人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

复旦大学

硕士学位论文

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

姓名：王秀华

申请学位级别：硕士

专业：儿科学/心胸外科

指导教师：贾兵

20070420

论文独创性声明

本论文是我？＋入在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论支中滁了蒋裁热强标注兽爨致落麓缝方羚。不瓴含英缝久或其它梳猕已翌发表或撰篝适的研究成果。其池同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的鸯明并表示了谢意。

俸誊麓名：至整聋．量期：２２：点：！主

论文使用授权声明

本人完全了瓣复量大学有关漂辫、蓬震学霞论文的缓定，霹：掌校有权景譬送交论文的夏印件，允许绝文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部势内容，可以采用影；ｎ、缩印或其它复制手段保存沦文。保密的论文在解密后遵守此疑定；

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导师蕊名怍者签名：ｊ丧笪‘－。。。。一‘。。。。＿。。。＿。。。。＿。●＿＿一京日期：ｏ７．１、－ｊ§

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

中文摘要

目的：

诱导脐血来源内皮祖细胞分化为内皮细胞，探索分离、培养以及鉴定脐血来

源的内皮祖细胞方法，探讨其用作组织工程心血管修复物种子细胞来源的可行

性。

材料和方法：

新鲜脐血１５份，采用６％羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法联合应用分离

脐血单个核细胞。根据所用的细胞培养液的不同，将实验分两组：诱导组和未诱

导组。诱导组是在含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ加ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ等多种生长因子的条

件培养液中培养；未诱导组是在含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ不加生长因子的基本培养

液中培养。从以下几个方面对脐血来源内皮祖细胞进行鉴定：在倒置相差显微镜

下进行贴壁细胞形态学观察，电镜下观察细胞特征性的超微结构，免疫荧光显微

镜和流式细胞仪检测内皮细胞特征性表面标志ｖＷＦ、ＶＥＧＦＲ－２和ＣＤｉ３３，测定

细胞培养液中一氧化氮（ＮＯ）含量分析细胞的功能，观察细胞的增殖能力等。

结果：

从新鲜脐血中得到的单个核细胞数平均为（３．４＋２．１）Ｘ１０７／ｍＬ。诱导组

贴壁细胞培养分化过程中细胞形态发生了改变，从小圆形变成梭形，形成集落样

生长，２周左右分化成典型成熟内皮细胞的铺路石样形态。而未诱导组细胞集落

少，未见铺路石样形态细胞。７天后免疫荧光检测发现诱导组细胞明显表达内皮

细胞特异性标志ｖＷＦ和ＶＥＧＦＲ－２，偶有ＣＤｌ３３表达。而未诱导组无此明显阳

性反应。流式细胞仪分析诱导组单个核细胞经诱导分化后细胞表面表达ＣＤｍ下

降，从（３．１１±１．０５）％下降至（Ｏ．０９＿＋０．０２）％，Ｐ＜０．０５。透射电镜观察到诱导组

培养１４天的细胞胞浆中已出现典型的内皮细胞超微结构，即Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体。

培养１４天培养液中ＮＯ含量测定的结果显示：未诱导组、诱导组和人成熟脐静

脉内皮细胞培养液中ＮＯ含量分别为（１２．４３±４．５１）ｕｍｏｌ／Ｌ、（５２．０７±２．１７）ｕｍｏｌ／Ｌ

和（８３．６５±６．１４）ｕｍｏｌ／Ｌ，３组数据间两两比较Ｐ值均＜ｏ．０５。诱导组培养液中ＮＯ

含量显著高于未诱导组，但低于成熟内皮细胞，细胞已具备部分成熟内皮细胞的

功能。诱导组细胞较未诱导组细胞增殖快，细胞原代培养２周左右，细胞数量即可达到１０５左右。

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

结论：

１．采用６％羟乙基淀粉（ＨＥＳ）沉降法和Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ分层法联合应用从脐血中

分离出的单个核细胞中存在内皮祖细胞。

２．利用含ＶＥＧＦ等细胞因子的条件培养液可以将内皮祖细胞在体外诱导分化为

内皮细胞。

３．采用综合方法从细胞形态、特殊表面标志、细胞超微结构、产生ＮＯ的功能

以及增殖能力等方面可以鉴定内皮祖细胞。

４．脐血来源内皮祖细胞具有较强的分化增殖能力，细胞总数可达到１０８以上，能

够满足血管组织工程对种子细胞数量的要求，部分具备内皮细胞的功能，提示分

化的内皮细胞可能具有用作构建组织工程心血管修复物种子细胞的可行性。

关键词：

脐血内皮祖细胞内皮细胞组织工程

中图分类号：Ｒ７２（９）２

人脐血来源内皮租细胞的分离，培养及鉴定

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｏｆｈｕｍａｎｃｏｒｄｂｌｏｏｄ

ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ＂

Ｔｏｉｎｄｕｃｅｃｏｒｄｂｌｏｏｄｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ（ＥＰＣｓ）ｉｎｔｏ

ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇ，ｃｕｌｔｕｒｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｌｙｉｎｇＥＰＣｓ

ｏｆｈｕｍａｎｃｏｒｄｂｌｏｏｄａｎｄｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓａｓｔｈｅｓｅｅｄｃｅｌｌｓｏｆｔｉｓｓｕｅ

ｅｎ西ｎｅｅｒｉｎｇｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．

ＭａｔｅｒｉａｌａｎｄＭｅｔｈｏｄ：

ｃｏｒｄｂｌｏｏｄｗｅＴ｜ｅｕｓｅｄ．ＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＦｉｆｔｅｅｎｈｕｍａｎ

ｆｒｅｓｈｃｅｌｌｓⅥ恤ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｏｒｄｂｌｏｏｄｂｙ６％ＨＥＳａｎｄｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｏｇａｔｉｏｎ。Ｔ１１ｉｓｓｔｕｄｙｗａｓ

ｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔＯｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉｕｍ：ｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｕｎｉｎｄｕｃｅｄ

ｇｒｏｕｐ．Ｉｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ．ｃｅｌｌｓ

ＳＯｏｎｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｉｎｕｎｉｎｄｕｃｅｄＩ∞ＡＦＢＳＤＭＥＭｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＶＥＧＥｂＦＧＦａｎｄａｎｄｇｒｏｕｐ，ｃｏｉｌｓＩＯ％ＦＢＳ

ＤＭＥＭ．Ａｔｔａｃｈｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔ

ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｕＲｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｅｌｌｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎ

ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｍａｒｋｅｒｓｏｎｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ：ｖＷＦ，ＶＥＧＦＲ一２

ａｎｄｆｌｏｗａｎｄＣＤｌ３３ｏｆｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｅｖａｌｕａｔｅｄｓｔａｉｎｉｎｇｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｎｉｔｒｉｃｂｙｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮＯｌｅｖｅｌｉｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍａｎｄａｂｉｌｉｔｙｔＯ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｏｂｓｃｒｖｅｄｕｎｄｅｒｐｈａｓｅｃｏｎｆｆａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．

Ｒｅｓｕｌｔ：

ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｒｅｓｈｃｏｒｄｂｌｏｏｄＷａｓ（３．４±

２．１）×１０７／ｍＬ．Ｉｎｉｎｄｕｃｅｄ

ｂｅｉｎｇｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆａｔｔａｃｈｅｄｃｅｌｌｓｃｈａｎｇｅｄｗｈｉｌｅｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｉｎｄｕｃｅｄ，ｆｒｏｍｓｍａｌｌ—ｓｉｚｅｄｒｏｕｎｄｃｅｌｌｓｔＯｓｐｉｎｄｌｅ－ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ．ｆｏｒｍｃｅｌｌ

ｃｌｕｓｔｅｒｓ．ｔＯｔｙｐｉｃａｌ“ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ”ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａ／ｋ＇ｒ

ｎｏ２ｗｅｅｋｓ．Ｉｎｕｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ，７ｄａｙｓｏｆｔｈｅｒｅｗｅｒｅｌｅｓｓｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓａｎｄｔｙｐｉｃａｌ＂ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ”ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ＡｆＩｃｒ

ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｖＷＦａｎｄＶＥＧＦＲ－２ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ３

ｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐｏｂｖｉｏｕｓｌｙｗｈｉｌｅｔｈｅｒｅｗａｓａｌｍｏｓｔｎｏＣＤｌ３３ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｉｎｕｎｉｎｄｕｃｅｄ

ｇｒｏｕｐ，ｎｏｓｕｃｈｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ、ｖｉｔｌｌｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌ，

ＦＡＣＳｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｅｌｌ

１４ｍａｒｋｅｒｄａｙｓｏｆＣＤｌ３３ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（３．１ｌ±１．０５）％ｔｏ（０．０９±０．０２）％，Ｐ＜０．０５．Ａｆｔｅｒ

ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｅｉｂｅｌ－Ｐａｌａｄｅｂｏｄｉｅｓ，ｗｈｉｃｈ眦ｔｈｅｏｎｕｌｔｍｓｌｒｕｃｕｒｅｓｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｗｅｒｅｓｈｏｗｎｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ

ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓｉｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ

ｕｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ，ｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｍａｔｕｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｌｅｖｅｌｏｆＮＯｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅ（１２．４３±ｃｅｌｌｓ

４．５１）ｕｍｏｌ／Ｌ、（５２．０７４－２．１７）ｕｍｏｌ／Ｌａｎｄ（８３．６５ｑ－６．１４）ｕｍｏＦＬ，ｐ＜０．０５．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ

ＮＯｉｎｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐＷａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｕｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ，ｂｕｔｌｏｗｅｒｔｈａｎ

ｔｈａｔｏｆｔｈｅｍａｔｕｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌｓｉｎｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｍｏｒｅｑｕｉｃｋｌｙ

ｔｈａｎｔｈａｔｏｆｕｕｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓａｍｏｕｔｅｄｔｏ１０５ａｆｔｅｒ２

ｗ∞ｋｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅ．

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：

１．Ｍｏｎｏｎｕｃｌｃａｒｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｂｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｆｒｅｓｈｃｏｒｄｂｌｏｏｄｂｙ６％ＨＥＳａｎｄｄｅｎｓｉｔｙ

ｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅＷｅｌ＇ｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｉｎｃｏｒｄｂｌｏｏｄ

ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ．

２．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ

ＳＯｏｎｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ１０％ＦＢＳＤＭＥＭｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔＩｌＶＥＧＦ，ｂＦＧＦａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．

ｂｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｍａｒｋｅｒｓ

ｔｏｏｎ３．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ，ｕｉｔｒａｓｔｒｕｏｍｅ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ．ｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｅＮＯａｎｄａｂｉｌｉｔｙｔｏ

４．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍｃｏｒｄｂｌｏｏｄｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｈａｄ

ｇｒｅａｔａｂｉｌｉｔｙｔｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅａｎｄｔｈｅｔｏｔａｌｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓ

ｎｕｍｂｅｒｕｍｏｕｔｅｄｏｆｔｉｓｓｕｅｔｏ１０Ｓ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｓａｔｉｓｆｙｔｈｅ

ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ

ｐｏｓｓｉｂｌｙｈａｄｎｅｅｄｅｄｏｆａｓｔｈｅｓｅｅｄｃｅｌｌｓｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｈａｄｐａｒｔｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｔｈｅｃｅｌｌｓ，ＳＯｉｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｙｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆａｓｓｅｅｄｃｅｌｌｓｏｆｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ

ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ｃｏｒｄｂｌｏｏｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４

刚舌

我国先天性心脏病的发病率为７‰，每年估计新发病例近２０万。目前我国

先天性心脏病的外科治疗病例中约４５％需要应用修复材料。目前Ｉ临床常用的血管

修复材料主要有两类，即天然血管和人工血管。天然血管包括自体血管和同种异

体血管，其缺点是来源极其有限，对机体造成了新的创伤。人工血管如聚四氟乙

烯，其缺点是因缺乏内膜，易形成血栓；顺应性差，缝合处易撕裂；缺乏生长能

力，需再次手术；再狭窄率２０－３０％，５年通畅率＜２０％。故目前临床上仍然缺乏

理想的血管替代物。

组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织

或器官的新兴学科。１９８７年由美国研究者首先开始该领域的研究。组织工程构

建的三要素是种子细胞、生物材料和组织构建，其中种子细胞是关键和前提。

组织工程心血管修复材料早期研究的种子细胞主要从机体自身动脉或静脉

获得内皮细胞，细胞来源有限，而且对供体具有创伤性，在小儿尤其新生儿心血

管病例更为困难。更重要的是，来源于成熟血管的内皮细胞多为终末分化细胞，

易老化，扩增数量有限，不能满足血管构建对大量种子细胞的要求。因此寻找初

期分化细胞来源的内皮种子细胞已成为血管组织构建的关键。

干细胞技术的成熟加速了心血管组织工程的发展。内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ

ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＥＰＣｓ）是血管内皮细胞的前体细胞，有分化为血管内皮细胞的能

力，又称血管母细胞（ａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）或血管内皮干细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ），１９９７

年由Ａｓａｈａｒａ！ｌＪ等首次从成人外周血分离，在生后机体的血管新生中起重要作用。

近来大量研究表明骨髓、脐血、外周血、胚胎组织、脂肪组织等中富含内皮祖细

胞，骨髓和脐血中此种细胞的含量和增殖能力远高于外周血１２】，在ＶＥＧＦ或缺血

刺激下可以增生、分化为内皮细胞，它在体内具有明显的内皮修复以及促血管新

生作用口１，这提示ＥＰＣｓ有可能作为组织工程血管的种子细胞来源。

胚胎组织的获取和实验存在很多伦理方面的争论，循环血液中ＥＰＣｓ数量稀

少，采集足够数量的ＥＰＣｓ技术上比较困难，脂肪组织中ＥＰＣｓ获取需要手术采集大量脂肪组织，损伤较大。骨髓的获取具有侵入性。因此我们选取了脐血作为

人脐血来源内皮祖细胞的分离，培养及鉴定

ＥＰＣｓ的来源。探索由脐血来源内皮祖细胞分化的内皮细胞作为组织工程血管的

种子细胞来源的可行性和必要性在于：随着先天性心脏病产前诊断的开展和脐血

库的逐步建立，对于婴幼儿先天性心脏病病例，可应用自体脐血来源内皮祖细胞

分化的内皮细胞，经体外培养扩增后，作为组织工程血管的种子细胞，构建组织

工程心血管修复材料，此方法对患儿无创伤，而且也不存在免疫排斥问题，所以

是潜在的非常理想的种子细胞来源。

本实验研究的目的在于从脐血中分离出单个核细胞，建立体外培养、诱导分

化以及鉴定ＥＰＣｓ的方法，以探讨由脐血来源内皮祖细胞分化的内皮细胞用作组

织工程血管的种子细胞来源的可行性及其理论基础。６

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

材料和方法

一．材料

ｌ材料、试剂和仪器

新鲜脐血：上海国际和平妇幼保健院提供。

细胞分离液Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ（１．０７７９／ｍ１）．．Ｓｉｇｍａ公司，美国。

羟乙基淀粉（ＨＥＳ）：Ｓｉｇｍａ公司，美国。

人血清纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司，美国。

ＤＭＥＭ培养基（干粉）：Ｓｉｇｍａ公司，美国。

胎牛血清（ＦＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ公司，美国。

血管内皮生长因子ＶＥＧＦ：Ｂｉｏｓｏｕｔｒ．ｅ公司，美国。

胰岛素样生长因子ＩＧＦ．１：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ公司，美国。

碱性成纤维细胞生长因子ｂＦ（３Ｆ：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ公司，美国。

表皮生长因子ＥＧＦ：Ｃｙｔｏｌａｂ公司，美国。

胰蛋白酶：Ｓｉｇｍａ公司，美国。

ＥＤＴＡ：Ｓｉｇｎｍ公司，美国。

ＰＢＳ溶液：上海医药化学试剂厂。

ＣＤｌ３３抗体：ＭＡＣＳ公司，德国。

Ｆｌｋ－ｌ抗体：ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司，美国。

ｖＷＦ抗体：ｓａｎｔａｃｒｕｚ公司，美国。

ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ：ｖｅｃｔｏｒ公司，美国。

ＮＯ检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

超净台：上海汇龙仪表电子有限公司环境工程装配分公司。

水平离心机：ＥＰＰＥＮＤＯＲ＿Ｆ公司，美国。

恒温磁力搅拌器：ＩｋａｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉＬ德国。

３７℃、５％Ｃｔｈ高湿度恒温孵育箱：ＴｈｅｒｍｏＣｏ，美国。

电热恒温水浴箱：上海医疗器械七厂。

倒置相差显微镜：Ｎｉｋｏｎ，日本。

数码照相机：Ｎｉｋｏｎ，日本。７

荧光倒置显微镜：Ｎｉｋｏｎ，日本。

６孔，２４孔，９６孔细胞培养板：ＪｕｎＣｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ。

微量可调移液器：ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ公司，美国。

透射电镜（ＴＥＭ）：日立，日本。

流式细胞仪：ＢＤ，美国。

２主要培养液及试剂的配制

１．消化液（Ｏ．２５％胰蛋白酶．０．０１％ＥＤＴＡ混合液）：称取２９胰酶，加入ＰＢＳ２００ｍｌ

溶解，过滤除菌，即配成１％的胰酶，再称取ＥＤＴＡ２００ｍｇ。加入ＰＢＳ２００ｍｌ溶解，

过滤除菌，即配成Ｏ．Ｉ％ＥＤＴＡ，使用时取１％的胰酶２．５ｍｌ和０．Ｉ％ＥＤＴＡＩｍｌ。用ＰＢＳ

稀释成１０ｍｌ，即配制成Ｏ．２５％胰蛋白酶一０．０１％ＥＤＴＡ混合液。

２．６％ＨＥＳ：称取６９羟乙基淀粉，用１００ｍｉ０．９％ＮａＣＩ溶液溶解，用磁力搅拌器搅

拌至颗粒消失，再高压灭菌。

３．１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液：在１０００ｍｌ去离子水中加入ＤＭＥＭ干

粉ｌＯｇ，ＮａＨＣ０３３．３９，青霉素Ｏ．０６２９，链霉素Ｏ．１９，谷氨酰胺０．３９，Ｈｅｐｅｓ３．７５９，搅拌

均匀后调节ＰＨ值，无菌过滤后分装，每瓶加入ＦＢＳ，制成含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ

细胞培养液。

４．条件培养液：在１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液中加入

ＶＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ，ＩＧＦ一１２ｎｇ／ｍＬ，ｂＦＧＦ２ｎｇ／ｍＬ，ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ。

二．方法

ｌ实验分组

根据培养细胞所用培养液不同，本实验分为两组：

１．诱导组：采用加有ＶＥＧＦ等生长因子的条件培养液培养细胞。

２．未诱导组：采用含１００６ＦＢＳ的ＤＭＥＭ细胞基本培养液培养细胞。

２脐血中单个核细胞的分离

采用６％羟乙基淀粉（ＨＥＳ）沉降法和Ｆｉｅｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ分层法联合应用。

１．在无菌条件下，取足月健康分娩新生儿的脐血。用含５０ｍｌ细胞保存液的血袋

收集，抗凝剂为Ｏ．６％复方枸橼酸钠血液保存液，ＡＣＤ．Ａ，在８ｈ内处理完。

２．按ｌ：４比例将６％ＨＥＳ和新鲜脐血混合，４＂Ｃ静置６０ｍｉｎ．

３．收集上层富含白细胞的血浆层，４＂１２，１５００ｆ／ｒａｉｎ离心１５ｍｉｎ。８

４．弃上清，重悬细胞于ＰＢＳ缓冲液中，按２：１比例将细胞悬液轻轻平铺于

Ｆｉｃｏｌｌ．Ｐａｑｕｅ表面，４℃，２０００ｒ／ｒａｉｎ，密度梯度离心３０ｍｉｎ。

５．离心后，可见离心管中液体分成三层，上层为血浆和ＰＢＳ液，下层主要为红细

胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的

白膜层，小心吸取中间白色膜状层单个核细胞。ＰＢＳ洗涤两次，离心弃上清。

６．收获的单个核细胞分别于ＤＭＥＭ基本培养液和ＤＭＥＭ条件培养液中分组培

养。

３原代诱导分化培养及传代

１．原代培养

人纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）用ＰＢＳ稀释成２０ｎｇ／ｕＬ后，包被７５ｅｒａ２

培养瓶，置于３ＴＣ培养箱中孵育３０ｍｉｎ后，轻轻吸去表面多余液体。分别用低

糖ＤＭＥＭ条件培养液和ＤＭＥＭ基本培养液重悬分离好的单个核细胞，调整细

胞浓度为５×１０６／ｍＬ，接种于包被好人纤维连接蛋白的７５ｃｍ２培养瓶中，置于

饱和湿度，５％Ｃ０２的培养箱中培养，４ｄ后首次以双倍浓度细胞因子培养基半量

换液，以后每过３ｄ半量换液，倒置相差显微镜下观察贴壁细胞的形态变化和增

殖情况。

２．传代培养

当原代细胞诱导培养后，细胞铺满培养瓶８０－－８５％时，以Ｏ．２５％胰蛋白酶

－０．０１％ＥＤＴＡ混合液进行室温消化，显微镜下控制时间，待贴壁细胞收缩为圆形，

细胞间隙增加，细胞间连接松散后，弃消化液，加入含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ中止消化，

轻轻吹打细胞，镜下观察绝大多数贴壁细胞悬浮于培养液后，洗涤后计数，以１：

２￣３比例接种进行传代。传代培养后每３ｄ换一次液，倒置相差显微镜下观察细

胞的形态变化和增殖情况。

４内皮祖细胞的观察和鉴定

１．形态学观察：每天在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。

２．表面标志鉴定：应用免疫荧光法、流式细胞仪检测细胞表面ＣＤｍ、ＶＥＧＦＲ－２

和ｖＷＦ的表达。

（１）免疫荧光法：检测培养７ｄ贴壁细胞ＶＥＧＦＲ－２和ｖ、ＶＦ抗原的表达。

１）细胞经４％多聚甲醛固定２０ｍｉｎ、１％Ｔｒｉｔｏｎ打孔２０ｒａｉｎ，，以增加细胞膜的通９

透性，加入含Ｏ．５％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭４０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次。

２）加入兔抗人ＶＥＧＦＲ－２和ｖＷＦ的单克隆抗体，阴性对照组只加ＰＢＳ，３７＂Ｃ孵

育６０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次。

３）加入ＦＩＴＣ标记的山羊抗兔二抗，３ＴＣ孵育６０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎｘ３次，，荧

光显微镜下观察，亮绿色荧光细胞为阳性细胞。以不加一抗的培养细胞作空白对

照

（２）流式细胞仪分析：检测新鲜分离和培养７ｄ后细胞中ＣＤｍ阳性细胞。

１）培养７ｄ后的细胞用胰酶消化下来，ＰＢＳ洗涤。

２）约１×１０６个细胞沉淀中加入１００ｕＬ含０．５％ＢＳＡ的ＰＢＳ封闭。

３）加入１０ｕＬＰＥ－ＣＤｌ３３，混匀．使ＣＤｌ３３稀释成１：ｌｌ，４＂Ｃ避光孵育１０ｍｉｎ。

４）ＰＢＳ洗涤并重悬后，进行流式细胞仪ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂ．Ｄ）分析，计数１０５细胞，

ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ软件分析结果，同时以ＰＢＳ替代ＣＤｌ３３单抗作阴性对照。对照组用

鼠抗人同型ｌｇＧｌ型作对照。ＣＤｌ３３阳性细胞百分率通过矫正同型对照的百分率

计算。

３．透电镜观察将诱导组培养１４ｄ的细胞送上海医学院电镜室处理后，观察培养

１４ｄ时细胞的超微结构。

４．内皮细胞分泌ＮＯ功能检测：测定细胞培养液一氧化氮（Ｎｏ）含量。实验分

三组：诱导组、未诱导组、人成熟脐静脉内皮细胞组。将上述三组培养１４ｄ生长

状态良好的细胞，以１×１０９，／Ｌ的密度接种于六孔培养板内，每组６孔，另设空

白对照组，培养２４ｈ后收集各孔内培养液检测。检测使用ＮＯ检测试剂盒，购自

南京建成生物工程研究所，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，以分光光度计测

定。其原理是采用硝酸还原酶法特异性将培养液中ＮＯｒ还原为Ｎ０２＂，并测定Ｎ０２’

浓度，从而间接反应ＮＯ含量。

５统计学处理

结果以均数±标准差（一Ｘ±ｓ）表示，，Ｉ习ＳＰＳＳｉ０．Ｏ软件作统计学处理，ｐ＜０．０５

为有显著性差异，有统计学意义，组间比较应用ｔ检验。１０

人脐血来源内皮袒细胞韵分离、培养及鉴定

结果

一．脐呶单个核细胞的分离从新鲜脐舰中（每份４０～１００ｍＬ，ｎ＝１５）得到的

擎令孩绥戆数平均隽（３Ａ＋２。１）Ｘ１０７／ｍＬ。

二。形态学观察剐分离出来的单个核细胞呈小丽圆形（圈１），诱嚣组细胞撼

养２４ｈ麓在开始辩髓，髓瑶，细戆基零雅壁生长，细魏逐渐变大并＿ｌ窥长，高倍镜

下，部分细胞可见分裂相，并大量增殖，但多数细胞仍为小圆形，７ｄ左右，可

见鲴戆戏嶷落撑生长，形成多个细胞簇（图２）。缍藏蔟鹃缝魏类戳予坯黪霹期

血管生成出现的血岛（ｂｌｏｏｄｉｓｌａｎｄ）Ｉｌｌ，中央为圆形细胞，周围为“翁锤样”梭

形细胞，分化出的梭形细胞袭现出较高的增殖能力，向外放射状扩散，并可见梭

形维照蓠藩连接，猱强戒线获（图３），条索旋缀构，有嚣逐可冤到耨簿缓藏警

行排列璺管样结构（图４），随膊可见大部分细胞都伸展开来，细胞体积明显增大，

多数为梭形或多角形，缨胞连接蓑融合娥片状生长。２ｗ左农缨照呈镶鼹石样（强

５），几乎铺满培养瓶底。传代培养后，细胞２４ｈ内贴壁，量梭形，１ｗ即可传代。

藩莰未诱导缀续戆薅壁辩阗霜诱导缓，整绥藏褰落乡，泰觅典墼戆线撵攥列。

未诱导缎细胞传代厝，细胞逐渐变为成纤维细胞样，未见铺路石样形态细胞。

图１剐分离的单个核细胞星小而圆形（Ｘ

１００）

△墅些墨塑堕堕塑塑些塑坌塑：苎茭墨垄塞

图２培养７ｄ时细胞成簇状生长（Ｘ１００）

图３梭形细胞首尾连接，排列成线状（×２００）

１２

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

图４两排细胞平行排列呈管样结构（×２００）

图５培养１４ｄ左右细胞呈铺路石样（×２００）

＾脐皿来源内皮祝细胞的分礴、培养及鉴窀

三。纲藏缵藿襞秀

诱导组细胞较米诱导组细胞增殖快，在培养的第５－７ｄ原代贴壁细胞增殖活

性最强，形成大量的细胞集藩，细胞原代培养２ｗ左右，细胞数量即可达到１０ｓ

左右。藤代细胞生长相对予传代后馒～整，麴２ｗ可传代，传筏后刘纲胞增殖较

快，１ｗ旋右即需传代。细胞传代４８ｈ厝细胞增殖活力恢复，进入快速增殖期。

四．免瘦荧光观察

１．荧光照徽镜下贴壁细胞胞浆检测ｖＷＦ：细胞浆内表达ｖＷＦ是内皮细胞的特

异性蠡恚。培养ｄ７诱导缰缡缒ｖＷＦ黧鞠显鬻程染色（踅６），两未诱导缰无魏

明显阳饿反应。

２．荧光湿微镜下贻壁细胞臌浆检测ＶＥＧＦＲ－２：缩养ｄ７诱导组细胞黧阳性染色

（图７），而未诱导组无此阳性反应。

３．荧光鼹微镜下贴壁细胞胞浆检测ＣＤｌ３３：偶见阳性表达（图８）。

圈６壤葬静缨簸豹Ｖ强，ｒＦ受痰荧光染色麓瞧（ｘ２００）

１４

一——一．一△墅些塞堡空堕望塑堕堕坌查：些鲞墨些塞

图７培养ｄ７细胞ＶＥＧＦＲ－２免疫荧光染色阳性（Ｘ２００）

图８培养ｄ７细胞ＣＤｍ免疫荧光染色偶见阳性（Ｘ２００）

１５

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

五．流式细胞仪分析刚分离出的单个核细胞中ＣＤｌ３３＋细胞占（３．１１±１．０５）％，诱

导分化培养ｄ７，贴壁细胞中ＣＤｌ３３＋细胞减少至（ｏ．０９－－＋０．０２）％，Ｐ＜０．０５，ｎ＝６。

六．透射电镜观察原代培养ｄ１４细胞透射电镜观察显示，胞浆中出现一种短棒

状小体，含平行管状的内部结构，即Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体，是成熟血管内皮细胞

的特征性超微结构。此外，细胞内还可见到较多线粒体、内质网和溶酶体等细胞

器，提示细胞代谢旺盛（图９，１０）。

图９，１０培养ｄ１４的细胞电镜照片，细胞胞浆中可见Ｗｅｉｂｅｌ—Ｐａｌａｄｅ小体（ＴＥＭＸ２００００）

七．内皮细胞ＮＯ分泌功能测定

细胞培养液中ＮＯ含量测定结果如下：未诱导组、诱导组和人成熟脐静脉内

皮细胞组培养液中ＮＯ含量分别为（１２．４３±４．５１）ｕｍｏｌ／Ｌ、（５２．０７＋２．１７）ｕｍｏｌ／Ｌ和

（８３．６５＋６．１４）ｕｍｏｌ／Ｌ，３组数据问两两比较Ｐ值均＜０．０５（图１１）。

１６

人脐血来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

４０

３０

２０

１０

对照组诱导组哪ＶＥｃ组

图１１培养ｄ１４细胞培养液中ＮＯ含量测定

讨论

１ＥＰＣｓ的分离方法

由于ＥＰＣｓ的研究仍处于早期阶段，缺乏特有的表面标志，因而目前分离

ＥＰＣｓ有一定的难度。大量胚胎学研究结果表明，造血系统祖细胞与血管内皮祖

细胞来源于共同的干细胞一血液血管干细胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ），因而它们具有多种

相同的抗原表达，包括ＣＤ３４、Ｆｌｋ—ｌ、Ｔｉｅ－２、ＶＥＧＦＲ一２等。故至今仍未发现能

同时将ＥＰＣｓ与造血细胞及成熟血管内皮细胞完全区分开的特异细胞表面标志。

ＣＤ３４曾被认为是最重要的造血干细胞的标志物。进一步研究表明，ＣＤ３４不仅

表达在ＨＳＣｓ上，也在成熟的内皮细胞上有低水平的表达。故研究转向代表更早

期的造血干细胞表面标志ＣＤｌ３３。ＣＤｌ３３是新近发现的造血干细胞早期标志，

是分子量为１２０ＫＵ的糖基化多肽，含有５个跨膜结构，是一种早期抗原，它选

择性的在骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表达１４Ｊ，但在成熟内皮细胞上不

表达。研究表明，纯化的ＣＤｌ３３＋细胞在体外能分化为内皮细胞。在分化过程中，

ＥＰＣｓ明显失去ＣＤｌ３３，并开始表达成熟内皮细胞特有的表面标志，如ＣＤ３１、血

管内皮钙粘着素和ｖＷＦ。因此，ＣＤ３４＋／ＣＤｌ３３＋细胞可能是循环中最原始的祖细

胞群，而ＣＤ３４＋／ＶＥＧＦＲ－２＋可能代表血管壁脱落的成熟内皮细胞。目前认为，表

达ＣＤ３４，ＶＥＧＦＲ－２及ＣＤｌ３３的细胞为ＥＰＣ矿Ｊ。１７

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