大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化

大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化

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菱

食品与发酵工业

F o n emett n Id sr s o da dF r nai n ut e o i

Vo.9 N . 12 o 2

大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化艘蠲

谢岩黎，

李元瑞

l西北农林科技大学食品科学与工程学院，凌， 1 1 0 (杨 720 ) 2河南职业技术师范学院食品科学与工程系，乡，5 0 3 (新 4 30 )

摘

要

采用热变性、乙二醇 ( E 60聚 P G)0 0沉淀作用和 D AE纤维素柱层析 3种方法对大 E一

蒜细胞溶质中的超氧化物歧化酶进行分离纯化。经过 3步分离纯化， 5 0大蒜中得到从 0g 1 . mg产品，活为 31 5 5 rg酶的类型是 C nS 56比 4 . a。 U/ u Z -OD,紫外区的最大吸收峰是 2 8在 5nm o

关键词

大蒜细胞溶质，超氧化物歧化酶，分离纯化

超氧化物歧化酶 (u eo ieds ts, sp rxd i muae S oD)一种具有清除体内超氧自由基 ( -是 02

1 3试验设备 .

uv一 1 0紫外一见分光光度计、速冷 10可高冻离心机 ( u o tRC 5 )恒温水浴锅、 D P n 一C、核酸蛋白检测仪、 S .0自动部分收集器、 B Z1 0 HL 1恒流泵、 M一7型记录仪、量进样一 L 1微器、功能加工机。多 14工艺流程 .大蒜+缓冲液一组织破碎、提一粗滤浸一

)金属酶，有效预防 02对机体的毒害的能 -

作用。国外作为临床药品在治疗由 02损 - 伤引起的疾病上效果显著…。对其应用的研究受到科技工作者的关注[引。大蒜 (— , Az l st“ )含 S i“ ai m是 0D丰富的植物之一。

自 16 9 9年 Mc o d和 F io i Cr r vc d h首次从牛血红细胞中分离出 S OD以来，国科学工各

热变性一冷冻离心一P G60 E 0 0沉淀一上

作者对 S D的深度纯化做了大量的探讨 L。 O 4 J在前人工作的基础上，们通过试验优化出我热变性法、乙二醇 ( E 6 0聚 P G) 0 0和 D AE纤 E一

DE - AE纤维素柱一梯度洗脱

一收集活性部分。

1 5试验方法 .1 5.粗酶液的制备 . 1

维素 (一2阴离子交换分离柱层析分离纯 DE 5 )化 S D的方案，确定出最佳的工艺条件， O并具有一定的理论和实践价值，具有创新意并义。

将去皮大蒜 50 0 g用多功能食品加工机破碎后加 50 0 mL,p 7 8 0mmo/ H .,5|L磷酸钾缓冲液 ( B) 4C浸提 3h用 4层纱布过 P,",滤， 2 0 ri 1 0 0r a n高速冷冻离心 2 n后即/ 0mi得粗酶液。1. 2热变性 5.

1材料与方法 11大 .蒜

产自河南新乡郊区。1 2试验试剂 . K2 0、 HP 4 KH2 O4连苯三酚、巯基乙 V、醇、 DT聚乙二醇 ( E E A、 P G)6 0、 AE纤 0 0 DE一

取 4℃、 0、 5、 0、 5、 0, 5 5℃ 5℃ 6℃ 6℃ 7℃ 时间 5 i、 0mi、 5mi、 0mi、 5mi a rn1 n 1 n 2 n 2 n及

3 0mi行二因素六水平热变性试验，时 n进同测定酶活力。1 5. PEG6 00沉淀作用 . 3 0

维素 (一2 W h t n产品，海试剂公司 DE 5, ama上分装 )。第一作者：士，师。学讲 收稿时间：0 2—1 20 2—1 0

热变性后的粗酶液经高速冷冻离心除去

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维普资讯 第 2 9卷第 2期 谢岩黎等：蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化大

杂蛋白后，整酶液中 P G的浓度，定上调 E测清液的酶活力。15 4 ..纤维素柱层析

化工作提供了有利条件。 2 2聚乙二醇 6 0【 E 0 0的沉淀作用 . 0 0 P G6 0 )调整酶液中 P C 0 0的浓度，时测定 E, 0 6同

经 P G沉淀后的 S E OD酶液用 5 mmo/ |L

上清液中的酶活力结果见图 2。由图 2可知， P G浓度在 0~ 2%当 E% 8之间，清液酶活力保持不变； P G浓度上当 E在 2%~ 4%时，清液的酶活力逐渐降 8 0上低， 0时上清液的酶活力为 0 S D被完全 4%,O沉淀下来。300

磷酸钾缓冲液溶解后，离子交换柱。层析上柱 1 5c x2 m。流动相

:为 H2 B为 . m 0c A o,0. 5mo/ 0 l L PB+ 1 0 mo/ Na, . l L Cl UV (=

2 0n, 3 i集 1管，录仪的纸速为 8 m)每 r n收 a记2mm/ n卜 o mi L

1 5 5酶活性的测定方法 ..

改良的连苯三酚自氧化法 J。156 ..蛋白质的测定方法、

童l 5 0

凯氏半微量定氮法。

藿O

2结果与讨论 21温度与加热时间对粗酶液中 S . OD酶活力的影响3‘ ) X一

图 2 P G的沉淀曲线 E

2 3离子交换柱层析分离纯化 .为了优化最佳分离纯化工艺参数，以流速 ( 9 1 2 1 5mL mi )柱高比 ( 8 1 0.、 .、 ./ n、 1:、:

20 5

毛 2o ol 0 5忙 1 o 0

1、: 2、样量 (、 .、 . 0 1 1 )进 3 4 5 6 0mL)因素，为

} 5邕 o【 1

以比活为评价指标进行正交实验，果见表结1 o l 5 2 0 2 5 3 0

5

1。从正交实验结果表明， 3种因素对 S D O比活的影响不同，度不同，强弱顺序为流强其

加热时间/ i a rn

图 1温度和加热时间对粗酶液中

速>柱高比>进样量。其工艺最佳条件为A2 2 l即流速为 1 2/ n BC, . mL mi,柱高比为 1:1,样量为 3mL 0进。

S OD酶活力的影响一

÷- 4":△一 5℃;￣ - 5"; - 5C一 0一 5C一

0— 6℃; X- 6";口 - 7" 0一 - 5C一 0C

2.大蒜细胞溶质 S 4 OD在 D AE纤维素柱 E .层析图谱

图 1结果表明， 5 5℃之间随加热时 4~ 5

宪 延告，活力呈增高趋势； 6℃随热间的长 酶于 0

楚

变性时间的延长，活力在 5 0mi酶~2 n增高，

在最佳工艺条件下层析，到 S D的洗得 O脱图谱，果见图 3结。由图 3可知， D完全被洗脱的时间为 O S

2~3 n呈下降趋势，中在 6℃、 0mi 0 0 mi其 0 2 n时酶活力为最佳； 6于 5~7℃酶活力随热变 0

性时间的延长呈明显下降趋势。在粗酶液中可能存在一种对热不稳定的物

质，扰酶活干性的发挥 (至于在常温时测不出酶活力 )以， 加热能使它钝化 ( 0以上 )但温度过高时 6℃,又可破坏酶的活性。因此，择适宜的温度选和时间是热变性的关键。热变性除去了干扰物的同时，又除去了一部分杂蛋白，为后续纯

3 n洗脱体积为 4 ,大量杂蛋白被 3mi, 0mL而洗脱下来的洗脱时间为 6 n体积为 8 6mi, 0mL由此可见， OD的洗脱所需时间较短，。 S 且在大量杂蛋白被洗脱之前，有较高的柱具效。

2 5大蒜细胞溶质 S D的纯化结果 . O

纯化结果见表 2, 5 0g大蒜中得到从 0总活力为 4 6 . U的酶蛋白，比活为 90 9 83 5

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究报比|l=

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洗脱体积/ mL

图3 S OD在 D A一维素柱上的洗脱图谱 E E纤表 2大蒜细胞溶质中 S OD纯化结果

由于 C n S u Z—OD对氰化物和 H’均 O,敏感； eS F—OD对氰化物不敏感，对 H’)敏而 (’

峰在 2 8 m处。 5 n

感； -OD对氰化物和 H2 2均不敏感， MnS 0因此可用这 2种抑制剂鉴定大蒜细胞溶质中S OD的类型。试验结果表明， . 1 5mmo/ 1L KC可抑制其活性的 9%, N 3 4mmo/ 0 lL H, 2可抑制其活性的 8 9%,此可判断该酶类型因是 c nS u Z— OD。在紫外区进行吸收光谱扫

3结论 大蒜细胞溶质中 S OD是一种热稳定性 较好的酶， 6℃、 0mi在 0 2 n进行热变性实现初步分离纯化，不引入杂离子，除去了一 既又部分杂蛋白，保留了大部分酶活力 (>还

8% )因此是一种简便、济的初步纯化方 2,经法； E是一种水溶性大分子非离子性聚合 P G

描，图 4可知， OD在紫外区的最大吸收由 S3 6

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2

8n处。 5 m参考文献

1 Frd vc . y e n y r d c i i e i r i o ih I Ox g n a d Ox - a i s n Ch m s y a tan d Bi o olgy. N e Y o k:A c d m i Pr s。 1 w r ae c e s 981. 97: 5 68~ 663

2梁

毅。寸信。松生 .湖北化工。 9 5 ( )汪屈 19。 3:

20~ 23

研

究

掇

告

场动

吉林玉米渣条进人香港市场20 0 3年 2月中旬第 3批吉林产的玉米渣条产品办理了进港商检手续。日将进港。这种在不,

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传统食品的基础上经现代工艺技术改造生产的玉米渣条，得香港消费者喜爱。深 这种玉米渣条是 20 0 2年 1 1月 1日才正式上市的新产品。产商是吉林餐桌食品有限责任公司。该产品生 改变了传统玉米渣条保质期短、法复杂、凉水回生、生指标不好控制的缺点。产品口感细腻、爽、吃遇卫滑劲道。持了玉米金黄色泽。去了玉米原有的不良味道。保除

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