2012临微输血实验课讲稿

《临床微生物学和微生物检验》

适用专业：医学检验专业（临床输血）本科 实验课讲稿

蚌埠医学院 微生物学教研室

徐志本 20012、2

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实验一、病原性球菌

一、目的要求：

1． 掌握葡萄球菌、链球菌、肠球菌的生物学特性和鉴定要点 2． 熟悉脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌的生物学特性 二、实验内容（板书）： Ⅰ 1． 示教：

（1）金葡、表葡、甲链、乙链、肠球菌、肺炎链球菌在BAP上菌落 （2）金葡菌、表皮葡萄球菌甘露醇发酵试验 （3）肺炎链球菌、甲链菊糖发酵试验

（4）肠球菌、甲链65g/L NaCl血清肉汤生长试验；胆汁七叶苷试验 2．操作：

（1）金葡、乙链、肺炎链球菌接种BAP （2）肺炎链球菌、甲链接种菊糖发酵管 （3）金葡菌、表皮葡萄球菌接种甘露醇发酵管 3. 电教：球菌 三、讲解：

常见的病原性球菌，根据革兰染色性不同，可分为G+球菌（如葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、肠球菌）和G-球菌（如脑膜炎球菌、淋球菌等）。这些细菌在形态、菌落特点及生化反应上各不相同，可作为鉴别依据。上学期的实验课我们已经学习过了形态结构部分。下面我们着重来认识病原性球菌菌落特点和生化反应等特性。

菌落观察：

大小（以mm表示。菌落的大小随细菌种类、培养基及培养时间等条件而不同。同一种细菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处小。因此，表示菌落大小时应注明培养基名称一般以培养18～24小时后选散在处的菌落判其大小。lmm左右为小菌落；2-3mm为中等大；3mm以上为大菌落）、形态、颜色、气味、透明度、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐或不规则、血平板上是否溶血等。 BAP上菌落特点：

? 金葡菌：中等大小、圆形凸起、金黄色/灰白色、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明，“油漆状”，菌落周围有透明溶血环（β-溶血）

? 表葡菌：形态同金葡菌，但为白色，菌落周围无溶血环。

? 甲链菌：细小、针尖样、圆形凸起、灰白色、半透明/不透明、表面光滑、边缘整齐、菌落周围形成草绿色溶血环（α-溶血）

? 乙链菌：形态同甲链。但菌落周围形成2-4mm宽，完全透明的溶血环（β-溶血）

? 肺炎链球菌：菌落与甲型链球菌极其相似，稍扁平，培养2~3d后，因菌体发生自溶，菌落中心凹陷呈“脐状”。 ? 肠球菌：灰白色、不透明、表面光滑的小菌落（大小介于葡萄球菌和链球菌之间）、菌落周围有草绿色

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溶血环或无溶血环。 生化反应：

不同的细菌含有不同的分解代谢酶，对培养基中各种基质的代谢作用和代谢产物均不相同。通过检测细菌对各种基质的代谢作用和代谢产物, 借以区别和鉴别细菌种类的试验，称为生化反应。常用的生化反应主要观察细菌对糖类、蛋白质类及其它物质的利用。生化反应在细菌的鉴定中起着重要的作用，因而为临床细菌检验所常用。 △甘露醇发酵试验： *原理：

致病性葡萄球菌（金葡菌）发酵甘露醇产酸，使培养基中的溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，表皮葡萄球菌不能发酵甘露醇产酸，培养基颜色仍为紫色，本试验可用于金葡/非金葡的区别。 *方法：

将金葡/表葡分别接种于甘露醇发酵管，35℃孵育18~24h观察结果。*试验判断：（+）培养基浑浊，由紫色变为黄色；（—）培养基混浊，仍为紫色。若培养基为澄清，说明接种细菌不合格。 *结果：金葡（+）；表葡（—）。 △菊糖发酵试验：

*原理：链球菌一般不分解菊糖，不被胆汁溶解。大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由紫红色变为黄色。 *方法：

将肺炎链球菌/链球菌分别接种于菊糖发酵管，35℃孵育18~24h观察结果。

*试验判断：（+）培养基浑浊，由紫色变为黄色；（—）培养基混浊，仍为紫色。若培养基为澄清，说明接种细菌不合格。

*结果：肺炎（+）；甲链（—）。 △6.5%NaCL血清肉汤生长试验： *原理：

肠球菌具有较强的耐盐能力，能在6.5%NaCL血清肉汤生长，而其它链球菌（甲链）的耐盐能力较弱，在此培养基中无法生长，本试验可用于肠球菌/非肠球菌的区别，主要测定细菌在高盐中的生长能力，如细菌能耐受高盐，在培养基中生长后可分解培养基中的葡萄糖使指示剂呈酸性改变。 *方法：

将肠球菌/甲链分别接种6.5%NaCL血清肉汤，35℃孵育18~24h观察结果。

*结果判断：（+）细菌生长培养基混浊；（—）细菌不生长，培养基澄清。肠球菌（+）；甲链（—）。 △七叶苷斜面生长试验： *原理：

培养基的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌能水解七叶苷生成七叶素，七叶素能与培养基中的枸橼酸铁反应生成黑色沉淀，使培养基变黑，甲链不水解七叶苷，培养基不变黑，本试验可用于肠球菌/非肠球菌区别。 *方法：

将肠球菌/甲链分别接种七叶苷斜面，35℃孵育18~24h观察结果。

*试验判断：（＋）细菌生长，培养基变为黑色；（—）细菌生长，培养基不变色。 *结果：肠球菌（+）；甲链（—）。

二、操作：（4人/组）

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1、金葡、乙链、肺炎链球菌接种BAP

方法：用接种环从示教板上挑取金葡，表葡，肺链菌苔分区划线法接种BAP，35度孵育18~24h，观察结果。

分区划线法（图4-5）

1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

2）同上法将平板盖打开约30~45°角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1区）内作来回划线，再在2、3、4区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线间需保持一定距离，线条要密而不重复。

3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。 4）在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

肺炎要用烛缸法：取一有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处上涂上凡士林。将接种后的培养基放入缸中，并在缸内放一支点燃的蜡烛，加盖密封。随着缸内蜡烛燃烧产生的CO2增加，蜡烛逐渐自行熄灭，此时缸内的CO2浓度约为5~10%，置35℃培养箱孵育18~24h后观察结果。（见图4-7）

2、金葡、表葡接种甘露醇发酵管

方法：用接种针从示教板上挑取少许金葡，表葡菌苔用半固体接种法接种，35℃培养箱孵育18~24h后观察结果。

半固体培养基的接种：该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。 半固体培养基的接种方法：（图4-3）

（1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。

（2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺线退出，

（3）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。 （4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

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3、肺炎链球菌、甲链接种血清肉汤

方法：用接种环从示教板上挑取少量肺炎，甲链菌苔用液体培养基接种法接种35℃培养18~24h后观察结果。

△菊糖发酵试验：

*原理：链球菌一般不分解菊糖，不被胆汁溶解。大多数肺炎链球菌可以分解菊糖，菊糖发酵产酸，指示剂呈酸性反应，发酵管由紫红色变为黄色。 *方法：

将肺炎链球菌/链球菌分别接种于菊糖发酵管，35℃孵育18~24h观察结果。

*试验判断：（+）培养基浑浊，由紫色变为黄色；（—）培养基混浊，仍为紫色。若培养基为澄清，说明接种细菌不合格。

*结果：肺炎（+）；甲链（—）。

△胆汁溶菌试验：

*原理：

胆汁或胆盐能激活肺炎链球菌的自溶酶，引起细菌细胞膜破裂或菌体裂解，导致细菌死亡，而甲链无自溶酶，胆汁无法导致细菌死亡，本试验可用于肺炎/甲链的区别。 *方法：

将肺炎/甲链的血清肉汤培养液1ml分别加入试管内，再于各管中加入10％的去氧胆酸钠0.1ml，摇匀后置37℃水裕30min后观察结果。*试验判断：（+）试管中液体由混浊变为透明；（—）液体仍为混浊。*结果：肺炎（＋）；甲链（—）。 1．液体培养基的接种： 该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。 方法：

（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。

（2）左手拿试管，右手持接种环，右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。 （3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。 （4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。 （5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。

Ⅱ 1．

（1） （2） （3） （4）

操作：

观察试验结果 金葡菌、乙链触酶试验

金葡菌、表皮葡萄球菌凝固酶试验

金葡菌、乙链、肺炎链球菌涂片G染色镜检

1、观察试验结果

具体结果描述见前部分内容

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粪便，肛拭子 需氧培养 直接涂片检查 G染色动力 增菌培养 及制动试验 初步报告 碱性蛋白胨水 GN肉汤/亚硒酸盐肉汤 TCBS/4号琼脂等 菌落、生化反应 血清学分群、分 型 报告结果 KIA、 MIU上生化反应： 厌氧、微需氧及特殊培养 直接分离 SS、MAC/EMB 菌落形态 生化反应 血清凝集 KIA MIU 斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 福氏/鲍氏志贺菌 K A －/＋ － － ＋/－ － 伤寒沙门菌 K A － ＋/－ ＋ － －

志贺菌属的分型鉴定：

凡生化反应符合志贺菌属者均需作血清学鉴定。取一环志贺菌四种多价血清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。

结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A、B、C、D群最常见的单价血清凝集定种。

注意事项：

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1．肠道内存在大量的正常菌群，除非为了正常菌群的调查和鉴定，一般分离可疑致病菌应使用选择性平板。 2．最好采集急性期，抗生素使用前的粪便标本，进行床边接种。

3．除怀疑霍乱弧菌、结核分枝杆菌和菌群失调引起的腹泻外，粪便标本一般不做涂片检查。在以糖类发酵为鉴别依据的培养基上，发酵型菌落进行氧化酶试验时会出现假阴性。在选择性平板上挑取菌落时，应使用接种针从菌落中心挑取，而不应使用接种环刮取菌落。

4．沙门菌属容易丢失鞭毛抗原，此时要通过诱导使鞭毛恢复，才能鉴定。

实验六 变形杆菌、弧菌、绿脓、白喉、结核Ⅰ 1．示教：

（1）普通变形杆菌、铜绿假单胞菌在BAP、SS、MAC、肉汤中生长现象 （2）弧菌在TCBS、碱性蛋白水生长现象 （3）普通变形杆菌迁徙生长现象（点种）

（4）白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面、亚碲酸钾BAP、BAP上菌落 （5）结核分枝杆菌形态示教片和在罗氏培养基上菌落

2．操作：

（1）普通变形杆菌、铜绿假单胞菌接种BAP、SS、MAC、KIA、MIU （2）弧菌接种TCBS

（3）白喉棒状杆菌接种亚碲酸钾BAP、BAP （4）痰标本涂片抗酸染色镜检 Ⅱ 1．示教：

（1）普通变形杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌在KIA、MIU生化反应 （2）弧菌形态示教片、白喉异染颗粒示教片 2．操作： （1）观察试验结果

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（2）白喉棒状杆菌涂片G染色、Albert染色 （3）白喉触酶试验、普变、绿脓氧化酶试验

三、讲解：

前面几周学习了肠道中主要的致病菌（沙门和志贺），本周来学习肠道中几种其他的肠道致病菌（变形杆菌、假单胞菌属和弧菌属），它们多属于肠道内正常菌群或广泛存在于自然界，在一定条件下可引起人类各种感染。

变形杆菌是一群动力活泼、格兰阴性的细菌。广泛存在于土壤、污水和垃圾中。共有8个菌种。其中奇异变形杆菌和普通变形杆菌引起人类原发和继发感染，只有离开肠道后才能引起，是仅次于大肠杆菌的泌尿道感染的主要病原菌，且与肾结石和膀胱结石有关。

假单胞菌属是一群需氧、有鞭毛、无芽孢的格兰阴性杆菌。其中铜绿假单胞菌广泛分布于自然界及人和动物机体皮肤及肠道中，是常见的条件致病菌，由于在生长过程中产生绿色水溶性色素，感染后的浓汁或敷料上出现绿色，故名。

1）普通变形杆菌、铜绿假单胞菌在BAP、SS、MAC、肉汤中生长现象： BAP MAC S.S 肉汤 普变 迁徙现象（同心圆） 乳糖不发酵无色乳糖不发酵无色均匀浑浊表面菌透明 半透明H2S（+）膜管底沉淀 黑色沉淀点 绿脓 中等大小扁平湿润金属光乳糖不发酵无光乳糖不发酵无色表面形成菌膜深泽特殊气味灰绿色或蓝绿泽半透明延迟培半透明H2S（—） 部微浑浊上层蓝色菌落菌落周围有beta溶养可形成棕绿色绿色 血 菌落 弧菌在TCBS、碱性蛋白水生长现象： TCBS（硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖）成分：

基本成分（酵母浸液、蛋白胨和氯化钠） 硫代硫酸钠、枸橼酸铁：H2S

胆盐、胆酸钠、枸橼酸钠：抑菌剂 蔗糖

指示剂：溴麝香草酚蓝：酸性为黄色，碱性为蓝色。 碱性蛋白胨水成分：

蛋白胨、氯化钠、水：基本营养成分，NaOH调节PH8.4~8.5

TCBS：发酵蔗糖产酸，PH下降，酸碱指示剂变色，菌落变为黄色。

碱性蛋白胨水：PH8.5碱性蛋白胨可抑制杂菌生长，弧菌不被抑制，液体表面大量繁殖形成菌膜。

形态观察：

G-，菌体稍弯曲呈弧形或逗点状，无荚膜和芽胞，排列似“鱼群” 样。 *在观察结果时要注意以下几种情况：

（1）自患者新分离出的霍乱弧菌，菌体短小，形态典型，可呈逗点状；

（2）直接由米泔水样粪便作涂片时，常见呈弧形互相衔接，平行排列，状如鱼群； （3）在人工培养基上保持稍久后，则失去典型弧形，成为杆状，与其它肠道杆菌不易区别； （4）在陈旧培养物中，本菌可出现衰退变化，呈颗粒状或不规则肿大，着色不良。

菌落观察：

在碱性蛋白胨水中呈均匀混浊，有时在液体表面生成菲薄菌膜；在碱性琼脂平板上可形成较大、圆而扁平或稍凸起、无色透明或半透明似水滴及淡蓝灰色的菌落，菌落表面光滑或有微细颗粒。因分解蔗糖产酸，在TCBS平板菌落及周围呈黄色。因能还原亚碲酸钾，在4号琼脂平板菌落中心呈褐色。 （3）普通变形杆菌迁徙生长现象（点种）

变形杆菌属（普变和奇变）大多数菌株可在BAP和普通平板上（点种）形成蔓延扩散性生长，形成以菌接

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种部位为中心的厚薄交替、同心圆形的层层波纹状菌苔，布满整个平板表面，而不形成单个菌落，称为迁徙现象。为该菌特征，可用于细菌鉴定。迁徙现象可被石碳酸、胆盐等抑制而形成单个菌落。 （4）白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面、亚碲酸钾BAP、BAP上菌落

白喉杆菌为需氧或兼性厌氧菌，最适温度34～36℃，普通琼脂平板上能生长但生长不良，形态不典型。在含血液或血清的培养基上生长迅速，形态典型，异染颗粒明显。常用培养基为BAP，吕氏血清斜面，亚碲酸钾血平板。

BAP：35℃24h，菌落直径1～2mm、灰白色、不透明的光滑型、轻型有狭窄β溶血环。

吕氏血清斜面：生长最快、形态最典型，6h即生长，10～12h长出灰白色、湿润、有光泽的光滑型菌苔或菌落，菌体形态典型、异染颗粒明显，连续传代可保持形态和产毒性能不变。

亚碲酸钾BAP：（选择鉴别培养基）主要用于初次分离培养，含0.03%～0.04%亚碲酸钾，可抑制其他细菌生长，本菌可选择性生长。在生长过程中亚碲酸盐离子透过细胞膜进入细胞质，还原成元素碲而沉淀，形成黑色菌落，是鉴定依据。35℃18～24h，不同菌型还原能力不同，呈现黑色或灰黑色菌落。 （5）结核分枝杆菌形态示教片和在罗氏培养基上菌落

霍乱弧菌生化反应：

KIA MIU 其他 斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 氧化酶 粘丝试验 K A – – + + – + +

鉴定：

观察菌落特征并作动力检查、然后取可疑菌落以O1群霍乱多价免疫血清做玻片凝集试验。

玻片凝集试验（血清学试验）：

分别取1滴霍乱弧菌多价免疫血清和生理盐水滴加在玻片的左右两个分区内，生理盐水作对照。用接种环挑取霍乱弧菌菌落少许，加于右侧的生理盐水中混匀，再用灭菌接种环取待测霍乱多价免疫血清，混匀，2～3min后，观察是否出现凝集现象。

变形杆菌：

G-杆菌，两端钝圆、有明显多形性，可为球形或丝状。有周身鞭毛、运动活泼，无芽胞、无荚膜。 普通变形杆菌和奇异变形杆菌的大多数菌株在普通琼脂平板和血平板可蔓延成波纹状薄膜布满整个培养基表面，称为迁徙生长现象，是本属细菌的特征。

肠道选择鉴别培养基——圆形、扁平、无色半透明、乳糖不发酵的菌落；产H2S菌株在SS上菌落中心呈黑色。

生化反应特征是：H2S（+）、苯丙氨酸脱氨酶（+）、脲酶（+++）

铜绿假单胞菌：

G-细长且长短不一的杆菌，可呈球杆状或长丝状，成双或短链状排列。一端有单鞭毛，运动活泼。 可产生多种色素，如绿脓菌荧光素、绿脓素、玉红脓素。

BAP：大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色菌落，有透明溶血环，有生姜味。 MAC：微小、半透明菌落，48h菌落中心常呈棕绿色。 SS：类似沙门菌的菌落，培养稍久菌落可呈棕绿色。

肉汤：18～24h液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良、呈微混浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。

氧化酶试验： *原理：

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某些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等）具有氧化酶，能将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成紫红色的醌类化合物。

*方法：

用滤纸条沾取被检菌落，用毛细管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸条菌落上（或直接将试剂滴加于培养皿菌落上）

*结果：

阳性者立刻出现红色，继而逐渐加深（如加的试剂是盐酸四甲基对苯二胺，阳性呈蓝色）。阴性不变色。脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌为阳性，肠杆菌科细菌、普变、弧菌为阴性。

触酶试验：白喉杆菌触酶试验阳性。方法同以前的方法。

普通变形杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌在KIA、MIU生化反应： 菌名 KIA 乳糖 MIU 葡萄产H2S 动吲脲糖 气 力 哚 酶 A A － + + + + － － + + + 氧化酶 普通变形杆菌 K 奇异变形杆菌 K 铜绿假单胞菌 － + + － － + － － +/－ + 葡萄糖O/F F F O 痰标本涂片抗酸染色镜检： 1．制片： 取高压灭菌后病人痰标本涂片，干燥，固定。

2．抗酸染色：

初染——用木夹夹住玻片，在玻片上滴加石炭酸复红染液（盖住菌膜），用火焰徐徐加温，至染液出现白色蒸汽（不要煮沸），保持染液温热5min（随时添加染色，以防干涸），待冷后以水流淌洗玻片上的染液。 脱色——滴加3%盐酸酒精于菌膜上，轻轻摇动，脱色30sec左右，水洗。 复染——滴加碱性美兰染液，染色1min，水洗，干燥后，油镜观察。

3、结果：

结核杆菌菌体染成红色，背景及非抗酸菌呈蓝色。在痰液标本内结核杆菌多单个存在，有时呈分枝状如V、Y、人字形排列，菌多时可聚集成束状或团状；

白喉棒状杆菌形态：

G+细长微弯的杆菌，一端或两端膨大呈棒状，常排列呈V、L、X等文字形。用美蓝短时间染色菌体着色不均匀，出现有深染的颗粒。用Neisser、Albert等法染色时菌体一端或两端有2～5个浓染颗粒，这些颗粒与菌体着染颜色不同，称为异染颗粒，颗粒的主要成分是由胞质内核糖核酸和多偏磷酸盐的堆集而成，是本菌形态上的鉴别特征。但当细菌衰老时异染颗粒被消耗而不明显，且细胞壁变薄易被脱色，常造成革兰染色不定，有时在革兰阴性的菌体中见有阳性颗粒或节段

阿尔培（Albert）染色法：

甲液（甲苯胺蓝、孔雀绿、冰醋酸、95%乙醇）5分钟后水洗，乙液（碘、碘化钾）1分钟后水洗，干后镜检，菌体呈草绿色，异染颗粒呈紫褐色。

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最终报告

常见致病菌检验及报告方式：

（1）将血液细菌培养瓶置35℃孵育箱中孵育，每日观察一次，连续观察至第七天。注意血液细菌培养瓶的变化。

（2）如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查，发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告。

（3）如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。需氧培养瓶接种羊血琼脂平板、巧克力血琼脂平板，前者作普通需氧培养，后者放入5% CO2环境35℃孵育24h；厌氧培养瓶接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，前者置厌氧环境进行35℃48h厌氧培养，后者作普通需氧培养。观察菌落生长情况。

（4）对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染色性，如为革兰阴性杆菌，进行氧化酶试验，触酶试验和硝酸盐还原试验，氧化酶阴性，触酶试验和硝酸盐还原试验阳性者初步判断为肠杆菌科细菌，接种KIA、MIU培养基。KIA、MIU培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清作玻片凝集后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，选择相应试验进行鉴定；氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，按非发酵菌进行鉴定。

（5）对细菌菌落涂片、革兰染色，发现革兰阳性球菌，葡萄串样或散在排列，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶试验阴性，链状或散在排列，或成双排列，初步判断为链球菌属或肠球菌属，选择相应试验进行鉴定。

（6）报告方式 在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有××细菌生长”；经分离培养，生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养×天，有××细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至七天，培养瓶中仍无细菌生长迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌学培养七天，无细菌生长”。

注意事项：

1．一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉

汤增菌液，以中和四环素、链霉素、新霉素、多粘菌素等抗生素，并添加抗菌物质拮抗剂如5%对氨基苯甲酸（PABA）拮抗磺胺类、100IU/50ml青霉素酶破坏青霉素和加入0.03~0.05%聚茴香脑磺酸钠（SPS）灭活氨基糖苷类及多肽类抗生素。

2． 对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目翻种后无菌生长，方可报告阴性。

3．为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目翻种两次，第一次在标本孵育12~18h后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种需氧培养均需接种羊血平板和巧克力琼脂平板；厌氧培养接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。

4．血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据。常见的病原菌见表5-2。在同一患者的2份血液标本中检出同一细菌；或检出细菌的患者2~3周后血清中的相应抗体升高则可作出肯定的病原学结论。一般菌血症由一种细菌引起，但也有同时两种细菌的混合感染、两种细菌或细菌和真菌的先后交替感染情况，有时也会出现不常见的细菌，这些情况不能随意判定为污染菌。

5．采血次数及间隔：在脑膜炎、细菌性肺炎等需马上开始抗菌治疗的急性发热性疾病；或急性骨髓炎、化脓性关节炎等需紧急手术的患者，应立即从两臂分别取2份标本作血液细菌培养。对心内膜炎患者，在24h内采血3次，每次间隔不少于30min；必要时次日再采血2次。对不明原因发热者两次抽血间隔60min；

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必要时于24~48h后再抽血2次。因为1次血培养不足以说明问题，且会遗漏阳性结果。

尿标本检验： 标本采集： 正常人的尿液是无菌的，但在尿道口及外阴部位存在正常菌群，在采集尿液标本时，极易引起污染。应遵守无菌操作，避免正常菌群的污染。常用的采集方法有以下几种：

（1）中段尿采集法：是临床上最常采用的方法。女性患者先以肥皂水清洗，而后用1：1000的高锰酸钾水溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿10~20ml于无菌容器中加盖送检。男性患者应翻转包皮，用1：1000新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前段尿，留取中段尿10~20ml于无菌容器中加盖送检。

（2）导尿法：用导尿管导尿收集10~20ml尿液。可以避免污染，但患者难以接受，而且有诱发逆行感染的危险。

（3）肾盂尿收集法：由泌尿科医师在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液。

（4）膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，在患者耻骨联合上用碘酒、酒精消毒后，以无菌注射器穿刺抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者。

（5）留尿法：留取24小时尿液，取沉淀部分约100ml送检。主要用于疑为泌尿道结核患者的检查。

检验程序：

直接计数 涂片 G染色

菌落计数

纯培养 血琼脂平板 麦康凯平板

初步报告

初步报告

定量培养 直接药敏尿液标本

离心沉淀 分离培养 涂片G染色

硝酸盐还原试验 快速检验

初步报告

菌落特征、涂片染色

生化反应 血清学凝集 药敏试验

最终报告

常见致病菌检验及报告方式：

（1）尿液的菌落计数

1）直接计数法：将尿液标本混匀，取一滴尿液于载玻片上，覆盖盖玻片，用相差显微镜观察每个视野的

细菌数，可大致估计尿液中的细菌数。如每视野有100个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥107菌数/ml，每视野有10个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥105菌数/ml，每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥104菌数/ml；可同时观察细菌的形态和运动情况。也可将0.001ml尿液涂布在玻片上进行革兰染色，

27

用油镜观察，如每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为≥105菌数/ml。

2）定量接种法：用定量接种环取尿液，在血平板上连续划线接种；或用无菌移液器吸取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取0.1ml于血平板上涂布接种，35℃孵箱中孵育18~24h，计数平板上生长的菌落数。再计算每毫升尿液中细菌数。

每毫升尿液中细菌数=平板上的菌落数×1/接种环含尿量（ml）

3）倾注培养法：取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取1ml于无菌平皿中，加入已溶化并冷却至50℃的普通琼脂培养基，立即混匀，凝固后35℃孵箱中孵育18~24h，计数平板上生长的菌落数。乘上100即得每毫升尿液中的细菌数。

4）报告方式：平板上如有细菌生长，计数菌落后，报告“每毫升尿液中细菌数为××”；如无细菌生长，经48h培养后仍无细菌生长，报告“普通需氧培养48h无细菌生长”。

（2）普通需氧培养：

将尿液标本离心，取沉淀接种于血琼脂和麦康凯平板，35℃孵育18h~24h，观察有无菌落生长，根据菌落特征和革兰染色镜检结果，如为G杆菌，进行氧化酶试验、触酶试验和硝酸盐还原试验。氧化酶阴性、触酶试验和硝酸盐还原试验阳性者初步判断为肠杆菌科细菌，接种KIA、MIU培养基。KIA、MIU培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清作玻片凝集后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，选择相应试验进行鉴定；氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，按非发酵菌进行鉴定。

如为G球菌，葡萄串样或散在排列，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶试验阴性，链状或散在排列，或成双排列，初步判断为链球菌属或肠球菌属，需观察血平板上菌落形态和溶血情况，以及麦康凯平板上是否生长。进一步进行胆汁七叶苷和6.5%氯化钠生长试验，以确认肠球菌属；如为链球菌属则需进行杆菌肽敏感试验、CAMP试验、马尿酸钠试验等及血清分型试验鉴定之。

+

-

（3）淋病奈瑟菌：

接到标本后立即将尿液标本离心，取沉淀接种于置35℃预温的淋病奈瑟菌选择性培养基中，35℃5%CO2孵育18~24h观察结果，若无细菌生长则继续孵育至48h，若有小而隆起、透明、湿润的可疑菌落，选择相应试验进行鉴定。在接种同时取沉淀涂片革兰染色镜检，若发现有G肾形双球菌，存在于脓细胞内外，则可报告“查见细胞内（外）G双球菌，疑似淋病奈瑟菌”。

--

（4）结核分枝杆菌：

将尿液标本4000r/min离心，取沉淀作涂片二张，分别进行萋-纳氏抗酸染色和潘本汉染色，在两张涂片上镜检均发现有红色杆菌，则可报告“见抗酸杆菌”，如萋-纳氏抗酸染色片上有红色杆菌而潘本汉染色片中无，则为耻垢分枝杆菌。结核分枝杆菌的培养接种罗氏培养基。

注意事项：

1．若G杆菌尿液菌落计数<10/ml可判断为污染，>10/ml可判断为感染，10/ml~10/ml为可疑需重复

-4

5

4

5

检查。对于G球菌而言尿液菌落计数>10/ml可判断为感染菌。

2．尿路感染一般由单一细菌引起，偶尔也可由一种以上细菌引起。当同一份标本中同时检出三种或三种以上细菌时，标本污染可能性大，需重新留取标本检查。

3．尿液是良好的细菌生长环境，采取后应立即检验，放置时间过长会导致感染菌和杂菌过度生长，影响诊断的准确性。不能及时接种的标本可临时存放4℃冰箱，但不得超过2h。

4．菌落计数的影响因素较多，与抗生素的使用、输液、使用利尿剂、尿液的pH变化和细菌种类有关。 5．尿液标本中不得加入防腐剂和消毒剂。

6．为了避免变形杆菌迁徙生长而污染其它标本，每个平板只能接种一个尿液标本。也可使用抑制变形杆菌迁徙生长的培养基如麦康凯等。

+4

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纸片扩散法（K-B法）： 原理：

药敏纸片是一种含有一定浓度抗生素的滤纸片，一旦与培养基接触后即可吸收培养基中的水分而使抗生素均匀扩散，形成一种递减的浓度梯度，当培养基上的细菌被这些药物作用后表现出自身特异的敏感性（在纸片周围的细菌生长被抑制而形成透明的抑菌圈）或抗性（在纸片周围的细菌照常生长或抑菌圈很小），根据抑菌圈直径的大小可测定细菌对此种药物的敏感程度。抑菌圈的大小与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

方法：

（1）挑取孵育16~24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准。

（2）无菌棉拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周。

（3）平板在室温下干燥3~5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm，35℃孵育16~18h，量取抑菌圈直径。

结果判断： 质量控制：

用毫米尺测量药物抑菌圈直径大小，参照判断标准。按照敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。 标准菌株的抑菌圈直径大小应在表2所示的预期值范围内，如果超过该范围，应视为失控，需及时寻找原因，重新进行试验。

影响因素：

培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量和菌龄、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响纸片扩散法抗生素敏感试验结果的准确性和精密度。

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实验八真菌、四体、病毒

一、实验内容（板书）：

I

一、示教：

1、钩端螺旋体、梅毒螺旋体、回归热螺旋体形态示教片

2、石膏样毛癣菌——菌丝、小分生孢子；石膏样小孢子菌——大分生孢子 3、芽管形成试验——白色念珠菌 4、新隐墨汁染色

5、酵母型菌落——新型隐球菌、类酵母型菌落——白色念珠菌、丝状菌落——石膏样毛癣菌

二、操作：

牙垢涂片镀银染色、G染色镜检

真菌按形态可分为单细胞真菌和多细胞真菌，其中单细胞真菌又可分为酵母型和类酵母型。多细胞真菌又称为丝状菌，由菌丝和孢子组成。单细胞真菌常用格兰染色，特殊情况真菌墨汁负染，多细胞真菌多用乳酸棉兰染色。

酵母菌：多数不致病，对人致病主要为新生隐球菌，常用墨汁负染，可见圆形或卵圆形孢子，外围有宽厚荚膜，荚膜较菌体大1~3倍，折光性强，白色透亮，非致病性隐球菌无荚膜。

类酵母菌：多数不致病，对人类致病为白色假丝酵母菌等。常用格兰染色观察形态，可见G阳性（着色不均匀），圆形或卵圆形（瓜子仁）孢子及假菌丝存在，有时可见厚膜孢子及牙管存在，菌体要比细菌大很多。常规情况下观察到念珠菌即可判断。某些情况下需做一些鉴定试验来确定白念感染。常见试验有芽管形成试验，厚膜形成试验 。本次示教为牙管形成试验。需要注意的是：白念牙管可阳性也可阴性；其它念珠菌一般为阴性，但热带念珠今年6h或更久也可形成牙管。方法：将念珠菌接种到0.2~0.5ML血清中，37度水浴1~4h内镜检观察有无牙管形成，观察时可以革兰染色，也可不染色。

多细胞真菌由菌丝和孢子组成，两者形态因真菌种类不同而异，可作为鉴别真菌的主要依据。菌丝按横隔可分为有隔菌丝和无隔菌丝，或按形态分为球拍状，结节状等形态。孢子按繁殖方式分为有性孢子和无性孢子。对人致病主要为无性孢子。无性孢子分为叶状孢子，（芽生孢子，厚膜孢子，关节孢子），分生孢子（大分生孢子，小分生孢子），孢子囊孢子。今天示教为分生孢子，即大分生孢子和小分生孢子。 小分生孢子（石膏样毛癣菌）：菌丝呈球拍状，孢子呈葡萄状或梨状。单个存在，位于菌丝顶端或侧端。 大分生孢子（石膏样小孢子菌）：菌丝呈球拍状，孢子呈纺锤形，分隔，多个孢子存在。

真菌不仅形态上有差异，同样菌落上也有差异。常用培养基为沙保弱，培养温度为28~37度，根据真菌特性不同，形成菌落也有所不同。单细胞真菌可形成酵母型菌落和类酵母型菌落（假菌丝），多细胞菌落可形成丝状菌落。

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酵母型菌落：细菌性菌落，但较大，光滑，湿润，柔软，边缘整齐，形成单个菌落，新生隐球菌形成白色或奶油色，粘稠菌落。

类酵母型菌落：念珠菌落，表面观察通细菌菌落，侧面观察有假菌丝伸入培养基，白念菌落形成奶油色菌落，有假菌丝形成。

丝状菌落：多细胞菌落，菌落各异，可呈绒毛状，棉絮状，粉状，并可产生不同色素。 石膏样毛癣菌：菌落粉末状或绒毛状，表面白色，背面褐色。 石膏样小孢子菌：菌落粉末状或绒毛状，表面白色，背面红棕色。

钩端螺旋体镀银染色示教片：

背景为淡黄褐色至棕黑色，可见钩端螺旋体染成棕褐色，钩体稍弯曲，一端或两端呈钩状弯曲，珍珠点状连接成S或C形螺旋体，螺旋不太清楚，表体整齐，粗细均匀。

梅毒螺旋体镀银染色示教片：

与钩端螺旋体呈色相似，有8~14个致密而规则的小螺旋，两端尖直。

回归热螺旋体姬姆萨染色示教片：

比红细胞长2~4倍的螺旋体，螺旋体为紫红色或红色，纤细柔软，有4～8个稀疏而不规则弯曲，呈波状。

牙垢涂片Fontana镀银染色法： （1）染色液配制：

①罗吉固定液：冰醋酸 1ml，甲醛液 2ml，蒸馏水 100ml ②鞣酸媒染液：鞣酸5g，石碳酸 1g，蒸馏水100ml ③Fontana银溶液：硝酸银5g，蒸馏水 100ml

临用前取Fontana银溶液20ml，逐滴加入100g/L氢氧化铵液，至产生棕色沉淀，经摇动后又能重新完全溶解，微现乳白色为适度。

（2）染色方法：

①在载玻片上滴加生理盐水一滴，用牙签取牙垢少许与盐水混匀做涂片。 ②待涂片干燥后，滴加固定液，1min，水冲洗。

③滴加媒染液，加温至有蒸气出现，作用 0.5min，水冲洗。 ④加硝酸银染液，微加温，约0.5min，水洗，待干后镜检。

结果：螺旋体染成棕褐色或黑褐色。 不染色标本直接检查： 制片： 用小镊子取甲屑或皮屑少许或病发一根，置于载玻片中央，滴加100～400g/L KOH溶液1～2滴。稍待片刻，盖上盖玻片，将载玻片放在火焰上方微加热，使组织或角质溶解，但切勿过热以免产生气泡或烤干。冷后，压紧盖玻片使溶解的组织分散并使其透明，驱除气泡并汲去周围溢液，避免沾污盖玻片。

显微镜检查：

先用低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查菌丝、孢子的特征。镜检时用稍弱的光线使视野稍暗为宜。低倍镜下，菌丝呈折光性较强、绿色纤维分枝丝状体；高倍镜下，可见菌丝分隔或不同的孢子形态。

乳酸酚棉蓝染色：

制片与染色：取洁净载玻片一块，滴加一滴乳酸酚棉蓝染液，将被检标本放于染色液中，加上盖玻片（加热或不加热）后镜检。

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显微镜检查：真菌被染成蓝色。

墨汁负染色：

制片与染色：取一滴优质墨汁置于载玻片上与被检材料混合，盖上盖玻片于显微镜下观察。

显微镜检查：新生隐球菌为圆形或卵圆形酵母细胞，有芽生孢子，细胞外有一层胶质样荚膜，一般厚度与菌体相等。菌体和荚膜不着色，透亮，背景为黑色

观察菌丝和孢子： 有隔菌丝——镜检可发现细胞间有明显分隔，多为病原性真菌。 无隔菌丝——镜检看不到细胞间有分隔现象，是非致病性真菌。 球拍状、螺旋状、破梳状、鹿角状、结节状菌丝。

叶状孢子（芽生孢子、关节孢子、厚膜孢子），分生孢子（大分生孢子、小分生孢子），孢子囊孢子。 大分生孢子——见于石膏样小孢子菌或絮状表皮癣菌，是一种多细胞孢子，常为梭形或棍形，多数具有数个横隔，每个横隔为一个细胞。

小分生孢子——见于须毛癣菌或孢子丝菌，是一种单细胞孢子，常直接或由小侧枝连接而生长于菌丝的侧面，呈葡萄状或圆形。

真菌菌落观察（酵母型菌落、类酵母型菌落、丝状菌落）： 酵母型菌落——新型隐球菌，在沙氏培养基上，初代分离生长慢，菌落表面粘稠，乳白色→橘黄色→棕褐色，随着荚膜物质增多，菌落液化，可以流动。

类酵母型菌落——白色念珠菌，在沙氏培养基上，菌落灰白色或奶油色，表面光滑，乳酪样，带有浓厚的酵母气味，菌落无气生菌丝，仅有大量向下生长的营养假菌丝。

丝状菌落——石膏样小孢子菌，在沙氏培养基上，菌落呈白色绒球状或棉絮状。 申克孢子丝菌——二相性真菌，在沙氏培养基上，灰褐色膜状菌落，逐渐隆起，有皱褶。

芽管形成试验（白色念珠菌）：

方法：取无菌小试管一支，加入0.2ml动物或人血清，接种少量真菌，充分震荡混和数分钟后，置37℃孵育，每隔1h用接种环取出含菌血清置于载玻片上，加上盖玻片后镜检，共检查三次。 结果：白假丝酵母菌可由孢子长出短小芽管

病发标本检查：

将病发、皮屑、甲屑等放于载玻片，滴1滴10%NaOH溶液，覆加一盖玻片，置火焰上微微加热（往返数次），以加速角质溶解，使标本透明，放置10min，轻轻加压使成薄片，驱去气泡，吸去周围溢液，镜检。如为毛发标本，切忌加热加压过甚，以保持毛发原型为宜，便于观察真菌与毛发的关系。先在低倍镜下找到检查标本后，再以高倍镜观察。

（1）发外型：镜下可见孢子呈平行的链状排列或镶嵌状排列，构成白色菌鞘。

（2）发内型：菌丝与孢子产生于毛干的内部，如堇色毛癣菌在发内有大量纵轴排列的菌丝和大小不等的空泡存在，偶见孢子。

流感病毒血凝试验： 原理： 流感病毒表面的血凝素（HA）能与人“O”型红细胞、脊椎动物如豚鼠、鸡等的红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞凝集。在流感病毒悬液中加入特异性血清后，由于相应的抗体与HA结合，使其失去凝集作用，再加入人的“O”型血、鸡或豚鼠的红细胞则不再发生血凝现象，即为血凝抑制。此现象可作为病毒存在的指标及鉴定病毒，或测定患者血清中有无相应抗体。需取双份血清作两次试验，若恢复期血清抗体效价比早期高4倍以上，即有诊断意义。

血凝试验： 方法：

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l）取小试管9支，按表4-2各管加入生理盐水，第1管为0.9ml，其他各管均为0.25ml 。

2）取收获的尿囊液0.1ml，加入第1管中作1：10稀释，混匀后吸取0.5ml弃至消毒缸内，再吸取0.25ml（l：10）稀释液加至第2管混匀，从第2管中取出0.25ml置第3管混匀，依次作倍比稀释至第8管，混匀后自第8管中取出0.25ml弃掉。这样各管液体量均为0.25ml，从第1管至第8管的尿囊液稀释度为l：10，1：20??l：1280，第9管为生理盐水对照。

3）每管加入0.5％鸡红细胞悬液0.25ml，轻轻摇均后置室温45min，观察结果，观察时要轻拿、勿摇。

结果判断：

各管出现血细胞凝集程度用4＋、3＋、2＋、＋、一表示，以出现2十的病毒的最高稀释度为血凝效价。 4＋：血细胞全部凝集，凝集的血细胞铺满管底。

3＋：大部分血细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但有少数血细胞不凝，在管底中心形成小红点。 2＋：约有半数血细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。

1＋：少数血细胞凝集，不凝集的红细胞在管底聚成小圆点，凝集的血细胞在小圆点周围围成小凝块。 －：血细胞不凝集，沉于管底，形成边缘整齐的致密圆点。

按上述结果举例的流感病毒的血凝效价为1：160，即病毒液稀释到1：160时，每0.25ml中含一个血凝单位，配制4个血凝单位时，病毒液应稀释成1：40。

流感病毒血细胞凝集试验 生理盐水 病毒液 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.9 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 （弃0.5） (弃0.25) 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照 各管0.25ml 摇匀，静置室温45min 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ + — — — 病毒稀释液 0.5%鸡红细胞 结果举例 血凝抑制试验： 原理： 在流行性感冒病毒悬液中加入血清后，若病毒表面的血凝激素被特异性血凝激素抗体封闭，再加入人的“0”型、鸡或豚鼠的红细胞则不发生凝集现象，即为血凝抑制。试验中若用已知病毒的抗血清，可鉴定病毒型及亚型；若用已知病毒，则可测定患者血清中有无相应抗体 有定性试验和定量试验。 实验九 实验考试

实验考试内容及要求：

每位同学一份临床模拟标本（血液/尿液/粪便/脓液）

一、针对所给标本设计一个详细的分离、鉴定细菌的具体方案，包括分离、鉴定

的具体路线，实验所需的物品、器皿、培养基、试剂等。5分

二、用所给标本，涂片、革兰染色、油镜检查，并描述所见结果。5分

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三、针对所给标本进行实际的分离、鉴定，所有操作过程在实验室进行。10分 考试结束试卷和实验结果一同交给监考老师

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