土豆凝集素与2%红细胞做对照实验。

八、思考题

1．如何检测红细胞表面哪些成分与土豆凝集素发生反应？

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2. 试举出其他凝集素引起细胞凝集反应的例子

九、实验报告

要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明

规范使用实验仪器，并注意电源安全。

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实验十 细胞膜的渗透性

一、实验目的

了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 二、实验内容

将红细胞置于不同的等渗溶液中，观察溶质能否进入细胞以及进入细胞的速度。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

将红细胞放入各种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血。由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。

六、实验条件

1． 器材：50mL小烧杯，10mL移液管，试管，试管架，显微镜

2． 试剂：0.17mol/L NaCl，0.17mol/L NH4Cl，0.17mol/L NH4Ac，0.17mol/L NaNO3，0.12mol/L

草酸胺，0.12mol/L Na2SO4，0.32mol/L葡萄糖，0.32mol/L甘油，0.32mol/L乙醇，0.32mol/L丙酮。 3． 材料：鸡血

七、实验步骤

4． 鸡血细胞悬液

取50mL小烧杯一只，加1份羊血和10份0.17mol/L NaCl，混匀成不透明红色液体。此即为稀释鸡血。

5． 低渗溶液

取试管一支，加入蒸馏水10mL和稀释鸡血1mL，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。

6． 鸡红细胞的渗透性

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（1）取试管一支，加入0.17mol/L NaCl 10mL和稀释鸡血1mL，轻轻摇动，注意观察颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？

（2）取试管一支，加入0.17mol/L NH4Cl 10mL和稀释鸡血1mL，轻轻摇动，注意观察颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入稀释羊血到溶液变成红色透明澄清所用时间）。

（3）分别在另外8种等渗溶液中进行同样的誓言。步骤同2。 （4）平行取样品于显微镜下观察细胞形状变化

八、思考题

除了用溶血时间标志各种低渗溶液的溶血作用，还有哪些方法可以采用？能否定量表示？

九、实验报告

将观察到的现象记入下表，对实验结果进行比较和分析。

表1 不同低渗溶液下的溶血现象

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 试验溶液 蒸馏水 NaCl NH4Cl NH4Ac NaNO3 草酸胺 Na2SO4 葡萄糖 甘油 乙醇 丙酮 是否溶血 时间 结果分析 要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。

十、注意事项及其它说明

进入实验室，必须穿实验服。保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。规范使用实验仪器，并注意电源安全。

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实验十一 细胞工程基础实验技术

一、实验目的

学会并掌握微藻培养基的配置方法；植物细胞培养基MS的配制；动物细胞RPMI1640培养基的配制，各种附加成分母液的配制；灭菌方法。 二、实验内容

常用植物细胞培养基MS母液的配制以动物细胞培养中各种附加成分母液的配制；培养基的配制；灭菌。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

每种微藻都有最适宜的培养基，但海水藻以f/2为一般培养基，淡水藻以朱氏10号或BG11为一般培养基，若培养螺旋藻采用AB培养基。无论哪种培养基由于试验的需要，常常要求在短期时间内获得大量的培养物，所以在微藻允许范围内富集大量营养元素，加速藻的生长。

植物培养基中含有外植体生长所需的营养物质，是组织培养中外植体赖以生存和发展的基地。培养基的成分大致可分五类即水、无机营养、有机营养、植物生长物质和天然附加物。MS(Murashige和Skoog,1962)培养基含有较高的硝态氮和铵态氮，适合于多种培养物的生长。此外还有N6、B5培养基等。应根据培养的目的选择一种适宜的培养基。本实验制备MS培养基。 动物细胞培养中培养基培养基为RPMI1640，主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些辅助物质。胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。

六、实验条件

（一） 仪器 1. 高压灭菌锅 2. 电磁炉

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3. 纯水仪 4. 电子天平 （二） 材料 微藻培养所需 1. KCl 2. KBr 3. NaF 4. SrCl2·6H2O 5. H3BO3 6. MgCl2·6H2O 7. Na2SO4 8. NaHCO3 9. CaCl2 10. NaCl 11. NaNO3

12. NaH2PO4 13. Na2SiO3·9H2O 14. FeC6H5O7·5H2O 15. ZnSO4·4H2O 16. MnCl2·4H2O 17. CoCl2·6H2O 18. Na2EDTA 19. CuSO4·5H2O 20. Na2MoO4·2H2O 21. VB12

22. VB1等 植物愈伤组织传代所需1. 萘乙酸 2. 苄基氨基嘌呤 3. 硝酸铵

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4. 硝酸钾 5. 氯化钾 6. 硫酸镁 7. 磷酸二氢钾 8. 碘化钾 9. 硼酸 10. 硫酸锰 11. 硫酸锌 12. 钼酸钠 13. 氯化钴 14. 硫酸铜 15. 硫酸亚铁 16. 乙二胺四乙酸二钠 17. 甘氨酸 18. 烟酸 19. 盐酸吡多醇 20. 盐酸硫胺素 21. 肌醇 22. 蔗糖 23. 琼脂

24. 三角瓶（50 mL）

25. 棕色瓶（100 mL ，500mL，1000 mL） 26. 镊子

27. 玻璃烧杯（100 mL ，500mL，1000 mL）28. 玻璃棒 29. 棉塞或封口膜 30. 记号笔 肿瘤细胞传代所需 1. RPMI-1640培养基 2. 胎牛血清

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3. NaCl 4. KCl

5. Na2HPO4?H2O 6. KH2PO4 7. CaCl2 8. MgSO4?7H2O 9. 葡萄糖 10. 胰酶 11. EDTA 12. 三蒸水 （三） 试剂 微藻培养所需 1人工海水配方

KCl 0.664 g/L； KBr 0.096 g/L； NaF 0.003 g/L； SrCl2·6H2O 0.024 g/L； H3BO3 0.026 g/L； MgCl2·6H2O 4.981 g/L； Na2SO4 3.917 g/L； NaHCO3 0.192 g/L； CaCl2 1.102 g/L； NaCl 23.476 g/L； 2 f /2培养液的配方

（1）NaNO3 74.8 mg/L； （2）NaH2PO4 4.4 mg/L； （3）Na2SiO3·9H2O 11 mg/L； （4）FeC6H5O7·5H2O 3.9mg/L （5）微量元素母液配方 1000?

ZnSO4·4H2O 23 mg/L；

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MnCl2·4H2O 178 mg/L； CoCl2·6H2O 12 mg/L； Na2EDTA 4.35 g/L； CuSO4·5H2O 10 mg/L； Na2MoO4·2H2O 7.3 mg/L （6）维生素母液配方 1000?

VB12 0.5 mg/L； VB1 100 mg/L 3朱氏10号培养基配方：

Ca (NO3)2 0.04 g； K2HPO4 0.04 g； MgSO4·7H2O 0.025 g； Na2CO3 0.02 g； Na2SiO3 0.025 g； FeCl3 0.0008 g； H2O 1000 ml；

培养基中的三价铁离子用量极少，为保证用量，将其配制成100倍的母液。由于实验室中的FeCl3 含有结晶水，所以称量0.13g的FeCl3·6H2O用100 ml蒸馏水溶解即为母液，每1000 ml培养基中加入1ml。

4AB培养基，其配方成分如下表所示

AB 培养基配方（L）

Working solution:

glass–distilled water 993ml

NaHCO3 13.61g Na2CO3 4.03g KH2PO4 0.5g NaNO3 2.5g K2SO4 1g NaCl 1g

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MgSO4·7H2O 0.2g CaCl2·2H2O 0.04g PIV metal solution 6ml A5–solution 1ml Vitamin 0.15μg

A5–solution:

To 100ml of glass–distilled water, all the following salts in the amounts indicated:

H3BO3 286mg MnCl2·4H2O 181mg ZnSO4·7H2O 22mg MnSO4·7H2O 250mg CuSO4·5H2O 7.4mg Na2MoO4 2.1mg

PIV metal solution:

To 1000ml of glass–distilled water, all 0.750g of Na2EDTA, and dissolve fully. Add the following salts in the amount indicated:

FeCl3·7H2O 97mg MnCl2·4H2O 41mg ZnCl2 5mg CoCl2·6H2O 2mg Na2MoO4·2H2O 4mg 植物愈伤组织传代所需 1.MS基本培养基贮液： 大量元素/g·L-1 (10×) NH4NO3 16.5 KNO3 19 CaCl2·2H2O 4.4 MgSO4·7H2O 3.7 微量元素/mg·L-1 (100×) KI 83 H3BO3 620 MnSO4·4H2O 2230 ZnSO4·7H2O 860 铁母液/g·L-1 （100×） NaEDTA·7H2O 3.73 有机营养/mg·(100mL)-1 (100×) 肌醇 1000 FeSO4·7H2O 2.78 烟酸 5 盐酸吡哆醇 5 盐酸硫胺素 1 36

KH2PO4 1.7 NaMoO4·2H2O 25 CoCl2·6H2O 2.5 CuSO4·7H2O 2.5 甘氨酸 20 2. 1mol/L NaOH 3. 1mol/L HCl 4. 生长调节剂贮液

（1）10-3 mol/L的萘乙酸溶液：

称取18.6mg的萘乙酸溶液用少量1mol/L NaOH溶解后，用水稀释并定容至100mL。 （2）10-3 mol/L的苄基氨基嘌呤溶液：

称取22.5mg的6-苄基氨基嘌呤，用少量1mol/L HCl溶解后，用水稀释并定容至100 mL。 5.70%或75%的消毒酒精（用95%的医用酒精配制） 肿瘤细胞传代所需

常用平衡盐溶液配方（g/L）

试剂 NaCl KCl Na2HPO4?H2O KH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgSO4?7H2O 葡萄糖 PBS 8.00 0.20 1.56 0.20 D-Hank’s 8.00 0.40 0.06 0.06 0.35 Hanks 8.00 0.40 0.06 0.06 0.35 0.14 0.20 1.00

七、实验步骤

微藻培养基所需

将f /2 培养液的6种营养盐分别配置成母液，而后121℃、20 min湿热灭菌，（1）~（5）号营养盐冷却后常温保存，维生素溶液4℃ 冷藏保存。

按照配方配制人工海水，然后进行加热灭菌，冷却至室温，无菌操作加入f /2 营养盐，（1）

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~（4）号溶液各 1 ml ，微量元素和维生素各 0.5 ml，混匀即为海藻培养基，备用。

朱氏10号及AB培养基的配法相似。 植物愈伤组织传代所需

1将各种贮液按一定比例混合，配制成MS基本培养基。

2分别加入一定浓度的NAA和BA（在10-6-10-7mol/L范围内，植物愈伤组织NAA和BA的浓度比为1，也可设计不同浓度的生长调节剂组合诱导生根生芽）。 3培养基中加入3%蔗糖，0.7%琼脂。加去离子水到一定体积。 4用1N的NaOH调pH至5.8。

5将培养基煮沸，分装到50 mL三角瓶中。每瓶15-20 mL左右。用封口膜或棉塞包扎瓶口。 6将三角瓶放入高压灭菌锅，在120℃、1200Pa下灭菌15min。待温度降低到105℃以下，打开放气阀排气后，取出三角瓶、平放冷却备用。

7按上述方法高压灭菌去离子水，烧杯，培养皿和相关用具。 注意事项：

1.在配制植物激素时，溶解试剂的NaOH和HCl用量要少，用蒸馏水稀释时，慢慢沿烧杯内壁加入。

2.对培养基和材料及器皿的灭菌要严格。

3.分装培养基时，不能把培养基沾附到瓶口上，以免引起污染。 肿瘤细胞传代所需 1RPMI1640培养液

称10.4g粉末(市售进口产品一般为一包)，溶于1000mL三蒸水中，待溶解后通入CO2约5分钟，至液体呈柠檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺，或先用1 N HCl调至pH6.8以下，后用1 N NaOH调至pH7.2～pH7.4；用无菌玻璃滤器或金属滤器0.22μm或0.3μm微孔滤膜过滤除菌，按所需量分装,置低温保存。 2平衡盐溶液配制

配制所需用水均为三蒸水，以配制Hanks（1L）液为例: a、 称量，将CaCl2溶于100 ml水中； b、 将其他成分依次溶于800ml水中； c、 缓慢将a倒入b中，搅动防止沉淀； d、 补水加至1000 ml混匀；

e、 分装至试剂瓶或盐水瓶中，10－20 min高压灭菌，4 ℃保存；

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f、 调节pH值到7.2~7.4。 3消化液配制

所需试剂为胰酶（0.25 %）、EDTA (0.02 %) 和D-Hank’s液，以配制100 ml为例： a、 量取80 ml D-Hank’s液，加入0.02 g EDTA，搅拌至完全溶解； b、 往a中加入0.25 g 胰酶，玻璃棒搅拌助溶； c、 调节pH值至7.4。

d、 0.22 μm滤器过滤除菌装入螺口试剂瓶，4 ℃保存备用。 4胎牛血清处理

一般来说，未使用的胎牛血清使用前需要在56 ℃水浴锅中水浴处理20～30 min，以灭活补体。由于胎牛血清一般需 －20 ℃保存，且应尽量减少反复冻融过程，所以灭活后应进行分装。

八、思考题

1. f/2培养基配置时的加样顺序应注意哪些，为什么

2. MS培养基的组成成分有哪几类，在离体培养中的功能是什么？ 3. 胰蛋白酶的作用是什么？

九、实验报告

制备好待用的

1. f/2、朱氏10号和AB培养基 2. MS培养基 3. RPMI1640培养基 4. 平衡盐溶液 消化液等

要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。

十、注意事项及其它说明

规范使用实验仪器，并注意电源安全。

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实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术

一、实验目的

熟悉无菌操作，掌握接种愈伤组织及观察愈伤组织生长状态的方法。 二、实验内容

选取不同的外植体和培养基，进行接种培养观察愈伤组织的诱导和器官发生的过程，了解和基本掌握植物组织、器官离体培养的调控技术。

三、实验要求

集中授课

四、实验准备

在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。

五、实验原理、方法和手段

植物已经分化的细胞在切割损伤或在适宜的培养基上可以诱导形成失去分化状态的结构均一的愈伤组织或细胞团。一般诱导愈伤组织的培养基中含有较高浓度的生长素和较低浓度的细胞分裂素。细胞的分裂增殖，使得愈伤组织不断生长。如果把处在旺盛生长且未分化的愈伤组织切成小块进行继代培养，就可维持其活跃生长。维持愈伤组织需同等浓度的生长素和较低浓度的细胞分裂素。经过多代继代培养的愈伤组织还可用于悬浮培养、单细胞培养研究、细胞育种和分离原生质体等。

六、实验条件

（一）仪器 1．光照培养箱 2．超净工作台 （二）材料 1. 长春花愈伤组织 2. 已灭菌的MS培养基

3. 酒精（95%的医用酒精，100%的工业酒精） 4. 镊子

七、实验步骤

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