细胞培养注意事项

细胞冷冻保存方法、注意事项

1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。

2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，

如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 4、冷冻保存之细胞浓度：

（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 。

（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。

（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。

（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。

5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 6、冷冻方法：

（1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。

（2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用

于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 7、材料：

（1）生长良好之培养细胞 （2）新鲜培养基

（3）DMSO (Sigma D-2650)

（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)

（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) （6）血球计数盘与盖玻片

（7）等速降温机(KRYO 10 Series II) 8、步骤：

（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。

1

（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

（5）冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。

（6）冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL

冷冻保存与复苏原理

在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

冷冻速率

冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。Luyet（1973）证实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。

不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。

不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.60C/min、70C/min和2000C/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C～3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。

冷冻保存温度

2

冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。 不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-1960C）是 目前最佳的冷冻保存温度。在-1960C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。

复苏速率

冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。

冷冻保护剂

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。

冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在40C时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在40C下进行，一般需要40～60分钟。

非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。

冷冻保存方法

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。

非玻璃化冻存方法

下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。 主要材料

（1）仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；

（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；

3

（3）冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻

保存。使用前，于室温下水浴溶解； （4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。 操作过程

1、待冻存细胞悬液的制备

（1）按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数； （2）将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；

（3）向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml； （4）按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖； （5）再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。 2、分级冷冻

（1）先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；

（2）接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min； （3）将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右； （4）然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜； （5）最后将冻存管投入液氮保存。 3、记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。 冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。 讨论

在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37～400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

玻璃化冻存方法

以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashi et al. 1986）。

4

主要材料

（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。 （2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm； （3）设备：液氮储存罐；

（4）待冻存细胞：人类外周血单核细胞。 冻存过程

（1）用常规方法分离全血中单核细胞； （2）在冰浴中预冷冷冻保护液；

（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；

（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，

余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管； （5）轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；

（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液； （7）将冻存管两端以火焰封口；

（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为6000C/min。 冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。 讨论

玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在40C时毒性大为减弱）。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。

冻存细胞的复苏

非玻璃化冻存的复苏方法 主要材料

（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机； （2）培养用液：完全培养液。 复苏过程

5

（1）调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；

（2）从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解； （3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀； （4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；

（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。 结果

复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。 讨论

细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

玻璃化冻存的复苏方法

以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。 主要材料

（1）设备：高速离心机；

（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。 操作过程

（1）将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；

（2）将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；

（3）沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；

（4）将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。 结果

复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。 讨论

复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。

6

细胞复苏失败的原因分析

来源：丁香园

问：以前拿回细胞后，传代、冻存后复苏过几次都没什么问题，最近因实验室孵箱污染，清洁消毒细胞室后，重新复苏，结果连续复苏6支，细胞均未贴壁，今晚复苏6小时后观察有一瓶相对贴壁细胞数较之前复苏失败瓶多，但贴壁细胞状态不好，形态不佳，透光度亦不好！急求各位大侠会诊指导！

答：juventus2004认为复苏过程没有问题，是否是从液氮拿出直接放入温水，还有培养箱，二氧化碳浓度，培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%，看看能否帮助贴壁，当然也需要考虑血清问题，还有确信拿来的细胞没问题。 pcspc9认为首先应该怀疑冻存，实际上复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板。

1、你冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，即使书上也不讲这个问题，但我因为这个问题就两种肺癌细胞和一种肝癌细胞专门做过试验，这个绝对是绝大部分人细胞复不活的一个原因。太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。 2、你的冻存液好不好，是什么，甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。 3、你的冻存液的量加的是不是太多，ATCC推荐是不超过7%，大于5%，太多也不好。 4、你在冻存的时候是不是把DMSO混均匀，这个有一些影响，但不算太大。

5、你的冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格，很多人容易忘却这个事情，因为这个东西流程长。 6、如果你细胞污染，你是否能很快看到，我比我的导师能早一天看到污染。从这个角度讲建议去除离心这步。 7、你的细胞在冻存前是否过密。

还有，我是不赞成孵箱污染这个概念的，所有在一个孵箱里的细胞都污染一个细菌的话，这个细菌是源于孵箱的，但这不代表孵箱污染，因为孵箱无论你如何处理都有大量的细菌，问题在操作。我们的细胞房不换拖鞋，非常脏，别人的细胞都污染，很多细胞都污染到绝种，但我的只污染一次（两年内只有两瓶），那次是因为别人给我动了，我每次细胞摆放顺序都是记住的。如果你老怀疑孵箱污染，那说明你在养细胞这方面很差。

每次污染的原因都要尽可能的找，以后就不犯同样的问题，这个很重要，不能靠猜，否则你就有可能细胞养绝最后换课题，这个我见得太多了，别不当会事。

7

细胞冻存、解冻方法与细胞计数

来源：丁香园

一、细胞冷冻保存 1、材料：

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法：

（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤：

（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。

（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项：

（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。

（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。 （4）冷冻保存之细胞浓度：

①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml

②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

8

③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml

④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。 二、冷冻细胞活化

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 3、材料：37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 4、步骤：

（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 （3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。 三、细胞计数与存活测试 1、原理：

（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。 2、材料：

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片 9

(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。 3、步骤：

（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml

计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。 4、范例：

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243 平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；

细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106； 细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106 存活率：225/243﹦92.6%

10

细胞培养中霉菌污染问题

来源：丁香园

Julius：我的细胞被污染了，表现为培养液内有浑浊，可见很多白色粉末的东西悬浮，之前发现一瓶有，就丢了，剩下的及时换液，清洗，可在传代后的第二天就又见浑浊，仍有部分细胞是贴壁的，可以看到很多”细胞“首尾相连成一条条的线状，可细胞怎会是线状生长呢？（抱歉没有拍下照片）请问是霉菌还是细菌污染呢？如何区分细菌，霉菌及真菌的污染。现在如何处理呢？污染控制区大家所说的用甲醛熏蒸，碘伏擦拭，或75％酒精 擦拭，是用那种呢？时间要多长呢？ 因培养箱内还有别人的细胞，现在消毒处理时剩余的细胞该怎么办呀？还应注意什么呢？ liyq_1：应该是霉菌污染.其特点正是肉眼可见白色悬浮,形态呈线状.

qxlbljys：1.细菌污染液体混浊,霉菌污染可看见霉苔但液体不混,所以你的细菌和霉菌同时污染 处理:扔掉,以免污染其他细胞

2.你说的线状生长实际上细胞已经接近死亡

3.可以将培养箱用75%的酒精擦拭,并停止细胞培养,然后用紫外消毒房间

sunandsuny：由于细菌的生长分裂呈指数级的生长方式,所以细菌污染后,培养瓶很快就是浑浊的了,但一般不像霉菌污染,霉菌有菌丝,往往呈絮状漂浮,甚至有丝状突起.因此霉菌污染和细菌污染在肉眼上有时可以大体上区分,这只是一些常规的经验,如果要具体确定,还要通过涂片染色,看看是球菌或杆菌或是弧菌．

叶知秋：原代培养的软骨细胞，贴壁良好，长势旺盛，可霉菌悄然而至，大有疯长之势。不想放弃，该如何处理，敬请指点。 ratman：配制以下5X抗生素培养液：AMP:100ug/ml, gentamycin 100ug/ml, 两性霉素B 2ug/ml, 制霉菌素1.5ug/ml, 脱氧胆酸钠 10ug/ml，进行冲击，培养时间为8小时后换液，改用1X抗生素培养液进行培养，以上配方为1x配方。每天换液。 icesugar75：别救了。霉菌是抗拒不了地，别让这瓶细胞把其它的污染了最重要。

eming43：同意楼上的 ，如果细胞不是珍贵的没有了，最好是放弃。你在救细胞上花的功夫还不如重新养，霉菌真的不好处理，况且放在培养箱里还有可能污染其他的细胞，更可怕的是换液时把培养基也污染了，那你就等着更多的麻烦吧！ dongshiwu：照着二楼的方法有效,我曾经仅用二性霉素就将霉菌污染的293细胞救回来过.

linbmm：细胞培养过程中，通常有意想不到的状况发生。昨天观察我的细胞时，发现皿中有黄色斑点形成，斑点边缘不是很清楚，培养液未发生变化，细胞形态也没受影响。其实这就是霉菌污染的早期现象。今天再观察时，斑点已扩散，而且皿中斑点数量也增多了。大家遇到过这种情况吗？怎样消除霉菌污染现象？

juju：如果发现霉菌污染，尽早把细胞扔了，如果是细胞培养板一孔或几孔污染，小心吸除后加高浓度氢氧化钠封闭。避免污染扩大，害及其他孔或培养瓶中细胞。已经发现污染再加两性霉素是没有用的。供参考。

jzyxynwm：霉菌污染不要吝惜细胞,坚决丢弃,复苏冻存细胞,还要注意要把孵箱和整个培养间做彻底消毒,用甲醛熏蒸,孵箱用苯酚彻底搽净!!对于两性霉素等药物的挽救措施建议你不要采用,因为任何一种外来药物对细胞都会产生不良,甚至未知的影响,包者对实验严谨的态度,一切从新开始!!!做细胞培养要抱着平和的心态去做,不可急功近利,这样往往事半功倍!!!!

soso_fan：一般出现霉菌污染，如果不是非常珍贵的细胞一般都是扔掉，而且连相关的容器都要做严格的处理。两性霉素B可以起到抑制霉菌的作用，一般只是培养前把标本短时间的浸泡，培养液里一般不加，因为抗真菌药物的细胞毒性还是比较大的，一旦出现了污染还是早点扔掉为好，以免污染其他细胞造成更大的损失。即使用高浓度的抗真菌药物处理过，细胞估计也不会好到哪里了。

drhl：我的细胞最近也出现了霉菌污染，不知道怎么回事。以前是偶尔有一瓶污染，现在却是大批量的污染。我初步估计实验时吸管不干净，因为那批吸管没有泡酸就高压了。

11

maokai123：酶菌厉害得原因是霉菌会产生孢子，孢子空气传播，比一般接触传播的细菌厉害的多，楼上同学的吸管我想不是问题，霉菌一般是人带到细胞房的，到细胞房最好换衣服换鞋。污染发生了除了常规的处理以外，一定要彻底处理污染材料，焚烧，不要留在实验室，不然容易重复污染，空气要甲醛熏蒸消毒。孢子对紫外的抗性很强。人员的个人卫生也重要，试验服洗洗晒晒吧，不留长发，常洗澡

zhizuchangle：我们是采用在水盘里加硫酸铜来预防霉菌！

wangzhua：我们几乎所有细胞均有如图片中的污染存在,开始时只有较少小黑点粘附在部分细胞上,后来几乎所有细胞身上都长满了如此的小黑点,这个周期要三两个月的时间,小黑点长得不是很快,好象开始时对细胞状态也没有太大影响,但传代时可见瓶底有很多细胞碎片似的东西,这个东西多了以后,细胞长势缓慢.心疼啊,哪位高手有好的办法? 前两在清理培养箱,发现箱体上有霉菌斑,送检以后说是毛霉菌,如何解决?

有时候消化细胞的时候可见到这些小东西从细胞的残骸里跑出来,很恐怖，但活动不是很剧烈,只在原位振动,这也是它长得慢的原因吧。

所有照片在Nikon倒置相差显微镜40倍物镜下用数码相机拍摄,放大倍数约800倍

哈佩雕：你这下就惨了，长了霉菌细胞只能扔了，而且整个实验室和培养箱都要消毒啊。我们实验室液发生过类似事件，我把我们处理过程告诉你，希望对你有帮助：

首先消毒培养箱，如果你们有两个或以上培养箱就好办了，如果只有一个且还有很多其他细胞就麻烦点。只能暂时的放在超净台上。具体如下，中午将空调温度打到最高（也只有31度），超净台开紫外。下午早点来关紫外，将细胞转到超净台内，用75％酒精擦洗培养箱，再用无臭氧型可移动的紫外等照射半小时，然后将细胞放回即可（切记CO2瓶子阀门要关紧啊，不然气全跑光了）。再消毒实验室，先把室内空调和消毒柜过滤网都拆下清洗，在锥形瓶内加点高锰酸钾，放在实验室地上，然后倒入甲醛，立马关门走人就可以了。2天后再开门装好东西，和往常一样开始工作了。由于2天不能做事，个人细胞要先计划好，大家都可以休息两天。 shaverwoo：确实应该仍了，否则挽救只会浪费你更多的时间。我也遇见过，还曾经挽救过，我用了制霉菌素来反复洗涤细胞，并在培养液里也加了，看着细胞长好了，还以为成功了，接着传了二代，还冻了些，可是之后，仍然不断的有霉菌污染发生，取出冻的细胞一复苏，根本不贴壁，一查，是真菌，所以赶紧消毒实验室还有你用的所有材料吧，一定要全部重新彻底消毒 jcl738：三天之内竟然发现有两瓶LB培养基出现了霉菌污染（一瓶加了氨苄），很郁闷，今天不得不把摇的菌倒掉了.使用时严格按照无菌操作了，但为什么还是被污染了呢？

我爱标标：霉菌污染是防不胜防的,你的培养基被污染了,只能说明一个问题:你的实验技术还不过关.再继续努力吧!

frederick：可能是周围的空气中有霉菌，你那操作台附近最近有没有搬过什么中大型的东西，或移动了什么。我们这里前几天移了一下冰箱，那个星期的平板摇瓶全染霉菌了，所以你在接种或培养的的时候千万要注意环境的变化，霉菌就是在不经意见进入了你的摇瓶或平板。

jcl738：我配的培养基不是我一个人用，我实验室人都用啊！我是新手，可能是我的问题！没有搬过什么东西，不过我们的超净台就在门口附近。实验室用紫外照可以杀霉菌么？ 趙子植：LB被霉菌污染的原因有

1、制作时灭菌不完全,可以增加灭菌的时间到40分钟试试看

2、灭菌完全但是灭菌后无适当保存,可以将LB保存在4度的环境要使用时再回温并且注意瓶盖是否有完全密闭 3、操作不当,操作时未按照无菌操作原则保持无菌环境或者是操作人员双手未先以70%的酒精消毒 4、菌种受到污染,所种的菌种已经受到霉菌的污染,建议换掉菌种

5、不论是受到何种因素污染皆可以利用简单的对照组实验来找出污染的原因为何,建议可以自己试试看

freechange：我作了这么多次还没有被霉菌污染过，可能使我侥幸。但我想主要原因是因为我注意了一下操作： 1、我操作的时候，总是在灭菌同时超净台外侧窗口处，喷一些医用酒精，以控制周围附近的空气中漂浮菌。

12

2、在做完试验后，超净台里喷一遍医用酒精，然后严格按照紫外灭菌等操作。

3、 还有，超净台长时间使用了的话，要把里面的防尘过滤网拆下来，用吸尘器或者其他东西吸净，洗净。 wang_gost：培养箱中放一些饱和硫酸铜溶液可以防止霉菌污染细胞

Reesei我做的是霉菌，我也很担心染菌，不过我是担心把别人的培养基染上我的菌，呵呵

有霉菌的话紫外杀菌要 长一些 ，三十分钟左右；超净工作台霉菌与细菌最好分开用，如果超净工作台系统染菌的话，恐怕要进行一次彻底杀菌了；培养基ph值可以适当调高一些，霉菌一般喜欢偏酸性。

mjing：我觉得还有可能是你们实验室还有人正在做霉菌的,如果产孢子的话,紫外消毒的时间应相对长些.还有你可以加青霉素或链霉素在培养基中,效果可能会更好.

gleydream：有一个方法可以试试 紫外开的时间久一些 同时一定要有些间隔 比如 开20分钟，然后关掉10分钟 再开20分钟 记得我得老师以前说过的 因为有时候孢子可能没有完全杀死 两次这样的话 就可以了 。还有就是，尽量不要再太潮湿的空气 操作，同时不要裸手经过瓶口。最好是能直接放在无菌室。一般很少染菌吧。我得LB没有加氨卞的，放了1个月都不长菌。可能和就放在无菌室有关 ，或是超净台

neighboour：我养的VM总是出问题，原代培养后1-2天内没有什么问题，换液一次后1天毛病开始出现。 （1）加血清的VM细胞出现丝状漂浮物质，生长快速，培养液不混浊，细胞生长差。贴图1 （2）不加血清培养的VM细胞没有出现这种情况；

（3）两者均出现散在的黑色“细胞形状”的物质，（贴图2）经观察未见明显增长和数量增多。 我师姐说可能是霉菌污染，并告知我严重的后果，我不知道是不是

我的血清有问题？但是我师姐也用同一大瓶分装的血清，她没有这种情况出现。而且上次出现过一次污染之后，我抛弃了我原有的DF12和血清，重新配置和分装（2）是否为我换液过程中操作不慎？我以前在其他试验室也是如此操作，没有出现过问题的呀。（3）黑色的小颗粒物质是否和使用酒精灯过火玻璃吸管有关？我师姐的细胞有时也出现过这种情况。在以前的培养室（用液化气）内没有出现过这种情况。我不敢肯定这次的污染是否和这些物质有关。（4）如果是霉菌污染，该如何消毒呀？？

fancychen_78：你的真的是真菌污染，链状的菌珠是真菌的菌丝，你的培养液中加了双抗吗，一般双抗终浓度为：青霉素100U/ml ,链霉素100u/ml，市售的青霉素为80万U/瓶，溶于4ml体积内，每1000ml培养液中取0.5ml，链霉素为100万u/ml，溶于5ml体积内，每1000ml培养液中取0.5ml。污染严重时可以采用5-10倍的冲击剂量。已经吸取过细胞或培养液的吸管不要放在过分烧，甚至可以不少，否则，蛋白烧后，会释放有毒物质

midas：建议可以先把液体过滤一下，在悬浮细胞，如果还有问题的话，就怀疑是在操作中有问题－－这时最好先看看别人的操作！ neighboour：midas是说我把DF12过滤，还是说把培养皿内的培养液过滤，另外，如果是真菌感染的话，双抗是否没有作用呀。 midas：当然是把加了血清的DF12过滤！

生物迷：介绍点我的经验：真菌大多悬浮于液体表面,如果发现有少量真菌污染可用大量PBS或D-HANKS冲洗,加含有双抗的培养基培养观察3天,然后看有没有真菌.我用这种方法救了一瓶非常宝贵的细胞(用GIBCO胎牛血清外加FGF-2培养了一个月的MSC).

seaman_wang：如果你霉菌污染，有两种方法，一种是你制备一些小鼠的饲养细胞加入板上，一起培养，让饲养细胞中的巨噬细胞吃到霉菌。第二种，在培养基中加入制菌霉素。

PINX：是真菌污染，可以用两性酶素B试试看，不要用国产的，因为试剂不纯，有较大毒性，GIBCO有商品化的两性酶素，我师妹用过效果不错。

heimukai13：请问:我先配置DMEM,然后过滤,吸3ml检菌三天,若无菌,添加FBS和双抗,过滤后贮存备用.(不知这样对否?因为我是从别的实验室学的,我连续几次配,检菌时都发现培养基表面有一层薄薄的如雪花形状的东西,它在配完培养基第二天下午六七点还看不到,而到九十点就能看到好多,非常迅速,但往后几天却又不怎么长了,培养液一直是清澈的,很纳闷,不知是什么东西,)

13

若配置DMEM后不检菌,而直接加FBS和双抗,成为全培养基,过滤备用,可以吗?

asd1191：双抗要在配DMEM时就要加，然后过滤！过滤后最好在DMEM中加一点血清在培养，这样长菌的话快！过滤前是不加血清的，因为血清是很难过滤的！培养基表面的如雪花形状的东西可能是长菌的，你摇晃一下瓶子，若浑浊了，则很有可能污染了！另外培养基最好不要反复过滤！这样营养成分会丢失的！另外反复过滤的话会偏碱！

heimukai13：哦,原来要先加双抗的!加了双抗,还需要检菌吗,我想一般就生不了细菌了吧!我不加血清都有漂浮物了,会不会是真菌呢,是的话,怎么防止呢?那些雪花状的东东,摇一下,还是在表面荡来荡去,培养液清澈.(见图)我过滤加FBS后的培养液很好过滤的!怎么回事呢?

hualey：加双抗也只是防止一般染菌，但像支原体等污染就很难起作用，所以加了双抗之后还是要验菌的。感觉你那东西像染菌，因为1）你没加双抗；2）开始没有，第二天才出现（除非你的培养基pH发生大的变化，一般不可能）。鉴于你每次都出现这种情况，你是否可考虑环境或操作有问题，你也没说具体，所以只能作为建议。小牛血清不好滤是相对的，我滤过小牛血清，只是比不加血清的培养基难滤，有时含血清培养基用久了，我还用滤器滤过呢！

heimukai13：我第一次配时没有发现这种情况,后面三次操作都一样,而且用的都是刚灭过菌的东西,而出现照片上这种东西了,会不会是培养液里的氨基酸什么的析出来了呢,因为这雪花样东西过上几天还是这么多,是菌的话应该长疯了吧!而如果是支原体的话,应该肉眼看不见的了.

scp：应该不是氨基酸析出，若是氨基酸析出的话沉淀是在底部的。漂浮在上面会不会是霉菌呀？你有没有用这种培养基养过细胞呀？不妨尝试一下看看有没有污染，如果没有污染的话，大可继续使用。还有。双抗一定要在过滤之前就加上，血清最好也是这样（虽然过滤速度会慢一些）。

heimukai13：应该不是霉菌吧,霉菌是丝丝连连的,绒球球样,长起来好多就悬浮在培养液里了,有一瓶细胞曾经污染过,这个就不一样了!我试试看用它来培养细胞!

朱晶：：双抗一定在要滤之前加，对于DMEM培养基我建议在-20冻存后，如果想用最好提前一天化出来，放到4度里放一天再用，这样比较好，因为这种培养基极愿意产生一些析出物，放置一天会就会溶开了。而且我觉得血清最好还是不要过滤，里面含有一些大分子的营养成份，如果过滤的话对血清本身来说是一种损失。

szmengjie：我第一次培养T淋巴细胞，加了PHA刺激其生长。发现显微镜下它们长得特别快，昨天还是密度适中的圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。细胞中间有些聚集成团的颜色较深的象一堆血小板一样的东西。今天一看，已是长得平铺了一视野的密密麻麻的看不出单个细胞的形态，大小。呈向心性分布，即中间密度尤高，而越到边缘，则稀疏点。在稀疏处可看到圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。肉眼培养液里有白色絮状物。白色絮状物究竟是污染还是细胞数太多？

菊花与刀：是不是霉菌感染呢，我前段时间培养的细胞最后就是感染霉菌了，就是一团一团的漂在上面，中间密度高，周围稀疏，高倍镜下可以看到菌丝。

szmengjie：我想霉菌污染是有可能，我用的是24孔培养板，因为标本是断断续续地来，一次只能用其中几个，将那些细胞悬液吸走后，因还有没用过的孔，舍不得丢掉培养板。过一天，看那些曾用过的孔，孔底部长出象雪花一样的，也可说象海藻一样，每个枝象细胞生物学上分子筛的图像一样。我想问：1 细胞太多能出现白色沉淀吗？2 霉菌污染除开看到菌丝，还有其他方法证明其存在吗？早期有什么补救措施吗？3我对细胞培养时出现的污染实在没有概念。有没有哪里提供图谱，让我们这些新手认认敌人的面貌呢？

culture-spirit：1、可以，镜下可见此处细胞程大团分布

2、如果霉菌污染已经到了出现白色沉淀的时候，一般能够看到菌丝了，镜下相当明显 3、这个我也没有找到，好象一些细胞培养的书付页里有，可以请教其他战友 qjzhou2000：

1、不会是 沉淀的，仔细看应该还是可以看到细胞形态的，你用的是不是olmpus的相差境？那种倒置境的相差效果很好，细胞看起来有点象珍珠。

2、霉菌看到菌丝的时候就很厉害了，早期不容易发现，可以加两性霉素之类的抗霉菌的抗生素，具体请在该区搜索，很多都讲到了。

3、现在还没找到，不过一些描述还是很直观的。

14

midas：细胞数太多会出现片状的脱落，所以白色絮状物污染的可能性大些！

独上高楼：霉菌污染后细胞多生长很慢，象你这种情况，细胞一夜就长满，霉菌污染的可能性不大。另外，霉菌污染也不能一下就看出白色絮状物，而是先在镜下看到较稀少的短小黑色分枝串珠，再看到较密集的短小黑色分枝串珠，最后才能肉眼看到白色絮状物，这个过程大约要1个星期左右，而且在这期间细胞几乎不生长。

szmengjie：前段时间我老被这种在细胞培养液中白色的象一片白膜的东西困扰。40倍镜下同“细胞污染讨论区”贴出的图片一样。上周我送了个培养，结果证实是真菌污染。显微镜下（100倍油镜）染色后可见到一颗颗象红色的南瓜子一样的东西（真菌孢子）。据细菌室的老师说还可在这些“红南瓜子”间见到丝一样的东西。可能就是菌丝了。

我已经非常注意实验器材的消毒灭菌，操作应该也没问题。于是将试剂一个一个吸取了放在显微镜下观察，发现是洗细胞的HANK'S液被真菌污染了!现在我已经换了HANK'S液，这种污染可以说被控制了。

yoyo781206：我想应该是污染了，因为我也遇到过，过几天就看到放射状的菌丝了

topgun：象霉菌的菌丝，但应该观察其数量是否增多？因为霉菌污染在2-3天内可见大量的菌丝！如果是不小心带进去的棉絮则不会有数量的增加且培养基也不会变混浊。

yuandong：我想应是霉菌，白色，絮状，培养基变成了黄色。

apple800828：不象霉菌污染。前两天我培养的内皮细胞被霉菌感染了，好典型的树枝分叉样。象抽丝一般。 chenting100：是霉菌，我们的细胞就经常出现这种污染，实验室老师说霉菌有好多种变异呢。 huvec：其中有多细胞真菌污染的特征性标志：菌丝！

wujinghui：我得细胞培养液中不知道是什么东东，它漂浮生长，在瓶底是白色的，在低倍境下就能看到，在培养瓶里边呈葡萄状，还有的呈树枝状，刚开始时候生长的不快，但是很快就长得很快。不知道这个东西是什么东西，英文名字怎么写，最好能告诉以下如何控制！

ya2cyto：霉菌感染。霉菌是以孢子在空气中传播，细胞肯定是不能要的了，一旦污染很难控制 用环氧乙酸熏蒸培养箱，最后再对培养箱进行无菌实验方可使用

wujinghui：不是霉菌，因为霉菌不用显微镜就能看得到的 。我这个不用显微镜是看不到。

shyaroom：不信？你再放个三天，肯定就能用肉眼看到啦，呵呵。不过建议你换个地方放，别把其它细胞再给污染了。 ylh1976：霉菌，树枝状的东西是菌丝，葡萄状是霉菌。赶紧处理掉细胞，培养箱、操作台还有整个培养室好好消毒一下。梅雨季节要千万小心，空气中到处都有霉菌孢子。

深谷幽兰：各位，有时鸡胚成纤维细胞也连在一起，呈树枝分叉状，而正常的细胞单个散在，这是怎么回事？

junny999：我的一个同事养的细胞被霉菌污染，我与她共用一个培养箱，为防止交叉污染，我想在我的培养基里加点抗霉菌的药，请教加哪一种药物比较好？剂量怎样添加？我养的是MSC

XTYang：Invitrogen公司的Fungizone, 1%(v/v)的用量。对有些细胞有毒害作用。

renjiaqiang：我觉得你最好不要加，我加过抗霉菌药物后细胞生长很慢，而且形状也发生改变，不得已重新买了一株细胞，你现在可以先把细胞冻存，将培养箱消毒后继续进行实验。

lingzhiting：最好不要用吧！我用过nystatin，40Iu/mL。霉菌没长起来，不过也许是不溶的缘故，细胞生长很慢，而且还引入了不明杂质，洗了几次，才逐渐洗去。

wuguojun680510：如果没有长真菌就不要加抗真菌药物，因抗真菌药物有较强的细胞毒性，加了结果会适得其反。最好能把环境处理一下。

15

qianyimei：星期一复苏了一支细胞株，养到星期三还好好的。心太急。老希望它能长的快些，所以，将一瓶配成三瓶用，结果倒好，今天早上一来，就发现里面长了很多成团的碎片状的东西，众师兄都说是霉菌，叫我倒掉，好可惜，好郁闷！早知道就不换液了，这一换，全军覆没。那位能有更好的办法吗。

zhaoqingshan：用含双抗的PBS洗几遍，换上好的培养液（比如用点好的胎牛血清）；每天洗1-2次，只要细胞状态还好，洗几天，就能把霉菌去除。然后，检查霉菌污染的原因，清除污染源。zjuaxiu：根据经验霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费双抗pbs时间

zhaoqingshan：那只是说明你的经验，不巧的很，我的细胞(细胞很娇贵，培养液价值约10元/ml)去年七月霉菌污染了一次，全部抢救过来。不可否认很多时候是抢救不回来，前提条件是早发现污染，霉菌对细胞还没有构成太大伤害时候，是可能抢救回来的。当然，最重要的是不要有污染了，预防最重要，即无菌观念要强。 flyingpumc：用3微克每毫升的两性霉素杀杀试试!!!

eweiren：如果不是唯一的一管细胞，我觉得没有必要费这么大力气去挽救，因为有了霉菌，基本上是无法去除的，通过换液只能达到抑制真菌的生长，在镜下看不到不代表不存在，只是由于少或者芽孢看不到，一段时间后它可能还会出来，耽误试验啊！ zhaoqingshan Re:碧海娃娃

双抗PBS是指含有双抗(青链霉素)PBS（磷酸盐缓冲液，也不能杀死霉菌，杀霉菌应该用两性霉素或制霉菌素），使用双抗PBS冲洗仅仅是预防其它细菌的污染而已。Re:eweiren ，你说的是很对的，真正严格的实验是不应该有污染的。

细胞株拿来后，传代几次，细胞多了，就应该冻存一些，一方面以免细胞传代次数多了变成非二倍体或者其它变异，另外就是以防污染。如果自己培养的原代细胞，可以挽救一下试试，大部分情况是难以回天的，看运气了。

不过，我那次污染正是霉季，一般实验室在这个时候，可能就不养细胞了，我们实验室是我们院里无菌观念最严格的一个实验室，在这以前，细胞从来没有污染过。那时候可能是因为空调很久没有擦洗消毒了，而我又太大意，因此感染霉菌了。不过，那次我还真的就救回来了，因为我的培养液中，营养条件特别好，而且我每天洗几次，换液，细胞没有任何的受影响的表现，我做的是原代细胞传代到第三代，刚好该做实验，因此就全部用来做了同一批的实验。 避免真菌污染的几个措施： 1、严格的无菌操作;

2、无菌间定期打扫、消毒，保持干燥； 3、各种培养液、培养器皿的严格消毒；

4、温箱中消毒水中放置过饱和的消毒的磷酸氢二钠或者硫酸铜。

eyeball：霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费。关键是液体一定要保持无菌。培养液过滤后要取一点先放培养箱预培养三天，无菌生长后再用。

dongshiwu：我曾经就回来过遭霉菌污染了的细胞。如果细胞好养或有存货的话，干脆从头作起，要是舍不得可以用PBS液洗3遍，在新的培基中加两性霉素。

XTYang：最好弃掉，要不在以后的培养基中加Invitrogen公司的Fungizone，多换几次后也可。 wangfx_vet：我最近养的细胞总是出现空泡并且不断死光。改变血清浓度也没有用，不知道怎样解决

俺来了：是不是排出污染，比如霉菌包子感染可能这样，因为我的前面一批细胞就这样，培养基不混，细胞内有很多空泡，且可见一些比细胞大得多无明显细胞结构的“圆形细胞”里面有很多小的空泡，如果是这样的话，那就是霉菌污染，但愿你的不是，否则，什么都得重来！

wangfx_vet：对对！就是楼上老师说得那样！那末说我的细胞是污染霉菌了！！！？？？那我就惨了，这是引进的细胞哎，没了就永远没了！没有拯救的办法吗？

16

hkai97：霉菌污染是很烦的问题,试试杀霉菌的药物.这只能是死马当活马医了.重要的是预防.常做清洁和消毒,保持实验室的洁净度.否则还会出现细胞污染.

doctormeng：谁知道细胞培养血清中出现黑焦虫，该怎么办？ 有没有专门对付他的东东，比如抗生素之类？我养的细胞中出现了：中间一个黑黑的东西，其四周包围有象棉花样的的东西，不知是不是黑浆虫。其周围的东东，有点类似于菌落。

huiql：我以前也遇到过这种情况，估计可能是真菌污染，慢慢地培养液就变混了，有人说用制霉菌素在刚出现时可以制服，但我没有试过，听说南方的真菌污染和北方的不一样，这种可能属于南方的。

义超：先需确定到底是何种微生物，可以去微生物科做细菌培养来确定。如果是真菌，细胞又实在很难得，可在细胞培养液中加入二性霉素D来挽救，也许有用。

hantian：黑胶虫好象不是诸位描述的样子。我碰到的黑胶虫有点类似与杆状细菌，但长度比细菌长，而且会左右摆动，甚至游动。这是血清中带来的，不属于细菌，普通的抑菌方法是没用的，而且他长势很快，所以遇到这种情况只能倒掉。也有人说，进口血清中的黑胶虫要甚与国产血清。

ph123：同意楼上的意见。我亦在细胞培养中遇到同样的问题,胶虫成熟后呈线状,可以快速移动,一般由血清中带来,如果发作的话只有把细胞弃掉,而且要赶快换血清。但你描述的情况还不能肯定是胶虫,可以通过培养,在油镜下观察一下,看是否是污染. 另外如果你观察到的情况没有发展,细胞不受影响的话,亦可能是血清中的纤维蛋白沉淀.

icesugar75：As far as I know, the black cluster is mostly 霉菌, since I encountered it before. But you could know it quickly if it is 霉菌, becaue 霉菌 is growing very fast, finally showing up in unclear appereance csdoctor：听协和基础所的陈实平老师说，她并不认为真有什么黑焦虫。

icesugar75：一般霉菌很难控制，一天或是两天就长起来了。如果刚刚怀疑有霉菌，加双抗可能会好使，但说实话，刚刚开始要想判断是不是霉菌真是太难了，当时的霉菌类似死细胞，两三个小团在一起，暗的，如果不是特别有经验，很难说是不是。所以如果发现有小黑点，取出一点放入37度培养箱中一天就知了，而把余下的血清冻好。如果运气好，双抗会管用，不好就扔了吧。 lim99011：双抗好像对霉菌没有用吧?我好像记得霉菌用的是两性霉素,双抗没有作用的.

zzy8896：一点经验之谈！我在养pc12细胞时出现过这种情况，我的细胞也是莫名奇妙的出现，而且过几天后，细胞活力状态明显下降，最后死亡，但不同于一般的细菌和霉菌。我请教了许多人，没有结果。我试用g418加在培养基中，养了一阵子，后来就消失了，但你要摸一下浓度。到现在我还是没有搞清楚什么原因，可以试一下。我倾向于它是一种特殊的细菌 ronic：我也觉得双抗对霉菌没有用，加抗真菌的药试试看了，不过好像很贵，而且细胞对它的耐受性比较差。 Yong：建议慎用G418，除非你的细胞有抗性

happywind：养原代，不幸4天后发现多瓶惨遭霉菌毒手，有一瓶细胞贴壁挺好，且菌丝没有沾在瓶底上，因此我想试着救救这瓶细胞，换液，反复冲洗，最后再放进孵箱，结果过了两天，培养瓶里的细胞竟然长的挺好，没有丝毫霉菌污染的迹象。难道这样也可以！

kaize：不知污染的细胞的一些基本特性会不会改变 chelonian：但是这样的细胞，做实验结果可信吗

Skyhawk：这是我们实验室细胞培养出现的不像霉菌，不像死细胞的东西，培养越久越多，看看大家是不是也遇见过，是什么呢？什么原因引起的？

（图：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1650849&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1650849） 以上图片取自转染有目的基因的cos7细胞，是在用G418筛选时出现的东西，不同细胞都有（vero细胞也是），我的师兄和师姐都出现有类似的情况，但我的细胞没问题（和师姐的实验目的一样，只是我是自己另外准备培养基的），目前他们都挺困惑的，希望得到dxyer的帮助！？

taolt：我感到是真菌污染，肯定不是培养液解冻后出现的东西。我们这里配好的培养液都先冻到－20度，等用的时候再拿出来用，已经有4－5年了，从来没有见过这样的东西。我有一次也是感染了真菌，与你的照片很相似，而且在早期并不影响细胞的生长，

17

甚至细胞长得速度更快了。这可能是因为有的真菌会分泌一些能促进细胞生长的因子有关。加些抗真菌药物，要是不重要的细胞就扔掉吧。再看看细胞孵箱里有没有真菌斑！

Skyhawk：我们一般都是把培养液配成1X，过滤后放4度保存使用。所以，应该可以排除是培养液冻溶的问题。培养久了，细胞生长状态不好了，但培养液没有变浑，不像是细菌污染。真菌污染倒很有可能。谁有类似情况的照片放上来看看？

曾经用不含抗生素的培养基出现过细菌污染，反复用双倍抗生素的PBS洗后，用含抗生素的生长液培养，不再出现污染。看来这个方法可以用于一般的细菌污染的解救。

如果是真菌污染，我想可以用类似的方法，但抗生素要用相应的抗真菌的。勤换液。但这个方法适合在污染不是很严重的时候用。 helenm：培养的细胞有轻度的霉菌污染，有办法补救么？ 这可是我辛苦养了两个月的细胞。 iris_cql：以我以前养各类细胞的经验，出现霉菌的最好补救方法： 1、重新配置所用的全部培养液、PBS、消化液等，确保无菌！

2、用双蒸水洗细胞1－2次，然后在用PBS洗细胞1－2次。记住动作一定要轻柔！后换上新配的培养液！ 3、彻底打扫细胞室，培养箱等。

little_G：偶的经验是，如果发生霉菌污染，最好是马上检测，一般轻微霉菌污染对检测结果的影响不大。至于想解救，你想想用什么抗菌素能行呢，除非你用复康唑，那也难说好用。最好彻底重来，只要不影响别人的和自己的其他细胞就算万幸了。 小样－菜鸟跑路：霉菌污染是不是培养基一定变混浊？霉菌能进入细胞吗？在我印象中是培养基变得很混，能见到白色的菌丝之类的，细胞状态不是很好。可是有人说霉菌污染能进入细胞，是真的吗？

loyal1006：霉菌污染后培养基不一定会变混，是否变混要看霉菌的生长速度。霉菌污染肯定会影响细胞生长，最终结果是导致细胞脱落、死亡。霉菌较大，污染后很容易在显微镜下看到大量的典型的霉菌丝。 angel2004：我的细胞被真菌污染了，有什么补救措施

sonina你用两性霉素处理，最好作抑菌试验，确定使用浓度。之后，用两性霉素的培养液培养一代，如果霉菌消失，换用正常的培养液（即没有两性霉素的培养液）培养一代，如此反复3次，确定没有霉菌后，以致可用正常培养液培养。这样太浪费时间，最好还是弃掉污染的细胞，重新复苏新细胞。

zhanghong38：我是一个试验新手，现培养血管内皮细胞，反复遇到霉菌污染问题，已试过用酒精和新洁尔灭试擦孵箱，但均不奏效，恳请各位师兄师姐不吝赐教，感谢。

topgun：关于污染的问题，这涉及几个方面的因素：操作，超净台、孵箱。

（1）操作：做实验时应养成无菌观念（操作前用70%酒精檫手，实验时如吸管等物品接触到台面应立即更换，并隔3-5分钟用酒精灯烧灼吸管）。

（2）超净台：如果超净台使用时间过长（3-5年以上），应及时更换滤板。消毒的紫外灯管也按时更换。在操作前用酒精或新洁尔灭檫拭台面。

（3）孵箱：怀疑孵箱污染时，将孵箱关掉，然后用上述消毒剂消毒，之后用移动紫外消毒车将紫外灯插入孵箱照射30分钟以上。 zrzhong6519：还有注意孵箱内的水盆， 经常检查， 如发现有絮状物，立即更换灭菌水， 之前用75%乙醇擦拭， 第二天要及时察看是否彻底，不彻底在按上述方法再来。

lwangfang：我建议你们把所有的与培养相关的物品进行一次彻底的消毒，然后启动孵箱的自动消毒功能让其消毒过夜，再注意一下操作。我觉得物品污染的可能性比较大。

yoyo781206：反复遇到霉菌污染问题，最可能的还是在操作中不太注意无菌观念所致。应当要常用75%酒精消毒手，靠近火焰旁操作，注意吸管口，瓶口等不要接触到桌面或手等地方，如果碰到，尽可能弃用吸管，或者在火焰上烤一下。超净台也是关键的，每天使用前消毒30分钟，用完也应当消毒30分钟。孵箱，已试过用酒精和新洁尔灭试擦，应该可以视做是安全的。个人观点

18

ahui：主要考虑手的污染。

狮心：霉菌反复出现，还有一个问题要注意：环境湿度，必须注意除湿，长期不用的东西，使用前必须从新消毒，把冲洗消毒和培养分开

liuxiaohua889：以前是否养细菌?可以全面消毒再作,有条件换培养箱,无水的较好

miffyqx：感觉有细胞污染了，于是很不放心，请问染菌的培养瓶再污染别的瓶里细胞，直至污染整个培养箱里东西的几率有多大？以前听说过会这样的

香山雪林：你的培养箱采用什么样的抑菌方法？我现在采用的是：水盘中装饱和的硫酸铜溶液（无菌水配），有资料说可以增大保险系数。

miffyqx：我们的做法和你们差不多：饱和硫酸铜溶液配制后，高压蒸气灭菌，放在水盘里。这样很有用是吗？特别防箱内染菌？？ shyaroom：霉菌污染会染坏一箱子细胞，因为霉菌会飘，但细菌不会的。 yuefeiyf：硫酸铜只是保证水不长菌，对其他地方无效。

路遥只要抢救措施及时应该不会有大问题，我的细胞出现过霉菌污染，但及时用苯酚消了孵箱，用甲醛重熏了培养间，没出什么大问题．

pipi： CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 gongqiang：孵箱霉菌污染，经新洁尔灭及酒精彻底擦洗数次并紫外照射灭菌处理，仍有霉菌滋生，恳求高手出招解救！ 203040：天气炎热，霉菌也开始肆无忌惮的繁殖。想想去年这个时候，也被霉菌折腾得郁闷无比。还好后来控制住了。经验如下： 1、细胞培养室大扫除，水池、吸引器中的引流瓶等无一不是霉菌孳生的地方。然后室内进行紫外灯照射杀菌。 2、培养箱消毒时是否注意了里面的几层钢板。紫外线照射时得拿出来。我当时干脆就放到180度烤箱里考过夜。

3、处理培养箱时还有个要考虑的地方，培养箱内的细胞培养瓶。重新放回去的时候得用酒精将瓶周搽洗数次，能换掉更好。 4、培养箱搽洗时重点在箱底的四个角落。

碰到顽固的霉菌孳生时的确很伤脑筋，最夸张的时候消毒第二天箱底就看到白色的点装物。总的原则就是彻底的杀、杀、杀！当时我就是这么处理的，后来情况大为改观。你可以再试试。

gongqiang：谢谢！我已经和霉菌奋战近一个月，我总是失败者！上述方法：如将培养箱能拆下的都经高温高压消毒，各个角落每天新洁尔灭、酒精擦洗，都不行，辛苦不敢说，努力总没结果！

amwwxf757：你应分析一下每次成功和失败的原因，用本子记下来。操作要细心。请一位有外科经验的人给你看一下是不是有漏的地方没有消毒好。全面包括各种试验品和培养器。

flyingpumc：因为霉菌有孢子的存在，所以酒精，新洁而灭，紫外线等等根本不可能去除霉菌！我们原来用过国外带回来的一种试剂稀释后可以用来抑制霉菌，但是我们没有发生过霉菌污染，所以不知道效果到底怎么样？而且这种试剂可以稀释后直接放在孵箱内，此试剂对细胞没有毒性！具体是什么我也忘了！！你自己好好查查吧！应该会有这种试剂卖！ zjuaxiu：有带消毒程序的培养箱，很方便。

jzyxynwm：整个培养间用福尔马林和高锰酸钾熏蒸,孵箱内部包括托盘等全部用苯酚搽洗,封闭2天,基本就没问题!!但培养良好的无菌观念是前提！真菌多数是空气中悬浮污染，所以除紫外线照射外，每次进出培养间要用来苏或者新洁尔灭搽地，减少空气悬浮颗粒及细菌！！

开心的水：一周清洗一次，75％酒精擦洗，再将温度打到94度持续3到4分钟。

19

wangyibo：孵箱内托盘的水中加一些硫酸铜可抑制霉菌。

无影剑客：做原代培养，20多天后已经传代或要传代时几瓶细胞均出现局部黏附在在瓶底的葡萄状漂浮物,摇晃后会有部分脱落。有两瓶突然出现浑浊，镜下找不到细菌。换液后漂浮物较前增多。疑为霉菌污染。原代培养做的好辛苦，突然发现大面积污染，最近一两个月的工作就要化为乌有。请教已经出现的污染有没有办法弥补。两性霉素B如何配制、贮存及污染后的最大应用剂量。 youngtiger：做原代培养出现污染原则上应遗弃细胞，但鉴于你的个人原因及我以往排除污染的经验，现给出以下建议：两性霉素，浓度范围1-50ug/ml，常用浓度3ug/ml；制霉菌素，浓度范围1-500U/ml，常用浓度50U/ml。两者任选其一。 Pathway：建议楼主楼主试一试用96孔(或48孔)细胞培养板来培养;这样局部的、偶然的污染不会使实验全军覆没。因为我也经常要做原代培养，一般会同时接种细胞培养皿和96孔板。因而有时会出现这样的情况：5块96孔板总共只有4、5个孔污染了，但所有的细胞培养皿都污染了。从来没有发现细胞培养皿没有污染，但96孔培养板却污染了（至少目前是这样）。对有污染的培养孔，我一般用8M的NaOH处理（加热至70－80度，污染也从来就没有扩大过）。总之，原代培养出现的污染多是机会性、偶然的，使用96孔或48孔细胞培养板是一种很好的控制污染的手段。（说到底是一种机械的、行之有效的隔离措施） loyal1006：已出现污染一般是无法挽救的，两性霉素、制霉菌素也只能是预防污染，或许在污染的早期还有一点作用。目前关键是要找到污染源，以防下次再污染。

qingshi：这段时间大量养细胞，呵呵，880多个，那个多呀，可是竟然出现霉菌和酵母污染，于是，消毒处理，可是，污染照旧，于是大胆决定，撤掉水盘，呵呵，果然效果良好，已经20多天了，一切正常，顺便说一下，我同时养的悬浮、贴壁。加入10ml培养液，3天换液，没问题。

Pathway：楼主不是同时养880种细胞吧？而是用了96孔培养板养了多种细胞吧？我觉得国内还没有那个单位和公司能同时养880种不同的细胞。另外，不要水盘的话，楼主怎么保证培养箱内的相对湿度呢？（培养箱内的高湿度和温暖的环境确实是最适合霉菌生长的），我的培养箱内也可见长有很多的霉菌，但会引起细胞培养瓶内的细胞污染的可能性却很小（即使使用细胞培养皿和细菌培养皿也是如此）；不过，由于我的培养箱可自动消毒，我一般每个季度都会消毒一次。

qingshi：no。贴壁细胞无法用96孔板，当然不会一次性培养880种，而是持续培养，一般维持在80多个，使用50ml的培养瓶。我也担心湿度问题，但是没什么大问题。

小毒物：我正在养细胞,一开始有10瓶,不断的养,不断的有真菌污染,现在剩下4瓶了.因为也并不是所有细胞都出现污染,大家帮忙分析一下应该注意哪些问题?

juju：真菌污染是细胞培养过程中常见的问题。首先，环境需要清洁，超做台每天用新洁尔灭清洗是必要的。然后在培养基中适量添加制霉菌素，和两性霉素可以抑制真菌及其他霉菌的生长。再者，超做时加以注意。应该对你有帮助的。细胞培养过程中常见的问题建议你可以看看“细胞培养实验指南”一书。里面有更详细的讲解。

mlfyandw2002：最好的方法就是丢掉它,然后用甲醛熏蒸,再就是集体放假一个星期.再回来重新做过.

小毒物：谢谢两位,我已经将孵箱用甲醛熏过一次了,每次照台子之前用酒精擦台子,紫外线照30分钟,操作也很注意,但还是不能幸免遇难,看来要加制霉菌素等试试看了

fairyland：最近培养筛选细胞频频污染，以前操作还没有现在认真，细胞一样长势旺盛，一点问题也没有。现在越是小心谨慎，却总是污染，即使第一二天没有污染，时间稍长就出现了。其它同学有时有，但我出现的次数最多。一种是一小团一小团褐色成致密网状，一种是如同芽孢状，一串一串的。细胞筛不出来后面的试验根本就无法进行，真是心急如焚，大家帮帮忙吧！ gsy1234：严格保证泡酸，消毒过程！，换血清和重新配培养基！我有过类似经历！这样处理后就没出过问题！舍不得孩子套不住狼！麻烦一点，总比浪费时间和金钱重要！

weric：你的问题很严重, 且强烈怀疑有fungi 污染(是如同芽孢状，一串一串的), 所以根本解决之道, 先把 CO2 incubater 以酒精和抗 fungi 药物擦拭, 铁盘拿去灭菌. 然后所有 mdium PBS 重新配制, 最后重新解冻新细胞来培养

zhizuchangle：最好来一次彻底清洗，包括培养箱水盘和无菌室，所养的细胞全部高压后弃去，水盘别忘了加点硫酸酮，可以防霉菌。若是怀疑培养液污染，可以在每次配液时先装一小瓶观察，直到确定无污染再使用！

ssmu_fruit：不必太紧张,这种经历养细胞者一般都会有。瓶口不要太松(防止孢子飘入),放入培箱前瓶口烧一烧,瓶身用酒精棉擦拭一下。培基等过滤过的液体不必扔掉(0.22um),没有问题。培箱开启前大家都用酒精消毒手,避免不必要的污染。要保证冻存的细胞未经污染.

20

紫水晶：我最近养CHO-HUK细胞，这一个月来总是污染，有时是细密的东西，像是细菌；有时是霉菌，刚过滤的2000ml培养基都污染了，可以明显看到白色的菌落生长；再就是我的胎牛血清过期了一个月，发现里边有许多漂浮的异物，在镜下看是许多弯曲的东西，在孵箱里培养一天便混浊，应该也是细菌污染。我想请问：血清过期和污染有没有必然的联系？在这样潮湿闷热的天气里应该怎样预防和控制污染，大家有什么好办法？ little_G：可能的原因：

1、天气太热，实验者在培养和接种或者换液时出汗（有空调稍好，但是手也出汗）。 2、培养间里可能暗藏污染原。

3、注意培养箱（这点最重要），仔细检查培养箱里的隔板的下面，有可能有霉菌斑。（我遇到过） 4、培养基污染多数是配置过程中造成的，仔细检查配置过程用到的器具。

5、血清过期一个月，如果保存的好应该没有问题，但是保存不好，新来的血清，用一次就可能污染。血清过期和污染是否有必然的联系不好说，个人体会觉得其联系不大。 解决办法：

1、彻底清洁培养间，显微镜室。然后，紫外灯多照射一端时间消毒空气。

2、彻底清洁培养箱：（1）每个隔板仔细清洗，火烤。（2）培养箱大换水，换成新鲜干净的蒸馏水。（3）培养箱内壁用酒精棉球或者稀过氧乙酸认真擦洗。（4）紫外灯长时间照射（一天）。

3、实验用器械消毒：注意消毒时间和压力，有必要检查压力锅和校正压力表是否准确。 4、一次性手套在打开使用前一天放入无菌间照射消毒。 5、如果用双抗，应该现用现配。 6、注意过滤器的消毒灭菌。

7、过期的血清，可以做培养检查是否被污染。如有怀疑，建议不用。 8、检查培养间和超净台的通风过滤网，如果脏了，需要更换。

总之，潮湿闷热天气培养细胞非常容易污染，必须注意每一个环节。具体的可能造成污染的环节，还得要自己体会查找。 hdfi8d：

1、用碘伏仔细擦洗浮箱和操作台，地面，然后用紫外灯照1小时 2、处理完细胞放回浮箱是用酒精棉擦培养瓶的底部

happywind：我的一瓶价钱不是很贵的血清，用后总是发现培养基中有很细小的类似细菌污染的东西，但是培养液又不很快变浑，不像细菌污染，细胞长的也慢，现在想想也许就是血清的问题吧，养细胞血清的选择还是很重要。 避免污染，我认为：

1、每次做完实验，超净台要用酒精喷擦；打开紫外线照射； 2、严格无菌操作； 3、孵箱定期清洗，换水；

4、每次观察细胞后，酒精喷瓶口；

21

5、培养瓶最好放在一个托盘上，然后在放入孵箱。托盘是高压蒸汽消毒过的。

limengqiang：防止细胞污染很简单，只要按照外科手术的操作原则进行无菌才操作，保证污染不了。

olivezrp：还有 一个 问题，就是血清用之前是否灭活过。很多公司的血清 ，分装 之前 需要灭活，不是一定要灭活 的，但如果 你 没有 灭活，即使没有污染，镜下也 可见 许多 漂浮物，一般为 衣原体、支原体等，建议血清分装前，56度水浴 灭活30分钟。

guanping：倒置显微镜一般是看不到\许多 漂浮物，一般为 衣原体、支原体等\的,关于血清污染:买回来后(进口的一般不需要灭活),溶解后分装一小瓶,培养箱里72 h 以上,即可看到污染与否(没有污染的应该是透明度很好的).如果有问题,就退货,没有话说.如果发现溶解后即可看到明显的漂浮生物,呢就不用我说了。使用过程中,最好分成小瓶,用个1 周左右,4 度保存!反复冻融,对其效果和性状有影响.

brisk2004 ：我最近也碰到了这样的问题，养的815细胞总是污染，把培养基，胰酶等什么都丢了也不行，后来我发现培养箱里面长霉了，清洗灭菌之后才没事了。

22

新购进细胞株的问题

来源：互联网

正在定购MG63 ，即人成骨头瘤细胞，但是以前没买过，都是从别人那直接扩培的，所以对于刚拿到细胞株要做的不清楚，恳请有经验的战友提供帮助。 打算买三瓶，新购进时应该会配培养基，那我是否需要提前配培养基（按厂家提供的培养基配方，是一拿到手直接冻到液氮里吗？还是先培养几天再冻？查文献发现很多种培养基都可以用，可否用实验室已有培养基培养，大约需要多久后才能用实验室的培养基培养。

对于新买的细胞，必然是有说明书的，建议先定购说明书中的培养基，扩增后可以试试其它的培养基，当然是因为经费的问题。一拿到手可以先放到液氮里面，如果不能充分准备后马上培养。最好你扩增到第3代后用实验室以前用过的培养基。 收到复苏状态的细胞后的注意事项：

1、收到细胞后，在操作时用75酒精将培养瓶外面擦洗消毒。

2、收到细胞后，瓶中老培液和培养瓶均不能重复使用，全部换用新的培液，将细胞移至新的培养瓶。

3、通常供应细胞方的培液不会加任何抗菌素，在收到细胞后进行换液或传代时，视情况在培液中加双抗（100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素）。

4、对一些贴壁不牢地细胞，可重新吹打，离心（1000rpm/min，3分钟），接种。

5、在没拿到细胞前，先了解清楚细胞特性，培养方法等细节，不要等到细胞到了手忙脚乱的。关于细胞特性和培养方法可多参考ATCC网站介绍。http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/tabid/112/Default.aspx 6、ATCC已经修改了大部分细胞的储存条件，用原来可以存放液氮液体环境，改成了建议储存液氮气相环境。

23

细胞的复苏经验总结

来源：丁香园

在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为同行提供些参考。 【材料】

1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。

2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。 【操作程序】

1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。 3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。

4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。 5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。 7.记录复苏日期。 【注意事项】

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。

5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

24

25

细胞冻存与复苏技术

来源：互联网 复苏技术

1. 细胞复苏的原则

在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 2. 细胞复苏的主要操作步骤

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。 3. 注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 技术总结要点 1. 冷冻速度

冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。

不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。

不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说，小细胞（如红细胞等）对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达103℃/min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100nm以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1～5 ℃/min为最佳。 2. 冷冻保存温度

冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。

26

冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度（-196 ℃）是目前最佳冷冻保存温度。在-196 ℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70～-80 ℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在0～40℃范围内保存细胞效果不佳。 3. 复苏

复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有最佳的复温速度，这样才能保证最终得最佳冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱得多。 复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快，持续时间也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现，冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤，反而是在复温过程中，复温到-40℃或者更高的温度时，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温，也就是通常采用的快速复苏。因此，最佳复温速率与最佳冷冻速率对保证获得最佳冻存效果同等重要。 4. 冻存保护剂

冻存保护剂（Cryoprotectant）是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常为溶液）。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。

推荐一种简单实用的细胞冻存方法

来源：互联网

冻存液：一般用10%DMSO(推荐用sigema原装的，质量好不用预消毒)+10％血清的完全培养基，如果细胞珍贵的话最好用10％DMSO＋90％全血清。

降温方法：用最少两厘米厚的医用棉纱将冻存管紧紧包裹，扎紧，直接放入-70度冰箱，隔夜取出冻存管直接放液氮冻存。 复苏效果对比：细胞冻存2周后复苏，本方法冻存的细胞与使用程序性降温仪冻存的细胞复苏效果相差不大，但明显比传统4度、-20度、-70度的方法要好，传统的冻存方法不但费时费力，而且各时间段的放置时间并无严格统一，尤其在4度和-20度时间不好掌握。

要点：面纱包裹一定要足够厚，细胞用冻存液重悬后不要在常温放置太长时间。从-70度取细胞的时间无严格控制，我们曾经放过一个星期后在入液氮，同样可以顺利复苏。

27

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/lbqo.html