蛋白纯化常见问题（精华哦）

蛋白纯化

陈虹亮总结Sunday, November 25, 2007 1

1.我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。

请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。

既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。

2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？ 我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。

不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。

我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。

包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.

层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。

3)Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？ 大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。 4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，

现在我用聚乙二醇修饰它 ，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100％，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉） 他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白选择sephadex G50试试，它的范围在1000-30000，应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，

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可以用这个原理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以试试，你手头的亲和能不能分开，你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。 5)我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。

我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲液提取），总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？

其实这个问题我觉得是这样的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩下的问题你再解决如何提取。 对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个酶用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。

6)HPLC是用来分析检测or分离纯化？ 如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？ 如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？

HPLC既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具. 分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。 7)利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等），请chromatography兄详细点。

反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。

疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.

疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.

8)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教! 这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达

你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试：）

至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的

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浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。

9)我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67kda），用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢

对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择溴化氰，但是这样做的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对于小分子的配基有时候纯化效果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。

环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这样的方法，偶联很简单，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。

10)我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000， 等电点4，目前要去除内毒素有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）

你用过分子筛吗？superdexG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用1MNaOH 1ml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。

如果问题请与我联系。myhok@sina.com，我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时左右,就可以,可以做到<10EU/mg

11)请问HPLC是在蛋白复性后做比较好，还是在HPLC之后再来复性？？？

复性做得不多,柱上的复性更少,但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的变性剂对机器也不好,也可能因为流速慢而结晶堵住管道等,很复杂,虽然有一些这样的例子,但是我觉得真正操作还是麻烦,何况这样做的量也不大.所以还是选择纯化后复性吧.

12)我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么结合缓冲液和洗脱缓冲液好？ 我现在拟的是：

可以用pH 5.0 4.0 3都试试,如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太低的,怕对活性有影响

13)这段在用离子交换柱纯化蛋白，我想问一下，洗脱采用的离子强度的大小范围，应该如何确定，可以根据什么来调整洗脱时的离子强度

一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，怎么确定得配合你的洗脱的峰的电泳结果来确定，最直接的就是你的目标蛋白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐浓度（离子强度）就不用太大，如果出来的很晚或一直没有出来，那就选择更高的盐浓度。

当然你也可以选择用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离效果其实也不错，虽然摸索要麻烦点，但是重现性好，也一样可以做得很纯，而且能很精确知道在多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法

14)你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教。我的蛋白是2KD，在做非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%，出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5υm,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。

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我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。

我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反相你可以查查文献有没有这么检测的。

目前检测protein aggregation的方法主要有四种。

1.gel filtration. 根据专门的mark，可以推断大致的聚合物的分子量，不过实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。

2.native gel. 大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果实在不能让人信服。通常要与其他结果配合说明问题。

3.Dynamic light scattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的条件。但是对于浓度有限制。 4.超高速离心。

文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.

有时也见过1，2联用的，不过仅用于说明次要问题。

15)请教阁下：我想把一种配基连接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水混合溶液中才溶解，似乎看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。

完全没有问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，所以它们本身不会影响到活化后的琼脂糖的，相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不用担心，你的配基稳定的话你可以用0.1MNaOH溶液混合你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。

16)最近我在用sephadexG-75的胶纯化蛋白，总共膨胀了3次新胶（其中第一次是一个批号，后两次是同一个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4度过夜，第二次是按照安玛西亚上的时间90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，没有加BSA，第三次同第一次做法，结果发现，第一次的胶一开始的流速很快，根据说明书上给的线性流速可以达到37cm/h，而且分辨率很高，但后来两次，线性流速最快的时候也只有17cm/h，分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？（我们用的玻璃管都是一样的型号） 这都很正常的处理应没有问题,但是还放在120度高压锅内灭菌不知道行不行,此外你用什么液体处理的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有可能会使结构破坏的,你可以测定一下.如果pH没有问题,那应该说填料本身没有问题.至于流速你的样品会不会比较粘,你柱压高不高, 如果柱压高,那填料变形压缩,那流速自然慢,而且分离效果不好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,因此你还是看看柱床体积有没有变化,如果缩小很明显,那你就重新装柱子.

17)我们用c-18反向柱纯化蛋白，用的流动向是1%三氟乙酸，乙腈，不知道这两种东西，在什么浓度对蛋白有变性作用。

反相一般都是做分析的多,除非你的蛋白很稳定,否则不大适合做纯化,因此在有机溶剂中都有变性的可能,一般10%左右短时间应该没有问题,高了就很难说了,当然这也很蛋白本身关系很大,如果你真的想纯化,那建议还是改C3或C4这样温和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以配合你的活性测定找到一个合适的浓度使你的蛋白活性回首率更好,纯化过程一定要快这样也降低变性的可能.

18)我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50％硫酸铵沉淀，然后上HiTrap desalting脱盐，再过MonoQ

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冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解，可以吗？

环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料，你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，所以不会长菌，不需要抑菌，层析柱灌满20%的乙醇，放在冰箱4度中保存很久都没有问题。

42)查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定，而我的条件没办法测所以需要送到别的地方测。这会造成很大的麻烦，请问chromatography 有没有人做过的，有没有好的方法可以借鉴？另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有没有亲和偶联剂？我一直都没有查到过。

这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力,你完全可以自己合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,效果不错,我觉得你可以用亲和的办法,即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和芳香环有很特异亲和力. 你说的亲和偶联剂是配基还是活化的填料呢.

43)请问，如果所提蛋白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法，但沉淀很难溶解，没法往下作了。有没有更好的方法？谢谢！

那你直接把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好了，你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌情况下缓慢加冷丙酮，避免局部浓度过高，此外沉淀后马上离心，这样也可以避免变性而不溶解。

44)三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.

关于TFE对于a-helix的形成，现在有两种观点。

1。TFE能稳定a-helix的形成，及这个蛋白本来就是a-helix的结构，但是由于dynamic太严重了，或其他的因素，造成表观上看不见。加入TFE能够稳定之，使之表观可见，用CD啊什么可以看得到。 2。TFE能使蛋白变成a-helix。及这个蛋白本来不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之变成a-helix。 具体的原理我就没仔细读了，不过这两方都有一定的文献证明，现在还不知道谁对！ ^_^ 45)我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题想请教:

1 : 我的目的蛋白在强阴离子柱上结合(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),但是似乎结合力很弱(因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始出现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的结合力好像还是很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么?

2: 由于目的蛋白丰度低易失活,而且实验室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品蛋白含量低体积大,我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗出来,我该怎样优化一下?

3:我有亲和胶(red A) ,但是由于经济上的原因不能用特异的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了机器,只能用手工做,这样做梯度很是麻烦)

4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐平衡液下,为什么绝大部分(95%以上)蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么?

1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要降低到5-10mM也许能更好点.

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2.大体积直接上疏水没有问题,既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差,而且这样洗脱的体积小,容易放大.

3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更便宜点,洗脱用盐没有关系,不需要竞争洗脱,何况那样染料很难去干净.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你会找到个合适的浓度,效果一样很好,没有问题.

4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同时还一个缓冲体系,我觉得主要在pH,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧. 1,那你按我提议试试吧,降低缓冲液浓度,提高pH值.

2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,结构也相似. 3,挂不上那也可能,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是多少呢.

4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变化,所以稍迟. 47)你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。

硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。

多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差？

48)有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性,那这样的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶稳定吗.

我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。 49)问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。

50)多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差?

理论上的和实际是有差别，但是不会这么大，你的样品中盐的含量高不高呢，有盐也会挂不住的。 51)我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。 我分别用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，测蛋白浓度还是很低，中间有几个管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有４４１IU／１０ｕｌ，而收集管里的顶多只有２０IU／５０ｕ

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所以，我很怀疑它到底挂在柱子上没有，于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液，发现酶活居然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢，０．０１１Ｍ柠檬酸－氢氧化钠，PH５．５？然后就用的是手工步进式洗脱，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到后来的０．５Ｍ，１Ｍ． 另外，我还想请教您：

阳离子层析柱用完后如何保存？先用１M氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否推荐一下？硫柳汞我这里包装大，２５ｇ，又不能分装，需要避光保存，先谢谢了！

那用更高点的盐洗脱看看，例如2M，如果还是没有下来，那也许是沉淀在柱子上了，可是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不是没有挂住呢。 保存你用20%的乙醇过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，没有必要用硫柳汞

52)问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。

纯化和表达系统有一些关系，但是最重要的还是看蛋白的特性，所以不一定真核就不好纯化，所以我觉得不用担心。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，具体很难说，得看你的目标蛋白而定。 53)你好,我想请教一下,我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的建议呢,谢谢.

要复性你的蛋白浓度就不能高，这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐酸胍了，这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.1mg/ml，具体情况得看你的蛋白，我建议你可以用简单点的稀释复性或者透析试试，如果不是特别复杂的复性最好能用简单的方法，别过柱子。

54)不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，请指教。

另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么意思，谢谢！

所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸碱性的强弱,阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品,否则就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才能解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.否则也挂不住.

55)我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。 这样纯化的蛋白可以免疫动物,没有问题

56)向您请教一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白，目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD，在利用Ni-NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？!!!此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！！！

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也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.

57)我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。

你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.

此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西，会不会是降解或造成这样的结果。你可以加点酶的抑制剂，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。

58)我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？

30％－60％硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分级沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再测一下活性可能就分开了，20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白有损失，最好不要超过１０mg/ml。 59)我的蛋白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的，表达量很高，形成包涵体，为了获得可溶性蛋白，我现在尝试用较低浓度的诱导剂诱导，此前用不同浓度诱导做过对比，电泳后表达量的差异不大；但当我再降低温度诱导后发现，超声处理后的上清液中目的蛋白条带很微弱，大部分目的蛋白还是在沉淀中；这和我降低诱导剂前做的不一样（同温度），为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢？对同一菌种应该是固定的吧？我很迷惑．

另外，请问，一般情况下２８度，３０度诱导时间应该分别多少才合适？我们的光度计出了点问题，无法测定ＯＤ值．谢谢．

还有，你有没有较好的蛋白纯化的文献介绍几篇，好吗？ 60)chromatography 兄，请教一个问题:

选择填料的时候，CM和SP怎么选择？什么时候选择弱阳？什么时候选择强阳？ 再问一个：

我们实验室有两种蛋白，一种等电点5左右，另一种等电点9左右，为什么都可以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液都呈中性）

等电点5的那个我觉得选择阴离子交换柱好些，为什么不这样？

没有什么特别的原则，重要是纯化的效果好就可以，一般都是先选择弱的．

纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以，所以其实在这样的情况下，酸性蛋白是挂在阴离子柱上，而后面的挂不住，但是只要能把它们和杂质分开就可以．所以酸性蛋白流穿，杂质被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．

61)我准备用30％－60％硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？

也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此类

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推，一直到６０％，然后测定沉淀和最后上清的活性，这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系． 62)急问：我的样品蛋白液本来放在４C保存，谁知有人把温度调到了１８C已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所改变吗？某人说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大改变。是这样么？谢谢！

不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是没有多少改变，但是那也看多长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话． 63)我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗？

是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择的粒径是多少范围的，最好要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该没有问题．

64)比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过吗？ 凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的分子从凝胶内部通过.而是在这个范围的分子有分离效果.

65)请教：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。资料上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，可是我没有。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个没有分开的峰，第六个峰分的还算可以。考虑到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，收集后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个吸收峰，可是实验发现，这两个吸收峰没有抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选择的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。｝

你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.

我确实是对每个峰都作了抑菌实验,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个吸收峰,要是我要的组分在后面,可它连个小峰都没有呀.。此外，有人建议我，先使用硅胶柱对粗提物进行处理，请问可供选择的柱子有哪些？谢谢。

那你没有说明G200的峰是不是有活性，你也可以考虑硅胶填料，那得选择c8或者c4的反相硅胶的柱子，可以做HPLC，这样也是不错的选择，毕竟通常的凝胶柱子很难有很好的分离效果。

66)如果我用sephadex G-25脱盐，如何选择缓冲液？因为我认为，如果选择含盐的缓冲液，本身带入了盐，能起到脱盐的效果吗？如果选择含盐的缓冲液， 缓冲液里含有的盐会最后流出来吗？ 另外，分子筛有没有载量的问题？

缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么特别的要求.你的缓冲液当然是没有盐的,否则那何

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必除盐呢.含盐缓冲液当然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.如果你缓冲液中有盐那虽然盐有后出的原理,但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是不一样的.

分子筛其实也有载量的问题,但是关键还是看上样的体积,例如分离上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,具体的数和样品有很大关系.

67)既然这样，我想完全脱盐时，洗脱液可以选择水吗？因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在，对不对？

是的,只要你的样品在水中溶解得很好,而且很稳定,那选择水就可以.

68)请教色谱兄，我现在用纤维素分离纯化蛋白和peg-蛋白，跑完我用page检测了一下，没有完全分开，有一些是一起流出来的，我想知道为什么分离效果不好？我该如何调整阿？加长柱子可行吗？还是要更换介质阿？我用的梯度洗脱。多谢拉！

peg-蛋白要想完全分开是比较困难的,因为PEG修饰的程度不一样,所很难完全分开,不过纤维素分离的效果是要差点,你可以通过延长柱子,降低流速,延长梯度的办法来提高分辨率,不行你可以换琼脂糖系列的,但是我觉得你也可以考虑疏水,这两个方法都可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱,这样有时候分离效果也不比梯度的差.

69)非常感谢色谱兄，琼脂糖的比纤维素的好很多吗？另外，上次你给我了份材料没有价格，能否给份有价格的材料，这样也好和老板谈谈，因为老板控制的挺严，谢谢！！flyhyx@yahoo.com

有的，到时候发给你吧。琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好，载量也大，还有就是柱床体积不会变化，流速高。

70)想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离（制备规模），且不使用plasmidselect之类亲和介质。

亲和是最有效的方法，我们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以看看。

71)我所纯化的蛋白质大概是66kDalton，进行的亲和纯化。现在出现几个问题想请教：

1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带，现在50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。

2。因为亲和纯化后我的蛋白在最上面，所以我现在用sephadex G－100，但是我发现效果很差，不仅回收率低，而且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带，而且我想把我的蛋白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料不对，而且对于流速和柱子长度要求就很严格了。

有可能你的载量下降了，所以才那样，你需要清洗了。

我觉得你最好选择新的填料，其实你要是条件好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把我们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。

72)1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？

2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？

那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白. ACN 中含有1％的TFE。

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有可能是蛋白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？ 不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净

column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。 不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。

我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.我想柱子应该没有问题.方法也没有错.

73)想请教细胞外基质中的蛋白怎样抽提。

这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧. 74)请问聚乙二醇的检测波长是多少？

聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.

75)怎么有效的去除蛋白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的方法？

你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除. 用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？ 丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除. 76)那么，mPEG-maleimide的检测波长是多少？

maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.

77)我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？

我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.

78)你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌表达，我想请教一下其纯化方法。

那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.

79)有没有比较好的国产疏水层析填料，当然是做蛋白的？

国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.

80)我的课题涉及多次不同蛋白质的纯化，我现有国外的一个protocol可以参考，但国内实验室的条件有

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限，担心如果任意更改纯化方法，结果不理想时又不好分析原因。十分地苦恼，想听听您的建议，不胜感激！

我纯化的第一个蛋白质，是由稀释复性而得的三个亚基组成的复合物，这里纯化的目的主要是脱盐更换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化过程)。我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml，下一步准备用透析脱盐及超滤浓缩，但对于超滤离心管的选择还无头绪（条件有限不可能添置大型超滤设备）,上网查也不得要领，如果您有相关资料，能不能发到我的邮箱？junewu@sohu.com. 关于浓缩的方法，冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何优劣？冷冻抽干法和硫酸胺沉淀法会不会破坏蛋白的活性？蔗糖会不会影响后续的超滤?

我纯化的第二个蛋白质，是经过酶催化的该复合物（110KD），这里纯化的目的主要是去除体系中未组成复合物的单个亚基（36KD、13KD、1KD）及36KD亚基的aggregate，国外的protocol推荐用凝胶层析，但我询问做过的人说分离的效果并不理想（原因不清），我是应该优化凝胶层析的步骤还是应该选用其它的层析方法？没有蠕动泵和收集器（只有层析柱和低温冰箱）能不能做凝胶层析?如果能做如何尽量提高其分离效果？选择层析柱和填料有哪些原则和注意事项?

Native-PAGE时，样品的盐离子浓度和样品内的其它蛋白质会不会影响电泳结果呈阴性？Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否仅仅在于： 凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS；样品中不加DTT或β-巯基乙醇，不经100℃煮沸处理；电泳时保持较低的温度(4℃)？

问题多多，实在是因为本人是初次涉及蛋白质纯化领域的门外汉，除了您推荐过的书，您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操作手册（您如果有买了产品才能获得的，能否也EMAIL惠赠？）谢谢！！！ 1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以,这样体积不会变大,同时透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩,很方便,超滤包括离心管都不便宜,而且样品不多怕损失多,所以我觉得还是用简单的方法好.

至于浓缩,有条件那用冷冻干燥,超滤都是不错的,硫酸铵沉淀不能当作浓缩的手段,因为它需要蛋白到一定的浓度,而且浓缩后的样品要除盐,回收率也不高,透析袋+PEG浓缩我觉得也是不错的方法,特别适合没有超滤和冷冻干燥的实验室,而且成本低,适合小量不适合大量,蔗糖浓缩我们用过,应该不好用.冷冻干燥和硫酸铵沉淀一般蛋白都不会失活的.蔗糖一般不影响超滤,只是粘度增加,这样超滤会慢的.

2.既然文献是用凝胶过滤,你也用完全没有问题,我觉得分离这些分子量差别比较大的,那凝胶过滤是不错的选择,只要选择好合适的填料,装好柱子就可以,层析的基本条件还是要的,包括泵,检测器,记录仪,要不很难知道收集也不方便操作.填料的选择主要看你的目标蛋白和杂质分子量的差别,例如你的110KD和那些36KD以下的,那你可以这样选择sephadex G 75,你的这些36KD以下都在它3000-80000之内,而你的110KD在外水体积直接就出来,后面的都是小分子的,当然也可以选择Superdex 75,它的分离范围在70000-3000,只是它们价格不同,后面的填料刚性更好流速快,前面的便宜,流速慢些,这些就看你的经费了. 3.电泳别的蛋白不应该影响,但是盐是有影响的,所以样品要除盐,可以用凝胶过滤,透析,超滤除盐.保持底温也许是为了保持蛋白的活性,做小量制备.

4.http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html

这个网站有不少相关的材料,相信很有帮助,此外我可以把我们全部的材料发给你,希望对你有所帮助. 81)如果分离50KD,36KD,13KD这三种蛋白质，最好选用那种凝胶层析用填料？如何确定需用的层析柱的直径和高度？

2.如果实在没有泵，上样时应注意些什么？没有检测器和记录仪，最短的收集间隔时间是多长？ 选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.

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2没有泵那我觉得凝胶过滤很难收集样品,除非你用自动分部收集器按一定的体积去收集,然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度,这样再根据每管的蛋白浓度做个色谱图,按峰型把各管合并,上样注意要沿柱子的四周缓慢加,最好先把下面出口封闭,让液体不流动,上完样品后再打开下口,这样可以保证上样比较均匀,当胶平面没有液体的时候再用你的平衡液体按上样的方法加就可以,然后再打开下口,千万别让液体流干,也不能把胶平面冲坏.收集的时候可以按5m或者10ml一管,时间是根据你柱子的流速. 82)请问那里有关于免疫组化Ｓ－Ｐ法具体操作步骤的资料？

SP免疫组化法，全称链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法。你购买的哪家试剂盒都有很详细的方法,或者你上一些提供试剂盒的公司网站联系他们都可以得到详细的材料. 下面的文献你可以看看.

http://www.nhhn.gd.cn/ylkj/zl/z6.htm 83)师兄你好，

我有一个问题想请教，在以前的贴子中没有看到。我要做抗体的真核表达，为分泌表达，表达出来的蛋白没有标签，因为希望尽可能保持抗体的结构，因此不能用那些针对组氨酸等标签的的柱子，我的抗体是个融合蛋白，大约是IgG的三分之二大小，是sCFv和CH3连接而成二硫键连接的双链，没有CH2区，我看proteinA和proteinG柱子都是要结合FC，那我的蛋白FC不完全的话还能用吗？要不我怎么办啊？还有，对于没有标签的抗体是不是无法和细胞培养使用的小牛血清中存在的抗体样物质分开呀？是不是必须要无血请培养。我简直不知道该怎么设计实验啦。谢谢。

你好，我看的书上说CH3是FC受体的结合区，而C H2是补体结合区，这说明蛋白A和蛋白G应该是和CH3结合的，你可以表达出来用蛋白A或G的试试，此外抗体有很好的疏水性，用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片段，包括单链抗体，至于血清中的抗体，它们和亲和柱子以及疏水等的微小差别通过改变洗脱条件得到纯化，当然你可以用无抗体的血清培养或无血清培养，我觉得你还是选表达出来再说了，而血清中的白蛋白很容易用染料亲和的方法就可以去除。

84)chromatography,您好！我现在用的Ni-NTA进行亲和纯化一个约45KD的蛋白，关于菌体的破碎，有人推荐用溶菌酶，有人说超声波，我用溶菌酶试过一次，但12000*20min离心后，上清中没有目的蛋白，你能不能将相关的材料也发给我一份

用超声破碎的比较多,如果你有设备的话这样破碎比较好,因为时间短,破碎效果也好,而溶菌酶不完全,而且不大好操作,我不怎么做上游,不很清楚,你可以再仔细问问别人有关破碎的问题,纯化的材料我给你发一份,希望对你有所帮助.

85)如果裂解液中加了一些蛋白酶抑制剂，纯化时要不要考虑尽可能最后去掉这些蛋白酶抑制剂？ 一般添加的都是小分子的物质,而且也不会和目标蛋白结合,纯化过程一般就去除了,所以不用特别考虑去除的问题.

86)选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.

1,我们实验室没有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的产品，如何判断还能不能用？网上可以找到这两种填料的说明书吗?

2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法。其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径*30，但这个柱直径 的计算公式我没看明白，用不上；其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样

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量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)

3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?

1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能保证有很好的分离效果,说明书我想不好找，但是它和所有的sephadex处理是一样的。

2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，通常上样量是柱床体积的5%左右应该，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml样，1.6x60cm的足够了。 3。一般稀释至少在2以上。

87)还有个小问题，是不是G后面的数字越大，就刚性越差，越容易受外因素影响？ 是的,G后面的数字越大，就刚性越差，越不耐压和盐溶液。

88) 我表达的是带有GST的融合蛋白，醇化后需用凝血酶切割，我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?

是一样的，但是用于酶切的要求的纯度更高。

89)在做WB，因为是血清标本，含有较多的白蛋白，可能影响我的实验结果。我请问过ptglab楼主，他推荐我来这儿问一问。请问高手有什么方法吗？哪一种比较简单经济？蓝色琼脂糖凝胶可以分离吗？ 用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除，我觉得很快也很特异，样品直接穿过柱子白蛋白就可以去掉90%以上，你pM你的邮件地址给我，我给你一份相关的材料，我们这里就有这个填料。

90)凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析上样时，对样品目的蛋白浓度的要求是不是一样的？样品浓度一般要求在多大范围内？

凝胶过滤处理样品量主要是受体积的影响大，浓度相对要小一些，上样量在床体积5%左右，如果是除盐可以上到20%左右。

其他的主要是上样的浓度，一般就在5-10mg/ml填料，具体的情况得看填料的载量和使用说明。 91)我问的意思 是在纯化过程中，如果蛋白酶抑制剂去掉了，而该蛋白酶还未去掉，我担心此蛋白酶还会消化我的目的蛋白，请问我说得有没有道理？有没有必要考虑？

你可以用抗体做WB检测你的纯化的蛋白，如果确实有酶解的现象，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些抑制剂，然后再做对比，我觉得你考虑得很周到，这个也是值得注意的问题，但是纯化的过程时间不长，一般没有必要这么做，但是有的蛋白有降解的现象，那就加试试。

92)离子交换层析、亲和层析上样时样品的蛋白浓度可以达到5-10mg/ml？我觉得浓度是不是太大？ 抱歉，没有说清楚，我的意思是填料的载量大多在这个范围，所以上样的多少由填料对你的目标蛋白的载量有关，也和填料的性质有关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么关系，因为其中真正你的目标蛋白不一定很高，所以其实这样的浓度也没有关系，具体的量和浓度还是要经过实验才知道。

93)破碎菌体,加pBS缓冲液,目标蛋白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的蛋白是包涵体。

那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包涵体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是溶解不了你的目标蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。

94)你好，我最近做纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow做初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在冰箱里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪现象，整个胶变成了絮状， 沉

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不实，我一看，旧胶里面是有很多絮状物（不是其它东西，也是胶）漂在上面，下面沉淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时分层了，絮状物在上面，下面是胶，我于是除去了上面的东西，把下面的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC

处理了三次，完了，又变回当初的絮状态了，象稳定的絮状胶体一样，真不知到底怎么回事（也就是说加盐它就能沉，加水就絮状胶体），我的胶是不是不能用了？

另外，我做亲和，目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉，我的蛋白是4聚体，是不是做SDS－page将它 解离了？我打算做native看看，但是高效液相结果显示很纯的，只是主峰后面有个类似拖尾的小峰，不知道是不是没有分离开，想请你帮我指点一二，另外能不能介绍下亲和方面的资料，非常感谢 你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.

亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析.

95)chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗? 我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?

亲和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.

这样的砂心漏斗试剂公司就有，不贵，一套也就300来元，没有抽滤还没有别的好代替了，也可以用中间夹膜的漏斗。

至于你说的两条带，那按理你用底物类似物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢，你平衡用什么条件，洗脱呢，你用什么活化的填料，我觉得非特异吸附的情况是存在的，你可以改变洗脱的方式，通常这些非特异吸附是离子交换作用，你可以可以在平衡液里增加点盐，这样可以去除这样的吸附，此外你目标蛋白会不会降解，这样有小分子还一样被吸附，你可以通过抗体做WB看看，如果是这样，那只能在纯化过程中加一些酶的抑制剂来避免。 我能想到的就是这两种情况了。

我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基，采用pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液平衡，洗脱是等PH条件下进行的，只不过改变了洗脱剂的浓度，从最大浓度洗脱的结果看，往往就少了其中一条带，你的解释我会认真思考的，亲和中存在离子吸附，是不是目标蛋白和杂蛋白的等电点很接近造成的？平衡液中加点盐，主要起什么作用？一般加多少？使用什么盐好那？如果是我的蛋白解离，这样的杂蛋白有没有什么别的方法洗掉（除了加酶的抑制剂）？

你其实还是没有说清楚你活化的方法，看你的意思好象是环氧活化的方法，不知道你是怎么偶联的，如果你觉得是秘密，那也没有关系，只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附，总之要是氨基和羧基缩合的方法，难免有离子交换作用，溴化氰也是这样的，而如果是环氧活化的方法，那么就没有离子交换的非特异吸附，至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了，如果是因为降解，那也许用这样亲和的方法就得把条件摸更细致点，如果不行，那可以看凝胶过滤能不能分开，即使不是降解，你也可以考虑凝胶过滤，而从你反映的情况好象杂质是个酶，加点抑制剂看看吧。

真的谢谢你无私帮助，我来到这个公司之前，他们就 已经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化

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的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基』，我也不知道为什么，和经典的环氧等方法不一样，我们偶联剂用的是10个C，培基是带氨基的，硼氢化钠应该是还原剂的，基质是sepharose cl－6B，具体对这方面我不是很了解。我想最近作个native，和SDS对照一下，看看是不是降解，此外，这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。

我就把胶放在柱子里，加上碱洗了三次，上面的水直接吸走，然后水洗，在加浓盐洗了两次，上面就漂浮着一层悬浮物，我小心再把它从上面吸走，之后在水里面好像就很好了，显微镜下我仔细看，与新胶没什么区别，谢谢你的帮助哦，我只是没有砂心漏斗，没法子试试而已。活化的方法是什么？我自己都不清楚

96)1、我们用CM52大量纯化某蛋白，经常会碰到介质裂缝，不知什么原因？

2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗？如果为5/7会对分离有很大影响吗？用PB或ABS平衡时你们一般用多少柱床体积？

3、我们用5KD超滤浓缩后蛋白的损失很大，能否帮忙分析一下原因（PALL 的超滤器）？

那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.

2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也都是这样的就可以，没有刻意要求，5/7应该影响也不大，当然如果你走线形梯度洗脱，也适当把这个比值增加点，如果走阶段洗脱就没有关系。

3。超滤膜本身的面积不小，这样也会吸附蛋白，特别是处理的量比较小的情况损失会很明显，如果量大，那损失会小的，此外如果蛋白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要特别小心，因为失活会很明显的。

97)我做的是原核表达蛋白质，目的蛋白是一个GST-融合蛋白，现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，正在做纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该只有目的条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条，但目的条带却不见了， 1.为什么目的条带不见了？ 2、下一步应该怎么办呢？

如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，缩短作用时间，在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是

triton-100干扰结合，所以不能用，你用吐温也试试看，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的蛋白有降解现象，你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白，总之修改的方案就是我说的这几个，摸索一下吧。

此外可以选择作用力更弱点的填料。这样特意性更好。

98)手头有碱性磷酸酶的资料吗？能否告诉我它的详细结构 我想提纯 谢谢拉

最好还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间,大概80K（四聚体）、32KD（二聚体）,它耐高温80度仍然保持活性（在有镁离子存在的情况下）,最适PH8.0 我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱

蛋白没有什么详细的结构吧，至于纯化它既然是碱性的蛋白，那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂蛋白就沉淀了被去除，再上离子交换就应该有不错

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的效果。

填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。

99)前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。 你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。

100)用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积？10X够了吗？ 一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要平衡体积大点也，10X足够了

101)有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又怎样做呢，谢谢赐教。

我知道，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难做到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。

HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后提高浓度洗脱，详细的条件和你做反相纯化是一样的，只是HPLC的分离效果更好。 102)请问怎样可以查到protein的PI值？，多谢了先！

已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的. 103) 谢了chromatography兄，也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。 是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度. 104)chromatography兄:

非常感谢回复，我手里也有一个GST融合表达的项目，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。 目的蛋白是12KD左右，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12KD）经尿素溶解，透析后，PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条件酶切时,也有发混，但目的蛋白有14KD左右，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题？ 另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn

别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何. 至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:

http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins 105)我想用DEAE纤维素来做填料

我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢？

DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢. 106)我想请问一下您在装柱（尤其是分子筛柱子）是否是按照填料的说明正向装呢，还是反向装？ 我两种方法都试过的，但是只有一次是正向装完后，检测效价为30，000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外，还有没有其他要注意的。最好能给我一个Protocol。谢谢！ 另外，还有一个问题，我有一个90kD的融合蛋白（连GST），用GST的亲和柱纯化后总是有50多kD

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和20左右的杂蛋白。我用Sephacryl－S100能去掉它们吗？或者您可以给我一个更好的建议

1，我不明白，当然是正向装了，反向怎么装呢，其实装柱子只要均匀就可以，我几乎没测定过柱效，也没有Protocol，因为一般装的都没有问题，只要注意你说的几个问题就可以。

2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢，你可以优化你纯化的条件，在平衡液体中提高盐的浓度，这样可以降低非特异吸附，这样再做做看，此外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么结果，我觉得你先优化完如果没有纯化好，再用凝胶过滤吧，你可以选择sephadex G75或者是Superdex G-75，这样你的目标蛋白在外水体积中出来，后面的杂质在内水体积中，这样效果会更好点，如果用前面的S100不会比后面的两个填料效果好的。 107)

108)chromatography 大哥

我做的是碱性磷酸酶,大约32KD,我现在只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,（比如材料的选择原则、洗脱液的选择、操作等方面）

这个蛋白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子交换的柱子,这样纯化不知道能到多少纯度,此外可以用亲和的办法,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,例如对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是比较好的方法.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,此外把我见到亲和的文献发给你一篇

chromatography 大哥, 谢谢你拉, 资料我收到了, 我先看看还有问题在找你帮忙了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶, 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化 是什么格式的我这解压缩后打不开了 文件是zip格式的,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的. 109) chromatography 辛苦

我想纯化碱性蛋白酶, 具体方法设计如下: 65%硫酸胺沉淀,透析袋.

但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,不知道还有什么好的方法浓缩. 下一步纯化方法DEAE50, G200两种填料 不知道注意什么?谢谢

别客气,我不太清楚你说的但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,是什么意思,是损失严重吗,按理透析不应该有太大损失的,你可以用缓冲液把透析袋里面洗几次,这样能降低你的损失.其实上离子交换,不需要浓缩,直接上就可以了.DEAE50好象没有写全,是.DEAE50和G200其中.DEAE50DEAE-sephadex A50吗,G200也是sephadex G-200吧,它们随盐浓度压力,PH值体积都有比较大的变化用的时候要小心,小心流速,有不也许会堵柱子.别的很笼统,还是看看相关的书吧,也就是离子交换和凝胶过滤的问题,很难在这里几句话说得清楚.我觉得你该用DEAE琼脂糖凝胶,这样体积不随环境变化,流速也快,分离效果好.你的酶分子量是多少,G200分离范围很宽,不知道为什么选择这个,如果非用这样的范围,那可以选择sephacryl S-200代替,同样是流速快,好操作.

此外这个酶是丝氨酸蛋白酶类的吗,有没有抑制剂,类似底物,辅酶等,这样你可以考虑用亲和的方法去做. 110)his融合蛋白纯化后含有咪唑，怎样去除？是不是要用透析？我纯化后的体积比较小，约有100微升，怎样做透析？谢谢！

这么点,那用1ml预装柱脱盐应该可以,也可以有超滤离心管做,不知道你要做什么用,如果咪唑不影响就不用去了不可以吗.

111)chromatography好！我对你和cccDNA讨论的问题很感兴趣。我的蛋白只有部分可溶，大部分表达后为包涵体，是否我用你们所说的助溶剂溶解我表达的蛋白，之后去超声就可以提高蛋白的溶解度呢？

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抱歉,讨论的太多,不清楚你指的是哪个帖子,你直接用8M尿素或者6M盐酸胍溶解吧,可以的话不需要加别的物质,一般说来盐酸胍溶解包涵体比尿素的好,此外如果你蛋白真的不好溶解,那就可以加triton 100,脱氧胆酸钠等去溶解,判断溶解的好坏最简单就是看电泳,如果溶解后的样品沉淀的部分还有很多你的目的蛋白,那说明溶解不好,反之就说明很好,不溶解的部分就可以不管了.超声可以增加溶解，但是不能用太强的超声处理，一般用清洗用的超声就可以，别用破碎用的。否则也许会使蛋白断裂。

112)请教chromatography兄，刚开始分离粗蛋白时一般用什么介质比较好，有人推荐用离子交换，具体应选择什么样的填料？比如提真菌蛋白

我觉得疏水也可以，真菌蛋白也是很大的一类，不清楚具体什么特性，你得对目标蛋白很了解才好选择，如果是未知的只能试阴阳离子柱，也可以用疏水，同时至少要建立检测的方法，否则很难判断纯化的效果。

113)最近我发现PMSF在一定程度上可以抑制我的蛋白的降解。

所以我想通过提前收获菌体上清（尽量减少杂蛋白比例），然后加入PMSF过疏水层析来纯化，用的是10%的硫酸铵来上样，但是，发现我的蛋白吸附不到柱子上了！！！是因为加了PMSF的原因吗（用异丙醇溶解的）？

还有，上次做的疏水蛋白好像吸附特别牢固，您建议加入多大浓度的甘油来洗脱来着？ 还有就是离子交换过程可不可以在缓冲液里面加入甘油？好像有人说甘油有稳定蛋白的作用。 异丙醇可以降低疏水性,所以挂不上主要是这个原因,其实溶解可以用乙醇,这样你上柱子的时候就得相应加大硫酸铵的浓度,吸附牢固,洗脱可乙醇,甘油太粘,压力大,加到5%就足够.

甘油是有稳定蛋白的作用,但是浓度太低不一定管用,你试试吧,直接用PMSF不就可以了 chromatography 兄是指在洗脱缓冲液里面添加5％的乙醇吗？

乙醇不能降低蛋白的疏水性吗？还是能够降低蛋白的疏水性，但是没有异丙醇那么厉害？ 是的,是降低环境的疏水性,也就降低了蛋白和填料的相互作用.所以异丙醇也是这个道理

114)我在原核表达了一个融合6his的蛋白,融合蛋白约15kd,表达量很大,但是用Ni琼脂糖纯化的时候发现蛋白不挂柱子,几乎全部都在穿透液里,重复了几次都是这样.

具体流程我是按照分子克隆的方法,用融菌酶破菌,然后加Triton100,DNase,RNase,离心,上清过滤后上. 你的柱子有没有变颜色呢，你把你的样品透析一下再上样看看，你的样品要用平衡缓冲液稀释，保证上样的环境和柱子平衡后的一样，上样的浓度要稀一些，流速要慢一些，这样保证吸附更好一点，此外在你的样品中直接加10mM咪唑，这样上样可以避免一些量很大的杂蛋白于填料吸附而使目标蛋白挂不住，此外你多大的柱子，上多少样品，你最好能把你的操作写清楚一些，这样好分析原因。

115)请问一下，GST融合蛋白一般是在柱上就切掉还是纯化后再切掉？如果是纯化后再切，那么切下的GST片断要不要除去？如果用凝血酶切，凝血酶要不要除去？

有在柱子上切的，也有纯化后切的，切下的片段可以用原来的亲和填料去除，凝血酶也需要去除的，你可以看下面的一些材料吧： Purification Protocols

我的柱子几乎没有变颜色,从开始一直到咪唑洗脱完,一直是蓝的.

我是按照分子克隆所写的,每100毫升菌离心后加4毫升平衡buffer,每次样品大概是20mL,请问这样是不是不够?我没有买柱子,只有填料,每次使用2毫升的Ni-琼脂糖,以一个10mL的注射器和滤纸代替的柱子,不知这样是否可行? 所以由于怀疑结合不够,所以也试过把填料平衡后直接加到样品中,4度孵育过夜,还是依旧....

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别客气，你透析一下样品再上吧，我觉得你也可以把你的样品再用平衡缓冲液稀释一倍，这样再上一下看看，怀疑是你样品的问题用注射器加滤纸也可以，但是滤纸很容易破，而且掉纤维，反正这样做也没有关系，你再试试吧，此外你的填料最好是重新鏊合过镍的，一个一个因素排除吧。 我的填料是新买的已鏊合的琼脂糖，不过是国产的。

问有没有可能是蛋白结构导致his被包裹，从而无法亲和？呵呵，乱猜的。另外，请问，Ni柱上样后是应该变颜色吗？

上样不会变色的，变成棕色就不能用了，我觉得你还是看看你样品有没有问题。此外你说的那样情况也许有，但是很少见，如果可能的话，你把它换到另一端看看。 116)以前请教过你的一个问题想再请你帮忙：

我做的是原核表达GST-融合蛋白，分子量46.9KD，通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，可溶，正在做纯化，但是过柱纯化后有杂带，现在我按你的建议多洗了几个床体积，杂带少了，但还是有，我用的是Glutathione Sepharose 4B的柱子，pharmacia公司的，就是那种小的已经做好的一次性的小柱子，它不用我调整流速和作用时间，填料也不用我自己弄的。 请问：

1.这种柱子有什么缺点吗？

2.我要蛋白的目的是免疫兔子取抗体，多抗和单抗各需要的蛋白量约多少，纯度要很高吗？ 3.如果纯化不理想，能否多次SDS-PAGE电泳后切胶直接免疫？

1.柱子没有什么缺点，硬找的话，那也只是上样量小点，流速慢些，我们也生产这样的柱子，很好用，节省不少时间。

2，蛋白的量估计有10mg就可够了，你可以问免疫版的看对不对。 3可以直接切胶，纯度在95%左右就可以了。

117)我是学分子生物的，最近我们要用噬菌体展示技术找一个膜蛋白分子交互作用蛋白，因为噬菌体展示技术最基本、最关键的一步就是要纯化蛋白，但是完整膜蛋白纯化好象比较困难，而且表达的蛋白质形成了包涵体，另外它有三个二硫键，纯化过程中破坏包涵体的同时，可能又很难保证蛋白的活性，不知你有没有好的方法或经验可以告知。谢谢

这个我就不清楚了,膜蛋白本身就不好溶解,需要用表面活性剂,如果是包涵体那需要复性,有三个二硫键,你可以参考有二硫键包涵体复性的方法去做.

118)我是搞活性多糖及糖蛋白研究的，分离纯化方面是新手，我打算订一些填料（分子筛和离子交换）用来制备多糖和糖蛋白，由于填料种类太多，不知我该如何选择？请楼主推荐几种常用的填料组合，谢谢！

糖蛋白的纯化其实可以充分利用它们的特点可以用疏水,亲和(凝集素,硼酸类)这些方法去纯化,离子交换和凝胶过滤填料的选择得按你的分子量和等电点,你没有太具体的差数很难说,因为的确品种比较多. 119)我想从蛋白粗提物中分离的40KD以下的蛋白质做进一步的实验，蛋白质的具体性质不知道，应该选用什么样的分离纯化方法呢。谢谢。

那你看有没有截留分子量在50KD以上的膜,超滤到你要的的蛋白,,这样进一步用离子交换或者凝胶过滤去纯化,如果你的蛋白有一些特殊性质也可以用亲和或者疏水.

120)请教chromatography兄，我用Amersham 的Hitrap chelating 1ml 小柱来纯化带His-tag的蛋白，自己感觉洗脱峰还是蛮漂亮的，但是洗脱物跑出来的电泳很模糊，请问是什么原因啊？

色谱图漂亮也不一定电泳图就漂亮,模糊是不是你的蛋白浓度太低,有没有盐呢,如果是这样的话,那电泳图不会好看的,你把样品透析浓缩,再跑电泳看看.

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121)楼主请问一下在做疏水层析的一些问题. 1.疏水的blinding buffer中一般要加那些试剂.

2.离子对试剂常用的有那些,在做疏水层析时是否应加这些试剂. 3.一般根据怎样的规则来选这些试剂和疏水填料

还有离子排组色谱的填料有那些呀,他的分离的机制又是怎样呢?

1.疏水通常情况下不需要添加什么物质,就是高浓度的硫酸铵,氯化钠等盐,离子对是适合做反相用,蛋白纯化中不加这些物质.常用的我就知道三氟乙酸别我也不清楚.

2.疏水的填料我们选择一般就用苯基的,别的不怎么用,一般用苯基足够了,实在不行再换别的.

3好象没有离子排组色谱,应该是凝胶过滤色谱吧,分离原理很简单,那就是因为凝胶是多孔的,所以小分子能进入更小的孔,而大分子进不去,因此小分子流经的路径大于大分子的,选择的填料最常用的也就是葡聚糖凝胶,葡聚糖混合琼脂糖凝胶,还有烯丙基接枝葡聚糖凝胶,代表的产品有sephadex系列,superdex系列,sephacryl系列,具体的填料结构和规格可以参考<生物工程下游技术>

122)我纯化的蛋白等电点预测为8.04左右,我用ph6.5的１０mM磷酸钠，１mM ＥＤＴＡ的缓冲液，柱的填料为ＣＭ－钎维素，上样后我用缓冲液洗柱以去掉没有结合的蛋白，不幸的是目的蛋白也被洗了下来，接下来的梯度洗脱根本就无用．请帮我看看是哪儿除了问提！

把缓冲液pH调低点，到5左右，样品要的盐浓度和pH都不能高于你平衡缓冲液的浓度。

123)请问sephadex G-25和QAE-sephadex A-25使用,再生的方法. 我要分离分子量700左右的物质,使用那种填料啊(用于工业化生产)

都可以用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用50%乙醇洗,然后保存在20%的乙醇中. 700左右的物质是什么东西,也许只能用RP-HPLC了

124)我的蛋白，从包涵体中纯化，用SKL溶解复性后上Sephadex G－100柱没问题，用PEG20000浓缩后再上DEAE－Sephadex A－50后不论用多大的NaCl浓度都挂在顶上下不来。都是在10度以下过的柱子，温度和缓冲系统都不成问题，是什么原因呢？吐血ing～～～～

也许是没有复性好,总之我怀疑是沉淀在柱子上了,你用变性剂洗试试.或者是你蛋白不稳定,沉淀在柱子上,所以洗不下来.

我的蛋白的确很不稳定，但是在这样的温度和操作强度下应该不是沉淀变性。另外，我是用SKL溶解包涵体后透析除SKL复性，用非变性PAGE检验过的，如果再用变性剂洗涤的话前面的工作不是白做了吗？

我尝试把柱子顶上的粘着蛋白的珠子再用SKL处理，丙酮沉淀后SDS－PAGE发现目的蛋白就在里面，真郁闷呢……

所以这说明你蛋白溶解性不好,你复性后的缓冲液应该和你上离子交换的一样,这样才不会沉淀,此外你可以用离子交换的缓冲液去稀释你的样品再上样,避免因为缓冲液不同而沉淀,此外你的蛋白是不是疏水性比较强,加点甘油或乙醇看能不能增加溶解性,此外要注意pH,这些原因都会影响你蛋白的溶解性.

125)用离子交换分离蛋白质或多糖以往多用弱的离子交换树脂，现在出现了许多强离子交换树脂，如Q Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow，资料上介绍这些埴料性能较好。请问楼主，是否我买了Q Sepharose Fast Flow一般就不用买DEAE Sepharose等弱阴离子填料？谢谢。 我觉得Q可以部分代替DEAE.

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126)求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？望赐教! 这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达

你好，我做复性不多，你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子伴侣，你可以多看看再尝试.

至于纯化，如果你的蛋白有游离的巯基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。 请问什么是分级沉淀包涵体？ 参考这个帖子吧:

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=961391&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#961391

127)我的蛋白是水溶性蛋白，还有整个操作过程所用的缓冲液都一样。根据氨基酸来看等电点大概4，我的缓冲液PH为8。包涵体溶解液大概10ml吧，稀释成100ml透析去除SKL，然后PEG20000浓缩回10ml，取一半上Sephadex G－100，峰形很漂亮，SDS－PAGE检测去除了部分杂蛋白，收集峰再用PEG20000浓缩成5ml，上DEAE－Sephadex A－50，上样后可以看到柱顶部挂着蛋白，但是NaCl浓度从0.05M上升到0.8M只洗脱了杂蛋白，后来我怕是NaCl浓度不够又加到1.5M，还是不行。 那你就把缓冲液pH调到6-7,然后再做纯化试试.我还是觉得因为沉淀所以洗不下来.

128)我是搞药剂的，想请教一个问题，我将分子量458.5的药物包裹在平均粒径约100nm（粒径范围50-400nm，材料为单硬脂酸甘油酯，分子量358.6，采用药剂学方法聚合成载药纳米粒，聚合后分子量我也不知道，只知道粒径）的纳米粒中，现想将游离药物和载药纳米粒分离，请问应该选用何种规格型号的Sephadex填料？文献有用Sephadex-G50的，我有Sephadex-G15，不知可否？谢谢！

我原来也是学药的,根据你的说法那你的颗粒是比较大的,其实最简单的方法就可以用超滤这样处理量也大,快,便于放大,如果是少量用透析也可以,没有必要跑色谱,如果你想用,那Sephadex-G15不行,因为你的纳米粒过不去柱子,会聚集在柱子上面或中间,G50也也这些危险,你可以选择4-6%的琼脂糖凝胶,病毒颗粒等都可以穿过,这个填料更合适.

129)蛋白质去盐究竟是过柱好还是透析好？是否与柱子的质量有关系呢？

都可以,看你手头有什么材料了,过柱子会稀释样品,透析稀释得少些,透析后还可以用peg浓缩,你喜欢用什么都可以.过柱子快.

130)我的目的蛋白PI9.0，用弱阳离子交换层析（CM52）分离，请问平衡缓冲液（PH3.75）与上样液（PH4.0）这样大的PH差距会影响目的蛋白与介质的结合吗？ 不会影响,但是为还是一致这样好一些.

131)请问chromatography ：我提纯的包涵体蛋白在经含不同浓度尿素的PBS中透析时析出来了，有什

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么办法可以复溶吗？我要用此蛋白去打动物。另外我的蛋白是用8M尿素裂解后用镍柱纯化的，洗涤液用的是含20ｍＭ咪唑，洗脱液用的是含250ｍＭ咪唑，但是纯化后跑SDS－PAGE发现，在洗涤液最后一管中己有我的目的蛋白，没有杂带，但在洗脱的第一管中就开始在紧邻我的目的蛋白的上方出现一条杂带，并随着我的目的蛋白洗脱浓度的降低而降低，后来我试用的增大洗涤液中咪唑浓度到40ｍＭ，结果还是一样，不知是什么原因，请问有更好的方法用镍柱纯化包涵体蛋白吗？如果我想纯化后不用透析就去打动物，有何方法呢？请多指教！谢谢！

1.如果要溶解还得用变性剂,这样变性条件下可以免疫动物,不需要除去. 2.你可以用你的抗体做WB看看是不是你的样品变成了聚合体. 3.镍柱纯化包涵体有专门的总结的帖子,你可以参考一下.

4免疫动物的问题你可以发到免疫版或者直接搜索就能找到相关的材料.

132)请问怎样在不引入其他杂质的情况下从阳离子交换层析（CM）纯化的蛋白中除掉核酸？谢谢！ 加到2M硫酸铵,上苯基琼脂糖凝胶,核酸被吸附.蛋白不一定能被挂柱,阳离子柱子通常不吸附核酸的,你蛋白能被阳离子吸附,而核酸不能,这样不就可以了.所以最简单的是使核酸和你的蛋白带相反的电荷,这样用阴柱或者阳柱都可以达到你的目的.

133)我做的原核表达GST-融合蛋白，用的是Glutathione Sepharose 4B的一次性小柱子，pharmacia公司的，经过反复试验，现在已经纯化出来了，期间曾得到你的指点，再次表示感谢！

现在我要开始大量提纯蛋白了，为了节省时间，我想问一下有没有类似Glutathione Sepharose 4B的用于大量提纯蛋白的进口柱子，就是说不用自己配填料的，直接用的这种柱子？若有何处可买到？ 你需要多大的柱子呢,进口的好象只有5ml的预装柱,大的要自己装填,其实自己装是一样的,没有什么差别,我发了一些材料给你了,你可以考虑用国产的.

134)我最近买了一个Amersham的中空纤维浓缩换液柱，柱子的说明书上说能承受的最大压力为15psig, 不知道psig和MPa之间怎么换算啊？15psig相当于多少MPa呢？ 多谢！！

1磅力/英寸2（psi）=6.895千帕（kPa）,所以15psi=103.425kPa=0.10MPa吧,你可以再问问他们的工程师吧,.

135) 有在柱子上切的，也有纯化后切的，切下的片段可以用原来的亲和填料去除，凝血酶也需要去除的，你可以看下面的一些材料吧：

http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins 如果用凝血酶切的话，怎样去除凝血酶比较好？谢谢！ 去除一般用肝素琼脂糖凝胶和苯甲脒琼脂糖凝胶.

136)我们在做多肽的纯化，都是制备用的，不知道该用哪家的填料，现在有很多厂家来推销，Vydac，Kromasil，YMC都有，不知道哪家的反相硅胶比较好呢？ 大的厂家都差不多,差别不大.

137)你说阳离子柱子通常不吸附核酸的，为什么我用PH4.0上样，PH9.0洗脱，洗脱液测紫外吸收值时总在260有很高的的吸收值，难道不是核酸，那会是什么呢？

也许别的物 质也这样把,你可以把样品跑一下琼脂糖凝胶电泳,看看是不是就知道了.核酸酸性如果不强,你怕pH提高到5-6,这样核酸应该就挂不住,你偏酸性太多,那也许有一些会挂住,你试试吧.

138)您好chromatography ，我是新手，现在正在做牛血蛋白质的纯化，希望得到纯化的白蛋白和IgG。打算用盐析的方法先粗提白蛋白和球蛋白，然后层析分级，再超滤浓缩除盐。 现在遇到的困难是层析这部分，特向大狭您请教。

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白蛋白和IgG分别应选用哪种层析方法？填料选择什么？洗脱液具体选择什么（分段洗脱）？每次上样量最大能到多（制备型）？多长时间能过完一次？柱子的寿命一般为多少？洗脱液流速控制到多少？ 现在还没有做样品的电泳，所以还不知样品中杂蛋白和含量，只是在盐析中先用22%硫酸铵将纤维蛋白除去，用33%盐析出IgG样品，用50%除去拟球蛋白，用65%盐析出白蛋白样品。其中能提供以下数据①牛血清白蛋白：分子量：66210；分子形状：椭圆形；分子大小：40?*140?；等电点：4.7；血浆中的含量：52.0g/L。

②IgG:分子量：15300；分子形状：球状；等电点：5.8—7.3;血浆中含量：2.0g/L。

③另外，我从书上看到说：凝胶过滤在分级方法中分辨率为中等，但对脱盐效果优良；流速较低，对分级每周期约≥8小时，对脱盐仅30分钟；适用于大规模纯化的最后步骤，在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理，尤其适用于两种缓冲液交替时。

白蛋白最好用蓝色琼脂糖凝胶纯化,很好用,我们都用它专门去除白蛋白,你需要我可以把材料发给你,至于IgG可以用重组蛋白A琼脂糖凝胶一步纯化,很好用,当然你也可以考虑用疏水去纯化.白蛋白也可以用镍琼脂糖凝胶柱去纯化.

139)请问：sephadex系列, superdex系列 的gel fitrition column 有什么不同？

前者是葡聚糖凝胶,后者是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合的凝胶,所以前者刚性差,不容易做高分辨率的小颗粒,而后面的可以,刚性好,不容易因为pH,盐,压力而体积有很大的变化. 140)请问上HPLC的样品盐浓度过高是否影响纯化效果？

那倒不会,但是盐浓度高和有机溶剂混合也许会产生沉淀堵柱子,所以还是要很小心,最好别有高盐 141)柱子一般寿命多久，保养好了能用四五年吗？每次上样量是否不得超过十分之一？用于装填柱子的reservoir在哪里买得到，中文名叫什么，不同规格柱子用的reservoir是否是一个规格？一般过一个柱洗脱液的流速控制在多少，大概需要洗脱液多少个柱体积，需要多长时间？

除了凝胶过滤需要严格装柱子,需要装柱器,别的柱子都不用,至于上样量也只有凝胶过滤也上样的体积有关,别的色谱都不需要遵守,一般是根据载量来上样,于体积关系不大,洗脱也看你挂东西的多少,一般3个柱床体积,多的要5个柱床体积,时间多少看你的流速和你的柱床体积. 142)凝胶过滤怎么脱盐啊,我做凝胶的时候buffer是甲酸铵，本身就是盐啊 buffer毕竟是低浓度的盐，而您过了凝胶柱后，除去了样品溶液中的大部分的盐。

过柱子,除盐没有什么难的,很难在这里把整个操作写一遍,甲酸胺是可挥发性的盐,你浓度不高,物质稳定的话,直接冷冻干燥,或者真空干燥都可以去掉了,没有必要过柱子,我猜测你的是多肽,过柱子也去不掉盐. 143)我提的蛋白中老是混有大量的血红蛋白，干扰实验的后续工作，非常苦恼。请问有没有那种介质可以吸附组织蛋白提取物中的血红蛋白？ 144)

我们的苯基琼脂糖凝胶可以吸附血红蛋白,而且很牢固,我们以前做过,你可以用这个办法去除, 在通常不加盐的情况下就可以吸附血红蛋白。

145)DEAE－Sephadex A－50是离子交换加凝胶过滤，想请教chromatography它单纯的凝胶过滤分离范围多大？相当于Sephadex的什么型号呢？谢谢。

对这个填料不熟悉，没有用过，我觉得凝胶过滤相当于sephadex G-50，范围在1000-30000,但是它可用于纯化的蛋白分子量在30-200KD.

为什么范围和可用于纯化的分子量不一样呢？我的目的蛋白单亚基是18KD，该选哪个型号？ 你是想用它做凝胶过滤还是离子交换呢，你为什么不用琼脂糖凝胶系列呢，这个填料在高盐的时候床体

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积变化很大，不好用。

离子交换试了四个月不行，最近一次错用成了含PO3－的缓冲液，结果还没有开始往上加NaCl梯度蛋白就下来了，后来查资料才知道PO3－会和DEAE反应，不知道是否因此使这个柱子的离子交换失效，变成单纯的凝胶过滤，所以想知道和它相当的Sephadex的型号。 那何必呢,直接用凝胶过滤好了, sephadex G-50正好适合你的蛋白。

146)可是产品目录上说G－50分离范围是1000－5000，适用于脱盐，我的目的蛋白是18000啊。 另外G－25有粗、中、细、超细颗粒之分，请问区别在哪里？

147)我试做过两次CNBR活化亲合配基偶联，效果不太理想；希望能得到你的指点，听你说环氧活化琼脂糖凝胶有不少优点，请给一些活化及偶联的资料吧。

你偶联的是什么配基呢，环氧活化可以选择合适的亲和手臂，例如我们常用的有3-10个碳原子的手臂，而对于一些物质的纯化，没有手臂是不行的。此外环氧活化再偶联形成的键非常稳定不容易脱落，所以我们经常用这样的办法，我已经把我们的材料发给你了，其实这样活化的方法偶联的效率也很高，它还适合带氨基，羟基，巯基等配基的偶联，应用范围很广，我觉得是不错的方法。

148)镍柱选择哪个厂家性价比较好呢？

国产的就很好，价格便宜，性能一点也不差于进口的，螯合好了镍离子，载量高。能少花钱的何必多花钱呢，其实所有这些厂家性能都差不多，没有太大差别。

你就选择北京卓冠科技有限公司的吧，没有必要选择进口的，你pM你的邮件地址给我。我可以把相关的材料发给你。

149)我们实验室最近纯化了一批带His tag的蛋白，大部分为包涵体形式。用8M尿素超声溶解后，用amersham的镍柱纯化，结果均不是太纯。因为我的目的是想纯化后作为抗原做ELISA检测，为了防止与血清中的抗菌抗体起反应，必需得到很纯的蛋白。所以想请教一下还可以如何优化条件或结合哪些别的纯化手段？如果几种纯化方法联用的话,怎样的顺序最合理呢？

一般通过一步亲和都可以得到不错的效果,没有必要多做几步,何况包涵体的蛋白用别的纯化方法效果未必好, 洗脱用阶段洗脱的方法,摸细致点, 相信会有好的结果的,你把你的邮件告诉我,我把我们的材料发给你参考吧.

150)我提取了一些水溶性多糖，但含大量的色素。我想用分子筛或离子交换将色素与多糖分开，不知可行吗？色素会不会粘在填料上将填料污染？

只能说试试,色素种类很多,多糖也是如此,我也没有做过,只能试试. 你试试MCI GEL吧，这个东西分色素非常出色。 你找这个公司要资料吧。 010-51528296

sales@herbs-extract.com

151)我想纯化一蛋白，分子量10kd左右，目的蛋白来自血液中，浓度大概为每毫升20纳克左右，其他性质不详。手边暂时没有bio-rad蛋白质纯化用mini-protein电泳仪，无法用tricine-sds-page纯化。反相液相色谱柱c18又太贵，有没有其他比较好而且又经济的方案？谢谢。

只能在离子交换, 凝胶过滤, 疏水中去试吧.这么低的含量,先建立好的检测方法最要紧.

152)你好, 我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab')2含量达到80%以上. 现在

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的工艺F(ab')2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升, 蛋白含量约2% . 我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.

153)我想问一下Ｃ８柱用于分离蛋白质或肽类物质时，怎样选择洗脱的试剂？我对ＨＰＬＣ不懂，但现在需要用！谢谢！

你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法.

154)今天花了一个晚上浏览，收获蛮大，我的问题是这样：纯化GST融合蛋白（加上GST共90kD多），用amersham的1ml柱，曾经纯化出来，但酶切后就不见目的蛋白，只见GST，这次更悬，没有加凝血酶切，但洗脱柱后就在GST大小附近有带，菌液预先小量诱导有目的条带（90kD，没有GST条带），不知道是什么原因，诱导条件：IPTG0.1mM，26～29度3小时。细菌离心后用PBS重悬，-80度反复冻融3次，蛋白酶抑制剂只加了PMSF，超声（可能有点过，有部分泡沫），加tritonX100后RT摇20min，添加DTT至10mM（操作手册说可以增加跟柱的结合）后10000g离心，上清过柱按说明操作。SDS-PAGE的结果，沉淀仍然有大量目的条带，过柱前的上清的同一位置就只有很淡条带，过柱后相类似，PBS洗出液里蛋白就较稀少，但关键洗脱液中就只见约26kD的条带，怀疑GST，但从何而来？

我曾经按此步骤纯化过分子量比较小的一个蛋白（含GST约55kD），纯化得率还可以，但这次失败的原因是什么呢？

我怀疑是超声过了也许断裂了,所以这样,或者使蛋白变性都有可能,至于切了没有目标蛋白会不会切了以后不稳定,就沉淀在柱子上,这样就只有切的了,你可以用变性剂看看能不能洗下来东西.我想这是原因吧. 谢谢chromatography的教导，现在我已经决定不切除GST，凝血酶也很贵，不成功，则成＃％￥，所以，应该GST对研究影响不大吧。

是不是融合蛋白在融合位点就特别脆弱呢？我添加的DTT是不是也有影响？怎样超声不会太过？我500ml菌液浓缩到15mlPBS，超声几次都还很粘稠，请再给予指点。 变性剂是指哪些？

此外，听您讲有国产的层析柱还是怎样，可否给小弟一些资料？

我不做上游,但是处理的时候,书上是写如果超声的强度过大,时间过长,有可能会变性或者断裂,加DTT有没有影响我不很清楚,预处理这个问题你还是问问外面做表达和提取的人吧.变性剂常用的是尿素和盐酸胍

155)我的酶蛋白单体分子量约为90KD，其四聚体的分子量约为360。

我现在用的凝胶柱是S-200，是不是不大合适？此外，做SDS-PAGE时，有一条杂蛋白，和我的目标蛋白距离很近，一直分不开。不知道该怎么办？

你纯化出来应该是不错的,因为这样你的目标蛋白正好在纯化范围外,至于很近的杂质有没有可能是降解的产物呢,其实你也可以用s-100试试.如果没有,那就用现在的吧

156)我在做一个核内定位的蛋白，预测等电点是10，60KD。做过好久的亲和纯化，有N端his-tag，C端his-tag, 还有N端GST-tag的，纯化时的问题都一样：包涵体表达为主，上清含量很少。用低离子强度的PBS破菌的化，上清中含量会多一些，但是蛋白不挂亲和柱。洗脱出来的微量目的蛋白中目标蛋白只占很少一部分，用透析，PEG浓缩等等操作又都能使蛋白完全沉淀。上清用硫酸铵沉淀浓缩以后过疏

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水柱也不挂，也试过阴、阳离子柱，还是不挂柱。因为蛋白活性未知，所以我不倾向于做包涵体纯化，但是也曾经试过分级洗涤提包涵体蛋白，都没能拿到比较纯的包涵体，而且在包涵体中his－tag耦连的该蛋白也不挂柱，很迷惑，在变性条件下不应该存在tag被蛋白屏蔽的问题吧？

既然是包涵体本身应该有一定的纯度，不挂柱，那你用的是哪家的产品呢，此外怎么操作呢，你能说详细点吗，有的时候也许结合力比较弱，所以要选择镍密度高的填料，延长作用时间，提高pH值，降低流速，一般天然结构不挂的时候有，但是变性不挂很难理解，此外你的样品里有没有别的物质干扰挂柱，原因挺多的，所以需要你说详细点。

我用的亲和柱是qiageon的Ni-NTA agrose，应该不是镍柱质量问题，用这套操作体系纯化过几个其他his-蛋白效果都很理想，至于是不是有其他物质干扰我也不能确定，但是我试过这么多载体和tag，效果都一样，就觉得是蛋白本身性质的问题了

据说在靠近等电点附近的ph条件下，8M尿素体系的his蛋白是不挂柱的，不知是不是有这个情况，但是据预测的数据来看，好像ph8.0的缓冲体系应该不存在这个问题的 至于操作呢，亲和纯化我们用的都是agrose，在离心管里agrose与菌体上清4 度或者室温结合2hr～过夜不等，结合条件应该是很充分的了，很迷惑

另外如果是86KD的蛋白与其他60KD以下的杂带分开的话，用哪种型号的分子筛来做HPLC合适呢？ 做HPLC的话那你可以用TSK系列的凝胶柱,不过处理不了多少样品,虽然每家都产镍柱,他们的产品其实结构是不一样的,而效果也会有一些差别,因此我建议你可以换一种填料试试,没有听说哪家的填料是最好的,我没有用过这个公司的填料,但是它的结构我很清楚,我个人感觉这个填料的吸附力是比较弱的,因为我看过一般洗脱通常在200-300uM咪唑之间,而且由于它的填料结构是有三个螯合基团螯合镍离子,而通常用的只有两个,这样剩余用在和his作用的镍离子的价数就少一个,这样必然会吸附力不如只有两个的,这是我个人的见解.我用的填料有不少洗脱要在300-400mM咪唑,可见作用力还是有差别的,结构也是有差别的,这些差别和琼脂糖没有关系,只和配基本身的结构有关.

如果你说的pH的问题,那你可以再提高pH看看,反正是变性的,无所谓,你提高的10或者10.5看看,也许这样能挂住.

此外你也可以考虑换个别的离子看看能不能挂柱,不过好象你的填料也没有办法换离子,这个也是它的缺陷.

157)我用离子层析得到人总IgG，含有IgG1,IgG2,IgG3,IgG4，然后用亲和层析获得各个亚类，它们的分子量分别为：146，146，170，146，分子量差别很小，用常规的SDS-PAGE+考马斯亮兰很难鉴定它们的纯度，请问用何方法来鉴定它们的各自纯度。

哦,什么亲和能把这几个亚类分开,我记得好象说只有羟基磷灰石能把一些亚类分开,至于鉴别我没有做过,我觉得只能用专门检测亚型的试剂盒去检测他们了.

158)请问：DEAE-和CM-纤维素柱用完后可以用20%的酒精过柱保存吗？或用1M醋酸钠 pH3.0？ 还有它们的上样浓度一般在什么范围内？有没有什么要求？

应该可以用20%乙醇保存,就是柱子中填料也许会缩小一些,用醋酸钠也需要加防腐剂例如叠氮钠等把,否则也会长菌的.

上样的浓度应该关系不大,只和上样的总蛋白量有关,你可以查他们的载量,我觉得一般的离子交换填料的上样量也就在>20mg/ml左右,太高我没有上过.

159)我现在想用蛋白来亲和纯化我的抗体 蛋白SDS-PAGE就有一条带，但western效果很差

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所以我想进一步纯化一下蛋白，来亲和纯化抗体 现在我想电洗脱来纯化一下蛋白

但对用考染后的蛋白是不是可以用于亲和柱来纯化抗体呢 具体应注意什么问题呢

变性的蛋白既然能免疫,那么直接偶联到填料上做成柱子来纯化你的抗体应该没有问题,但是变性后的蛋白偶联很麻烦,因为如果你的变性蛋白要在盐酸胍或者脲里溶液,那它们都有氨基也许也会和活化的填料偶联,所以你的蛋白在普通缓冲液中能溶解才成.考染后的蛋白估计是不适合做抗体的配基,你可以跑电泳只切一条染色,这样知道位置后再把剩下电泳板切胶电洗脱就可以.我没有做过这个实验,所以抱歉,你可以在DXY里搜索,你会找到电洗脱的一些帖子的.

160)请问chromatography : 我用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化his tag 融合蛋白,杂带忒多,摸过很多条件,做过很多不同的蛋白,结果都一样.能否麻烦老兄寄一份his纯化的资料让我好好学习学习.

我已经把材料发给你了,你可以参考一下,或者改用我们公司的镍琼脂糖凝胶试试.去除这些杂带一般可以用降低pH洗脱,同时在缓冲液里加一些非离子表面活性剂,这样可以降低非特异吸附.

161)你好版主！我想请教一个问题：8M尿素溶解的蛋白能否直接做疏水或凝胶层析？另外separose 4FF分离2万左右分子量的蛋白效果会如何？如果改成 6FF应该怎样换介质？

8M尿素溶解的蛋白不加盐的话估计是挂不住的,你可以降低一点脲的浓度,这样才能保证硫酸铵能溶解在这里面.做凝胶过滤得小心点,在变性的条件下,蛋白都是线性分子,凝胶过滤是很难分开的.用separose系列分离这么小的效果也不会好的,除非是差别很大,即使separose6FF也未必好用.

162)请问chromatography 师兄, 纯化his蛋白,用降低pH洗脱和梯度咪唑洗脱有什么不同吗? 梯度ph洗难道不会使蛋白变性吗?

低pH和咪唑不一样,降低pH可以减弱蛋白和金属离子的作用离,这样吸附弱的蛋白容易被洗脱,而咪唑是竞争洗脱,它们原理是不同的,互相配合可以使一些咪唑洗不去的杂带洗掉,低pH也就到4-5左右,短时间不少蛋白不会变性的.

163)偶纯化一个原核表达的热休克蛋白融合蛋白，超声裂菌后40％硫酸铵沉淀，然后DEAE Sepharose FF纯化下来纯度85%左右，有3条杂带，分别为130KD+、～55KD、～45KD，目标蛋白分子量为74KD，偶的要求是要达到电泳纯所以偶选了phenyl做进一步纯化，可是偶的这个蛋白比较奇怪2M NaCl才能挂柱，（用硫酸铵的话还没挂柱就沉淀了），可是挂上之后0M NaCl也洗不下来，而且杂蛋白的性质和目标蛋白很象也弄不下来，是不是偶的疏水做的有问题呀？还有一个问题就是国产的柱子和仪器哪家的比较好？我现在用的柱子没有接头，对拉梯度会不会有很大影响？

其实你这个操作我觉得你可以这样,沉淀后直接上疏水,然后再过离子交换,至于你说的沉淀你可以稀释到低一些的硫酸铵蛋白就不沉淀了,它不需要那么高的浓度,一般1.5M左右看有没有沉淀,能不能挂在柱子上,洗脱洗不下来可以在洗脱液体中加5-10%的甘油或者乙二醇,应该和你操作没有关系.

国产的机器和柱子上海就有,上海沪西的就不错,柱子一般用锦华的.如果你的柱子没有死体积就没有关系. 后面的操作没有问题,一点坑没有关系

我之所以不先用疏水是因为疏水的分离效果很差，下来后还有好多杂蛋白，不如DEAE效果好，我现在用DEAE纯度可以达到85%，但是下一步不知道选什么介质好了，疏水不是很理想，我刚才用2M NaCl上样，用500mM NaCl到0M NaCl 50%乙二醇的梯度洗脱，结果都洗不下来像样的峰，是一个扁扁的A280最高值才7，偶用的柱子是1X17cm,流速0.9ml/min，洗脱体积>10CV.还有不知道Butyl、OCtyl和phenyl差别大不大，如果换他们两个会不会有不同效果？还有偶的蛋白是个多聚体，凝胶过滤好像没甚么戏。不知道您还有什么推荐的介质供选择吗？偶的蛋白不怕变性。

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是吗,那会不会你的蛋白再盐情况下容易沉淀,所以没有没有得到象样的峰呢,如果是这样你可以降低浓度,调pH看看,我怀疑是沉淀到柱子上,或者你用盐酸胍洗看看,通过调pH可以改变溶解度,此外可以用凝胶过滤做试试,或者尝试燃料亲和或金属螯合试试,也可以用羟基磷灰石做试试

164)chromatography :您好，我想请教一个问题，我要把标记碘的900KB的蛋白与游离碘分开，用凝胶层析法，应该用多长的柱子及多大型号的凝胶呢？

游离的碘是溶解状态的吗，这个我不清楚，如果是小分子的，那可以透析或者sephadex G-25柱子就可以，你试试吧，不知道你处理多少体积，一般上样量是柱子体积的1/5或1/4

游离的碘是溶解状态，我用过sephadex G-200，分离效果很差，昨天刚用过sephadex G-25，效果也不好，第一个峰下降的不快，并且两个峰之间的值仍然很大，远远大于本底值，我用的柱床体积是18立方厘米，每次上样量只有100微升。您看我哪个地方需要改进？谢谢！

你上样可以上到3-4毫升试试,上样太少扩散厉害,如果你做了还不行,那你可以透析试试

165)chromatography,你好。我现在遇到一个非常头痛的事情，最近用分子筛SephadexG100来分离虾的总蛋白的时候可以把大分子和小分子蛋白分开，可是条件不变，换了蟹的材料就不行了，而且提高盐的浓度或PH值都没有使分离效果得到改善。请帮忙分析一下。分离条件如下：柱体积为80ml，流速为0.1ml/min，上样方式手工上样，缓冲液：0.05M磷酸缓冲液，PH=6.4。分离图谱和SDS电泳结果见附件。请问如果换一种孔径的分子筛是否能够使蟹总蛋白分离效果改善？如果是应该换大的还是小孔径的？您还有其他好的建议吗？谢谢了！

要把大蛋白和小蛋白分开,那你干脆选择范围更小点的填料,例如G-50也许更好点,此外对凝胶过滤改变pH和盐对分离效果没有什么影响.你的流速也太慢了,可以提高到0.5ml/min左右.抱歉忽略了,以为已经回复过了呢.

166)还有一个问题想问一下。纯化的酶最终要冻干成制剂，静脉注射。可是内毒素很难合格，好不容易成功过几次，现在又不行了。而且我用的TRITON X－114萃取分离不适合放大。该酶理论等电点8.4。ph稳定范围7－11。肯定不能用阳离子柱了。内毒素合格标准每mg小于25EU。请问可以用什么方法，或者什么填料？哪可以提供少量填料小试一下（我们公司只有看到可行才会买大量柱料）？ 据我所知，内毒素的控制可以采取一下措施：

1 首先所用的容器必须经过干烤，180摄氏度4小时以上，使粘附在容器上的内毒素分解。

2 配制缓冲液的盐类必须保持不被内毒素污染。所用蒸馏水应该新鲜配制，所用试剂也最好新鲜配制，因为缓冲液在常温下很容易孳生细菌，而是溶液产生大量的内毒素。 3 配制好的液体用0.22微米的滤器虑过。

这样处理的话，有师兄将内毒素控制在了0.5EU/mg蛋白，符合FDA 的规定。 不妨一试。

你的酶是不是有同工酶,这酶有什么特点,需要辅酶吗,不知道有没有试过疏水,此外也可以用染料亲和的方法,不知道有没有可能用亲和的办法.

萃取的方法回收率要低,而且如果临床那也得对你的的TRITON残留也是个问题,不好去干净.我们有专门去除内毒素的填料,可以给你点小样,你可以PM你的邮件给我,我把我们的材料发给你.我们是用亲和的方法,特异去除内毒素,收率高.你可以试试.

167)我在纯化一个天然蛋白，纯化出来后没有抗原活性，请教原因。 流程是这样：提取－－－－conA柱－－－－－DEAE柱（梯度洗脱） －－－－ －总蛋白 －－－未结合部分 －－－一个蛋白

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－与抗体 －－反应 －－－－反应－－－－－－－ 不反应 很是苦恼，最近才发现这个宝地，请不吝赐教。

会不会是你的目标蛋白在最后一个柱子上有沉淀没有洗下来,或者失活了呢,你可以结合你的电泳图看看是不是把所有的蛋白都洗下来了,此外你的纯化工艺很有意思,第一步柱子好象没有太大意义,而且成本高,不如直接上离子交换看看.

首先谢谢你的答复。第一步柱子是去掉大部分与conA结合的蛋白，然后在上的交换柱，文献上基本上都这样，而且电泳显示确实去掉了很多的蛋白。不过我将试试直接上离子柱的效果。

电泳图显示的是除了最后纯化的蛋白外，几乎没有什么蛋白出来。离子交换柱不就是这种性质吗？我一直这样认为，蛋白挂在柱上，经过洗脱液洗脱得到自己的蛋白，没用的蛋白就洗不下来。不知对不对。 conA应该是去除糖蛋白的,离子交换和别的色谱一样也是有穿透的,洗脱也有你的目标蛋白和别的杂质,没用的蛋白不一定都是洗不下来.现在关键是你的目标蛋白如果上离子交换也洗得下来,那没有活性会不会是你的蛋白失去活性,或者是你检测的方法有偏差,有没有可能是pH或者盐干扰抗原和抗体的结合呢. 168)在层析过程中，我只是少量蛋白纯化，并且基本上是在4度层析柜中进行的，没有脱气，结果装柱装了几次，还是有一些气泡（开始在室温中装的，装好后放到层析柜中），由于样品已经处理好，最后一次有一些气泡我也没办法，我只能上样，结果在再平衡过程中出现很多峰，花了几个小时，还是没平衡，时不时又出现一个峰，真的很郁闷，这时我再看柱中的气泡时，几乎气泡都消失了，原来气泡一般都在柱壁上，是不是气泡跑到柱中间填料里去了？出现这么多峰，其它的问题都不存在，是不是气泡的缘故？如果装柱过程中有气泡，层析过程中会出现哪些情况？谢谢！

造成这样的问题主要是因为由于你的液体和柱子中的液体有温差, 这样两种溶液混合的时候就容易产生气泡, 你最好把你的溶液脱气,同时保持管道以及你的溶液温度都差不多,也就是液体也放在层析柜中,这样会好些,你说的问题说明的确是有气泡，气泡不是进入填料中间，而是出去了，或者变更小了，一直出到检测池中，所以一直有小峰上去又很快下来，装柱子装好后再放到层析柜中也不会有气泡的，主要还是有温差造成的，如果柱子中有气泡有两种情况，一是气泡一直不断，有气泡也赶不走，二是可以把气泡赶走，但是越多越难赶，因此最好是没有气泡，否则柱子分离效果也不好。

你说的情况似乎跟我的不一样，我装柱的时候，液体都放在层析柜里，并且恒流泵也放在层析柜中，柱中都是刚从层析柜中拿出来的,还有，我的很多峰并不像你说的那样上去又很快下来，慢慢上去，下得也很慢，持续的时间相当长，不知为什么？很急，做得很烦，是不是填料有问题？

气泡出的快慢和流速有很大的关系,流速慢,气泡比较大,所以上得慢,下来也慢,无论如何我觉得都是气泡的事,尽量要避免有温差.柱子中装的时候一定要没有气泡,否则很难赶走.

169)我这几天作DEAE sephadex 50离子交换，上样前检测有蛋白，但是洗脱梯度0.1mol/L到1mol/L。但是检测没有任何蛋白（280nm），实用的缓冲液tirs－Hcl 8.0 样品是碱性蛋白酶。不知道什么原因？谢谢！！

那你用更高的盐,如2M做个梯度你看看怎么样.也许你的蛋白要更高浓度的盐才能洗下来.

170)我有一个问题：我们的蛋白原来是用CM填料纯化的，洗脱条件都已经摸索好，最近我觉得我们CM填料有问题，我们还有SP填料，我想请问一下，如果我用SP填料的话，用CM填料的洗脱条件是否适用？能否得到相同的结果？ 还有一个小问题：

使用分子筛时，每一种填料都有一个分级范围，我想请问一下，洗脱体积跟洗下来的蛋白的分子量之间的具体关系是怎样的？就是说，比如Sephadex G-25 的分级范围在1000～5000，多少柱床体积，分子量

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1000的蛋白分子就出来了？一般洗几个柱床体积就可以了？谢谢！

1.我觉得你换填料,那么条件一般是不会一样的,还得再摸一下条件,如果你是用线性梯度洗脱的方式,那直接重复看看就可以.反正都得做了才知道.

2,很难把握不同蛋白的洗脱体积,因为和你的蛋白特性,浓度,上样量流速等都有关系,做纯化还是得有检测器的,毕竟和除盐不一样.

171)我原核表达了一种Ｈis蛋白，买了博采公司的非变性条件下提取His Tag蛋白质的Ni＋填料，按照它的说明书在层析是用的Buffer含有Tris,Nacl,甘油和不同浓度的咪唑，洗脱液就含有甘油。我对洗脱液进行了冷冻干燥，可是甘油除不了，不知该怎么办？请指点！

直接透析就可以，你把你的邮件pM给我，我可以把我们的材料发给你做参考，其实不需要用甘油就可以，此外金属螯合最好别选择Tris缓冲液。我不知道博采公司是哪里的，好用吗，什么价格呢。

172)我最近纯化一个蛋白，发现CM填料装的柱用7～8个柱床的平衡缓冲液都无法平衡，并且用7～8个柱床的的氢氧化钠也也洗不出一条直线来，总是有峰出来，不知是怎么回事？请高手指点，希望能指出造成这种现象尽可能多的原因。谢谢！

是不是太脏了，多洗几个柱床体积，或者看有没有气泡，峰型是直上直下的吗，如果是这样那就是气泡。

这次绝对没有气泡，峰型也不是直上直下的，慢慢升起来后又慢慢降下去，也不知道是不是紫外检测仪不稳定？

也许是不稳定或者检测池脏了。你直接不过柱子走有没有这样的问题

173)我用amersham的Ni亲和柱变性条件下纯化E Coli表达的蛋白。菌体破碎后，用8M Urea溶解。样品10000g，10min，0.22v过滤，但进样过程中，柱子压力升高仍很快。很快就达到了压力上限，不得不停止进样。

我想降低一点尿素的浓度，使得压力降一些，但是提取时8M Urea比6M提取的更好。

考虑，样品中用8M Urea，Binding &elution buffer中使用4M Urea, 会不会有一些蛋白（或杂蛋白）由此在柱中沉淀呢？用1N NaOH CIP理论上应该可以把蛋白降解，柱子是否能通过CIP完全恢复原状呢？ 另外，进样过程中压力升高，除了有蛋白，还有什么物质容易堵在柱子里呢？如何在进柱前除去呢？谢谢

另外，我用Superdex200 10/300预装柱分析Ni柱收集的目的蛋白（样品中含500mM IMI,8M Urea, 500mM NaCl,10% Glycerol,pH8.0），分子筛的buffer也用同样的buffer，可是，最后在19ml开始，出现好几个大峰，跑SDS-PAGE也没有蛋白band。不知道为什么我的buffer和样品buffer一样还会出现可能是溶剂峰？

Another question:

蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？ 30% ACN是不是能让蛋白复性呢？

1, 在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同,至少相当,你的问题就在于平衡用的4M, 而样品用的是8M, 这样混合, 蛋白就会沉淀, 所以柱压高,没有办法纯化,解决这个问题的方法是AKTA可以倒洗,你用6M盐酸胍或者8M脲含有400mM咪唑反方向冲柱子,这样就可以使沉淀溶解, 同时咪唑可以把挂的蛋白洗下来,这样柱子就好了, 用1N NaOH 变性蛋白也不能溶解, 根本没有用.你洗后再用水洗,再做CIP这样还可以好些.否则不用变性剂使蛋白溶解, CIP根本没用,还是堵柱子.此外还有注意的是你的样品很粘加上有甘油,黏度很大,所以相应压力也高,所以不用甘油也可以.

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2,你的意思是说你的缓冲液中也有500mMIMI吗,我怀疑那几个峰不是蛋白,会不会是咪唑呢.此外也许有你的目标蛋白,但是浓度低,你得透析浓缩才能电泳看到,或者你用银染的方法看看.我怀疑你前面纯化也许没有你的目标蛋白,所以做这一步没有蛋白或者很少. Another question:

蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？ 30% ACN是不是能让蛋白复性呢？

一般是不能,除非这个蛋白是亲脂性的,而且稳定性很好.

而我看的文献30% ACN只会使蛋白变性,不会复性的,除非你的蛋白是亲脂性,水中不溶解,而溶解在有机溶剂中,这就不是复性的问题,,是溶解性的问题.

1,我现在做的镍柱样品和buffer是一样的，都是8M Urea，降低尿素浓度只是一个想法，还没开始实施。 2，我的SEC中的peak1, peak2浓缩跑过电泳，都是我的目的蛋白。我的蛋白疏水性强，较容易聚集，所以才加的甘油。前面纯化应该纯化出来了。

3，SEC最后的peak4, 5用银染做过，没有蛋白条带，浓缩用BCA测过蛋白浓度基本没有。所以应该不是蛋白。这样就很怪了，我的SEC buffer中也有500mM Imidazole阿，基线走平了才进的样，为什么最后还会出峰呢？

4，乙腈的问题是由于有做蛋白结构的文献说我的目的蛋白在三氟乙醇或30% ACN中用CD测，三维结构是对的；也没有聚集体。当然，他们的蛋白是固相合成的。我在做蛋白复性，希望找到一个条件使得我的蛋白不聚集，且有三维结构，所以想试一下。

5，你说的CIP方法很有启发，多谢了。我用Urea,Gua-HCl,NaOH洗镍柱，柱的颜色都不如水洗时白，是不是变性剂和碱会使胶的状态发生变化呢？

1.抱歉，因为问题太多，所以没有看清楚。

2，即使是这样，那样品黏度大，而且有甘油，你得把流速降低，蛋白的浓度也不能高。 3。如果是有你的蛋白，那后面的也许是一些色素或别的有吸收的物质，不是蛋白也没有关系。 4。如果是这样，那你可以试试用这样的液体看能不能复性。

5，碱不能长时间洗镍柱子，那样镍也许会被还原的，何况单独在碱性条件下并不能溶解变性沉淀的蛋白。

174)我在最近不断的条件摸索下纯化到了我的目的蛋白，其中洗脱液是改用含0.1%SDS的系统，这样才能洗出蛋白（还原型谷胱苷肽就不行），但这样得到的蛋白还需要怎么样处理呢？ 如果是这样，那我很长见识：），不知道你随后要做什么，所以很难知道要怎么处理。

其实还有一个问题随后出现，就是我之前用的是直接与sepharose 4B混合的纯化方法，就用0.1SDS洗脱可以，但是用预装柱就变成是是elution buffer（含还原型谷胱苷肽)才能洗脱，前者琼脂糖有一些过期而已，其他步骤基本一致，样品也是一样处理的，用SKL溶解包涵体，用TX100增加Binding，不知道为什么结果有差。

我之后的目的是功能检测，检测蛋白对癌细胞的促凋亡作用。

还有一点想问一下，上海生化所的低分子量Marker的每条蛋白带大约是多少蛋白量呀（20ul*20的），因为我不想做蛋白定量先，想先估计一下。

那也许你填料和样品混合时间较长, 所以吸附比较牢固, 因此用elution buffer洗不下来,而要用0.1SDS洗脱, 而过柱子相对吸附较弱, 所以elution buffer可以, 或者是你的这两种填料不一样造成的, 至于

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Marker我就不清楚了,你最好问卖东西的人,他们也许知道.

175)我一般洗镍柱都是用EDTA把镍脱去再洗，洗完再加镍，很麻烦。 用Gua-HCl,EtOH洗柱可以不脱镍么？

别客气。用Gua-HCl, EtOH洗柱可以不脱镍,放心吧

176)这里还要麻烦Chromatography兄一次，我作草鱼胰蛋白酶的提纯，用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱提纯。

现在我碰到亲和柱洗脱液的问题。草鱼胰蛋白酶性质和哺乳动物的不同，哺乳动物的是碱性蛋白酶，而草鱼胰蛋白酶是酸性蛋白酶，在酸性区域不稳定，国外资料和我作的预实验都证明了这一点。经典的哺乳动物胰蛋白酶的提纯方法用pH2.5的酸性洗脱液洗脱，而这种方法对我的草鱼胰蛋白酶的提纯不适用。国外资料有苯甲脒琼脂糖凝胶提纯鱼胰蛋白酶的，用120mM苯甲脒在中性区域洗脱。我的卵类粘蛋白合成的SEPHAROSE-4B亲和柱能用120mM苯甲脒洗脱吗？

苯甲脒琼脂糖凝胶可以用苯甲脒洗脱，但是我不知道能不能用在你的柱子上，因为按道理蛋白和这两个填料的作用位点和方式也许不一样，因此我觉得不一定能用，除非它们作用方式是一样的，最实际的就是试试就知道。

此外我觉得既然文献用的是苯甲脒琼脂糖凝胶，那你也可以用这个填料，其实我们公司就有这个填料。此外你也可以换个配基例如胰蛋白酶抑制剂做配基，不过一般都是用降低pH的洗脱，所以实在没有办法你还是得用苯甲脒琼脂糖凝胶。

177)我用的介质是CM52（羧甲基纤维素的），柱子的直径是7CM，介质在上样过程中经常出现裂纹，请问这是为什么？这个问题怎么解决？

我怀疑是填料压得太紧,样品和平衡缓冲液是一样的吗,温度是一样的吗,我怀疑样品上柱子有气泡才会有裂纹,否则是不该有的.你要保证样品和平衡缓冲液温度一样,别直接从冰箱里拿出来就上样. 178)我想问一下DEAE FF柱缓冲液能不能用硼砂-硼酸缓冲液

阴离子柱一般都用TRIS-HCL，或者有用磷酸缓冲液 但是前者对我的酶活有影响，后者PH值不够高，所以决定换BAFFER，不知道选择BAFFER的时候有什么依据

应该没有问题，其实缓冲液不过是调pH的，低浓度对离子交换影响没有象一些书上说的那样说不能用某个缓冲体系。所以我觉得大多都比较随意，常用的都是可以的。

179)真佩服搂主的豪言壮语，你果真能“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“吗？我不太相信，国内好多前辈和专家都不敢这么夸口，我做了6年的蛋白纯化和填料合成工作，我觉得这个领域要做好，做精并不是一件轻松的事情.

“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“是我对填料合成的理解,那就是填料合成和做汤差不多，就是熬，而纯化就象把杂蛋白象灰尘一样吹去才得到目标蛋白，我不觉得做填料和做纯化很容易。专家和前辈现在亲自做实验的不多，而做产业的更少，我也做了11年的纯化和填料，包括小分子的HPLC和生物大分子的中低压色谱，既然你是同行，有问题以后向你请教，精是要静下心来做的。我觉得做产品最难。 180)我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包涵体形式存在， 请问，我怎么设计我的纯化步骤？

我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知道下边该怎么做？ 望赐教!

这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21表达

请问，5KD 左右得蛋白，不用tricine－sdspage用普通得sds－page跑胶行吗？

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181)chromatography兄: 请教一个问题

目的蛋白分子量大概在9万左右，想除去分子量8万以下的杂质，而且希望除的尽可能干净，但是我看了millipore的资料，如果选择3万截留分子量的膜，还有不少3－8万的杂质，不知道选择8万截留分子量的膜能不能最大可能的去除8万以下的杂质？最适当的膜应该是哪种？

选择5万截留分子量的膜是否能保证5万以下的分子都能除干净（95％以上吧）？其实目的蛋白只要损失不超过三分之一我都可以接受，但是一定要去除3万到5万之间的那些小分子，不然会影响我的检测。 请专家赐教！谢谢！

我超滤用得不多，好象没有这么能截留80KD以上的膜，如果你的样品不多，直接过凝胶过滤柱子就可以，你选择排阻范围上限为80KD的填料，例如sephadex G-75范围在3000-80000，这样在外水体积出来的正适合你需要大于80000的样品，快，简单，而且不需要复杂设备。如果用superdex 75 范围在3000-70000,效果也许更好

182)1,现在除了各种离心管样的超滤装置,有没有更快更大量的超滤设备? g_kdu@stu.edu.cn

2,如果样品体积相对于上样量太大您比较常用的浓缩方法是什么?我有透析袋,PEG ,大容量冷冻干燥设备和50ml的脱盐柱,很小的超滤管可供选择.

3,我依次用离子柱,疏水柱,亲和柱纯化我的蛋白.过了离子柱之后,我发现不挂柱的部分和梯度洗脱下来的某一部分都能检测到活性(我提纯天然酶),这可不可以说明他们是不同蛋白? 我把在离子柱上梯度洗脱下来的那一部分再经过疏水柱之后上亲和柱(染料,red),用2M的盐洗,发现在小于1M和接近2M的地方有两个活性峰,这能不能说明这又是不同的蛋白?最终SDS-PAGE发现这\两个\条带分子量相差一点点,但是按照文献上应该只有一个活性很强的蛋白,我却得到这样活性很弱的\两个\蛋白,真是越做越糊涂了. 超滤设备当然有大的，你可以和密理博或者颇尔公司联系，他们会给你详细回答的，我做纯化大多用疏水和亲和多，所以不怎么浓缩，小量可以用透析袋，大量的可以用超滤，如果要做成粉末长期保存那就冷冻干燥。

不挂的部分不一定是另一种酶，因为柱子不可能是100%挂住，何况超载时穿透也会有活性，还是用电泳检测看是不是在同一个位置都有。洗脱做电泳差一点很难说，因为电泳的带不一定对得很齐，你把两个样品混在一起跑，这样看是不是一条带，如果是很可能还是一个东西，活性的强弱得看你操作本身有没有降低活性的可能，如果是这样，那说明在纯化过程中有活性损失，染料亲和有洗脱需要特异洗脱，例如用辅酶洗脱的，你看你的操作和文献是不是一样，此外提取有没有问题，还有是不是浓度太低所以活性低。

183)请问新买的NI填料是不是已经螯和好镍的？NI填料的再生过程具体怎么样呢？

我要做的His融合蛋白是细胞表达后提取出来的，上样体系是否要和柱子平衡体系一样呢？因为没有检测器，请问大概要用多大浓度的咪唑来洗脱？

我们公司的镍琼脂糖凝胶是已经螯合好镍了，不知道你用的是哪家公司的，一般如果是蓝绿色的，那是螯合好镍了，如果是白色的，那就没有，再生很难在这里说清楚，你PM你的邮件地址给我，我把我们的材料发给你，很详细，包括操作也是，样品最好是pH和盐浓度同平衡缓冲液一样，一般你买的填料都有说明书，就有怎么操作的，我可以把我们的操作发一份给你做参考。不同蛋白洗脱都不一样，你看我们的说明书就比较清楚了。

184)准备纯化一多肽串联体，分子量17000左右，，准备先用G-25除盐，在分别过sp-sephrose FF,DEAE-sephrose FF,串联体裂解成单体后，由于单体分子量4000左右，PI和原来差不多，所以想重复串联体一样在进行纯化。

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我没做过纯化，以上想法是否行得通，请兄台指教，

若学长有更好的想法请尽管不吝赐教。G-25除盐速度快吗？操作条件：平衡，洗脱液，柱的大小，都望指教

如果你的样品等电点是4.3，那用DEAE-sephrose FF比较合适，而sp-sephrose FF很难挂住，当然如果pH在2左右也许能挂柱，但是不知道在这样条件下你的蛋白稳定性如何。得到串联体后用什么方法裂解，这个说清楚才能说选择怎么样的柱子，简单重复不一定能得到好的效果，除盐很快，一般上样的多少取决你柱子的大小，也就是说你处理的样品体积，一般除盐可以上样到填料体积的25%左右，洗脱就用你不含盐的缓冲液，也就是平衡DEAE-sephrose FF最好。除盐柱子一般离子交换平衡缓冲液洗冲柱子3个柱床体积就可以，柱子不需要装很高，短粗柱子就可以除盐了，你没有告诉你要做多少样品，抱歉没有办法给你说要多大的柱子。

多谢指点，sp sephrose-ff 我是打算用来出去带+电蛋白的，所以这步我是否可以、只收集过柱液，而不要去洗脱了，我用溴化氰裂解的，你的意思是否我可以只用DEAE SEPHROSE-FF就可除盐了，不用再用G-15之类的，我是用来进行50L罐后的纯化的，小肽分子量如上，很小，选柱要以此为依据，但我对柱的参数不懂，请指教

别客气,其实我觉得sp sephrose-ff 也可以，看你怎么配合了，DEAE SEPHROSE-FF不能除盐，但是如果你选择挥发性的盐，那也许不需要过凝胶柱子就可以，此外如果是4000的多肽，只能选择sephadex G-10除盐，不知道效果好不好，G-25不行，因此如果量很大的话，还是用挥发性的盐吧。仅用离子交换不好的话，你可以考虑反相，但是量大成本比较高，因此你也可以试试疏水 185)主要是纯化小肽，能教我选选柱子吗，thank you

抱歉，不知道你要纯化多肽分子量在什么范围，做多大的规模，这些不清楚很难说选择什么填料和柱子。 纯化小肽最好用反相色谱，它的分辨率是色谱方法中最高的，C18或C8柱都可以，如果你的小肽中芳香氨基酸的含量较高，也可以考虑苯基的反相柱，小肽经过反相后通常结构能够得到恢复，如胰岛素。仅供参考。

186)前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？？

另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。 chromatography wrote:

你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。

chromatography,您好.为什么\丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了\呢?谢谢!

我觉得因为是水溶性的色素，在乙醇和高盐中能溶解，而蛋白沉淀，这样可以去掉一些色素，其实色素是小分子，也可以超滤透析过凝胶过滤都可以去掉一部分，结合起来也许能去得更干净点

187)作完外源基因表达后想纯化上清中6kd糖蛋白，看了一点文献也不确定如何选择柱子，正着急。你看先过分子筛再过疏水或离子柱行吗？ 关键是想您给一些关于各类柱子型号、特点以及装柱操作的链接或书（希望能全点），帮我扫一下盲。可以吗？ 另外上清中的色素用分子筛可以和目的蛋白分开吗？

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糖蛋白有专门的亲和柱子,例如凝集素的柱子,你的蛋白上是什么类的糖就可以用专门的凝集素亲和柱子去做,当然也可以用硼酸琼脂糖凝胶去纯化糖蛋白,我们公司就有这样的填料,当然你也可以选择离子交换和疏水试试,具体的方案得看你现在手头有什么条件,我觉得如果是离子交换和凝胶最好先过离子住,再过凝胶柱子,如果是疏水,那可以用硫酸铵沉淀配合疏水,不知道你的上清目标蛋白浓度大不大,太具体的那就很难三言两语说得清楚,何况你没有提供蛋白的等电点,所以很难说选择这么离子柱,也没有上清电泳图,所以不知道选择什么凝胶的填料,不知道什么糖,很难知道用什么凝集素的柱子,硼酸琼脂糖凝胶倒适合各种糖蛋白,而且成本也低,也许值得考虑.

色素一般比蛋白分子量小很多,凝胶柱子应该能分开.

188)我想用反相Source分离蛋白，说明书上说可以耐受6M Gua-HCl，我的蛋白溶于8M Urea中，不知道Urea会不会对source填料造成影响？Urea会不会影响蛋白的binding呢？色谱园上有一个实例用SOURCE分离包含体蛋白，不过进样时样品是在盐酸胍中的，没见到用尿素的阿。

还有，反相的A液为TFA in water，在这种条件下，是不是应该先做一下我的蛋白的溶解性试验呢？随着洗脱时ACN的增加，蛋白会不会沉淀出来呢？这样，柱子很容易会被堵掉的。我试过不加TFA的ACN溶解我的蛋白，30%以下的ACN无法溶解，我的蛋白疏水性较强，非变性buffer中溶解性很小，那么加入TFA就可以保证蛋白百分之百溶解么？

能用6M Gua-HCl那耐受8M Urea完全没有问题，这个填料很稳定，脲也不会影响binding的，我觉得还是用Gua-HCl好一些，，因为它溶解包涵体的能力更强。一般的蛋白在TFA in water这样条件下都能溶解，但是我不知道包涵体蛋白可以不可以，你参考文献做吧。通常HPLC做蛋白和多肽在洗脱时ACN增加不会使蛋白沉淀，如果不加TFA不溶解是很正常的，因为没有它一般的蛋白都难溶解在ACN水溶液中，加入的话应该可以增加你蛋白的溶解度。100%的溶解那也得看你蛋白浓度和本身的特性。

189)我要纯化的蛋白是一种酶，过完阴离子柱后还有酶活，但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了，我的蛋白去了哪里？所用疏水层析柱柱体积只有１ml，是否有影响？

190)我要纯化的蛋白是一种酶，过完阴离子柱后还有酶活，但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了，我的蛋白去了哪里？所用疏水层析柱柱体积只有１ml，是否有影响？

我怀疑你的蛋白也许在苯基柱子上没有洗下来，你可以用20%乙二醇水洗看看有没有东西，和柱子大小关系不大，你纯化什么酶呢

我纯化的是真菌发酵液里的葡聚糖酶，量很小，即使硫酸铵浓缩后酶活也没有显著提高，电泳凝胶用考染只有几条很淡的条带，所以一直在用银染．过阴离子柱时我用的是ＰＨ７.０的Ｔris－ＨＣl平衡柱子和１Ｍ的ＮaＣl洗脱，在１０－１５％时目标蛋白就被洗了下来．您认为我有没有必要改变ＰＨ再过阴离子柱．

疏水层析对蛋白的稀释大吗？有没有可能我的蛋白本身就太少所以被稀释的找不见了．用20%乙二醇水洗是上样后直接用20%乙二醇洗脱还是低盐洗脱后再用20%乙二醇洗，20%乙二醇会影响酶活吗？是乙醇还是乙二醇？

离子交换如果挂住，洗脱下来比较快，那你可以改变pH试试，提高pH到8-9看看，这样是不是结合更牢，此外如果你的蛋白是葡聚糖酶，那你直接用sephadex G-25这样的柱子也许能做亲和填料，挂住你的蛋白，可以试试，因为它的底物是葡聚糖，而sephadex是交联的葡聚糖，测定上柱前的酶活，上样完后看总的酶活有没有降低，如果是，那可能被吸附，然后改变pH或者盐看有没有东西下来。

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疏水不会稀释你的蛋白，如果被挂住它和亲和一样有富集的作用，用20%乙二醇水洗只在洗脱的时候用，别的缓冲液都没有，此外疏水和时候配合硫酸铵沉淀，如果你沉淀没有，那也许浓度太低，沉淀不下来。 191)1、颗粒性（蛋白聚合体）能利用柱层析吗？

2、能比较一下柱层析与离心在纯化过程中对目标蛋白生物活性的影响吗？ 3、柱层析能进行活病毒的纯化吗？

聚合体如果小于病毒颗粒那完全没有问题，你可以用琼脂糖凝胶6BFF或者脂糖凝胶4BFF，一般的层析都不会使蛋白失活离心也不会，离心很难做得很纯，如果差别很大也许好些，如果要得到纯的样品，不过柱子很难做到。

层析做病毒完全没有问题，我用我们公司的离子交换和琼脂糖凝胶6BFF做过病毒的纯化，很好用，而且纯度很高，很清晰的三条带，滴度也很高。

192)目前我们需要大量提纯小鼠血清中IgG，我做过了预实验：辛酸－硫酸铵粗提后，再以阴离子交换树脂（DEAE sephadex A-50)进行层析，看帖子说此法提纯IgG效果较理想，但我做后，跑SDS-PAGE电泳，仍有不少带，且得到的量非常少。现将大致过程写出，请您指点其中不足之处，帮我分析一下原因，由于初接触蛋白方面，知之甚少，望不吝赐教，谢谢！ 1 5ml血清先以辛酸（33ul/ml)PH4.5 沉淀出杂蛋白，取上清

2 PH7.4下加0.277g/ml的硫酸铵，使终浓度达45％，静止1h以上，取沉淀，沉淀溶于2ml PH8.0 PB缓冲液中（不含NaCL）对同液透析过夜。

3 透析液2ml直接上PH8.0 PB缓冲液平衡好的 2.6×15cm 的DEAE sephadex A-50柱，并以同缓冲液洗脱（据说IgG不挂在柱上，直接流出，而其它杂蛋白挂到柱上），以紫外分光光度计测A280吸收值，测值结果发现，几乎没有高值出现，约收集了120ml洗脱液，选了几管有值的跑电泳，带子相当微弱，不知蛋白跑哪里去了？

后来不采用过柱方法，直接将2ml透析样品与1ml sephadex A-50胶直接混合，4度过夜，离心取上清，但电泳后仍有许多带。

另外，有说以亲和层析方法提纯鼠IgG，纯度较高。我们头儿让我找溴化氰活化琼脂糖凝胶后偶联的方法提IgG，我没在网上找到相关内容，这里看到您又提到用环氧丙烷活化琼脂糖凝胶，此法更好，如果您方便能发一些溴化氰和环氧丙烷活化琼脂糖凝胶的具体方法以及接下来的偶联和纯化相关资料到我邮箱吗？hailanliu37@126.com 非常感谢您！

抗体这样纯化的方法我没有做过,你可以参考下面的帖子,我也有相关的材料,其实硫酸铵沉淀后直接过苯基柱子就效果很好,直接过亲和也可以,你这个方法文献虽然说,但看来不一定好用,我怀疑还是操作的条件.

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1160718&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1160718

你需要偶联什么东西来纯化抗体呢,是你的抗原吗,我把材料发给你吧,其实纯化抗体方法不少,看你的需要了.

193) 硫酸铵沉淀后直接过疏水柱，应该用多大浓度的硫酸铵平衡柱子啊

看你蛋白情况了,一般也就2M左右吧.挂不住就提高浓度,挂太牢就适当降低盐浓度,一般要根据实验决定.我一般就用苯基琼脂糖凝胶,一般纯化IgG用0.7M硫酸铵就可以挂住.

你有个贴子中说在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同至少相当。我想试试你说的硫酸铵沉淀后直接过疏水柱，那我是不是要先确定复溶后样品的盐浓度再确定平衡缓冲液的盐浓度啊，如果是我怎么检测样品的盐浓度啊

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其实差不多就可以,也不一定特别严格,例如疏水盐浓度你的样品的盐高于平衡的也可以,但是别相差太多,尤其不能样品的盐浓度小于平衡缓冲液,这样也许挂不住,或者会产生沉淀.而缓冲液和盐浓度不同混合也许会产生沉淀,所以要小心,而一样的缓冲液体系和盐浓度可以避免这样的问题.

硫酸铵沉淀后的样品,如果是上清按盐浓度稀释到你缓冲液盐浓度就可以,如果是沉淀,直接用缓冲液去溶解,沉淀里的盐可以忽略.

最好的办法你可以用电导的方法去检测,只要样品的电导和你的平衡缓冲液一样就可以了.

194)我在用镍柱亲和纯化后，蛋白已经比较纯了，仅在银染时能看见微弱的杂带（目的蛋白约25KD，杂蛋白约40KD)。但我还想试试能不能完全去除杂带。此前试过分子筛没效果，所以想试试离子交换。想请教一下，在变性条件下可以做离子交换吗？和复性后再做比起来哪个效果好呢？非常感谢！！ 浓度太低一些杂带是很难出现的,所以这样的纯度很难说,我觉得得浓度高到25mg/ml左右,这样做电泳才能看得清楚些到底纯不纯.如果你是变性条件下做凝胶过滤没有意义,因为这时候蛋白是链状分子或者是不蜷曲的,不是球型,所以在这样的柱子中没有办法使他们分离,你最好的方法是优化你的亲和纯化条件,也可以在纯化前做好预处理,如果是包涵体,可以用分级沉淀的方法来初纯,亲和柱子的缓冲液中加点土温或者用pH洗脱和咪唑洗脱的方法配合,同时用阶段洗脱的方法,一般都能做得很好,用试剂盒的方法或者线性洗脱的方法有时候很难得到好的效果,你也许可以参考我们的方法,你留下邮箱我给你发一份做参考吧.

我觉得离子交换也不一定好,在脲这样的变性剂下可以做离子交换,但是效果也不一定好,我觉得还是优化亲和条件更有意义.此外浓度太低很难纯化.

195)重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能一次纯化大量血清IgG吗？如几十毫升。

如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清IgG，先要偶联其相应配基如抗体或蛋白A是吗？这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么？

几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非特异吸附,是个不错的方法. 196)谢谢色谱兄，能告诉我分级沉淀的具体操作步骤和缓冲液中添加吐温的浓度吗？

分级沉淀包涵体其实很简单,用6M盐酸胍溶解包涵体,然后用缓冲液稀释到5M,然后混匀离心,上清继续稀释到4M,如此类推,一直到1M,这样把每次的沉淀和上清跑电泳,就可以知道在哪个浓度下包涵体中目标蛋白是最纯,而且收率是最高的,这样得到的包涵体蛋白比普通的洗涕方法要干净而且纯净,再纯化就好多了.

加吐温很简单只要在平衡和洗脱的缓冲液中加0.5%吐温可以降低非特异吸附,使洗脱的蛋白更纯,其他的操作和一般没有什么差别,材料我已经发了,请查收. 197)兄，请教一下如何测柱效呀！谢谢先

一般柱效是常用1%的柱床体积的丙酮过柱子,柱效=柱高/理论塔板数,而每米理论塔板数=5.54/(Ve/W1/2)2,其中Ve是保留体积,W1/2=半峰宽,一般很少测定这个值. 我的是1毫升的预装柱，

因为上样环最小100微升，所以就上了100微升的丙酮，然后用蒸馏水冲洗，没有峰出来，后来我用2毫升的NACL冲洗了5个柱体积，还是 没有 峰出来，然后我想里面可能没有物质了，就用蒸馏水想冲平，结果出现了3个峰 都搞不懂是些什么物质。

丙酮测柱效的时候 洗脱液不是用蒸馏水1的吗？

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1ml的预装柱根本不需要测定柱效的，如果不是凝胶过滤也许需要，如果是亲和和疏水等没有这个必要，你不出峰我觉得是检测波长不对，因为丙酮在280估计吸收非常弱，你得换个波长，洗脱水就可以。后面出的应该是杂质。

198)chromatography兄：您好！因为我对色谱一窍不通，所以有一些基本的问题想请教于您。我现在正准备用HPLC分离提纯一种细菌的外毒素，它是一种碱性丝氨酸蛋白，分子量大约是33KDa，按照文献的方法，是先用硫酸铵分级沉淀后再上疏水柱（HIC, phenyl sepharose high performance, Pharmacia)，然后再用凝胶过滤柱（(with Superose 6 HR10/30, Pharmacia)，我查了一下，这两种柱子好像都是预装柱。我想问你的是，什么情况需要发放大？是多大的量？我只是想分离出来做单抗和测序以及做免疫保护性，那么需不需要放大？

另外：这样的两根预装柱加起来差不多要花4000美元，代价太昂贵了，那么有没有便宜的柱子且纯化效果也不错的？

最后一个问题：如果我想让公司代为纯化，您觉得可行吗？如果可行，请问你知不知道哪里有这样的公司？

你好，其实你这个纯化不一定需要专门的预装柱，当然你要用也可以，我们公司就有苯基琼脂糖凝胶柱子和填料，你要做多大都可以，至于凝胶过滤Superose 6是比较贵的，何况是预装柱，你可以用sephadex G-50应该也可以，这样组合会比较便宜，公司做纯化一般是比较贵的，你做多少量呢，一般钱给少了公司觉得不合适，多了，你觉得贵，纯化这样的蛋白估计也上万元，而且看你难度不同收费也不一样，我觉得你还得自己做。你做的量估计不需要多大，100mg足够用了吧。这样不需要多大的柱子就可以。 199)蛋白在合成中形成了醋酸盐，请问如何分离纯化和检测？谢谢！

不很明白,电泳不能检测吗,也可以用HPLC的凝胶柱子去检测,纯化和成盐关系不大,只要调pH应该就成游离的蛋白了.不知道你的杂质都有哪些,很难说用什么方法.

200)我的蛋白等电点预测是6.5，应该选阴离子柱，但是目的蛋白和一些杂蛋白都穿过。但用阳离子CM柱后却能挂柱，经洗脱后纯度很好。请问这该如何解释？

这个很正常,你的这个蛋白用阴柱或者阳柱都可以,因为它的等电点在中性,所以都可以用,至于穿过也许pH不够高,或者吸附力弱,再不就是预测有偏差.

201)在做HPLC之前要求将样品过滤，但是我的样品过滤以后就没有活性了，有可能样品与超滤膜结合了（但活性丢失的真正原因我不能确定）。现在想问色谱兄，怎样进行该蛋白质的进一步纯化！ 样品过滤不该用超滤的膜,用普通的0.22um的膜就可以了,没有活性那蛋白也没有了吧,我怀疑是超滤膜把蛋白截留了,这样样品当然没有活性了

202)色谱兄你好！我买了WHATMAN的纤维素DE52阴离子层析柱，我想问一下，上样洗脱后，层析柱最后应洗脱到什么程度，是不是要基线 跑平了才行？这样后下次使用，用不用再生？怎样再生，用碱还是用酸？多大浓度？DE52规定使用的pH范围是2－9.5。怎样贮存好？

应该洗到基线.用完最好用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用水洗,保存可以保存在20%的乙醇中也可以,其实你应该按照说明书的去做,我好久没有用过这个填料了.其实用DEAE琼脂糖凝胶不是更好吗,这个填料有点老.

203)我准备用Gravity－flow柱纯化蛋白，但没有独立的UV检测仪和收集器。能否在FPLC系统上直接运行，而不用启动泵？如可以要如何设置？或者有没有其他方法？

不知道你用的是AKTA prime还是AKTA explorer, 有不少型号的，我觉得不好接，因为这些系统的管道很难靠重力可以流动液体，如果是AKTA prime也许好改点，你可以问他们的工程师吧

204)谢谢chromatography，因为醋酸分子量很小，用电泳或凝胶柱效果可能不好，现在主要是如何检测

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纯化后样品中的醋酸残留，因为没有对照品，测蛋白含量就不行了。能不能用醋酸对照，用离子色谱测醋酸含量呢？没做过离子色谱，不知道用什么检测器合适，请chromatography朋友指点。

你说的是检测醋酸呀,我以为你是要把醋酸和蛋白分开呢,如果是检测,如果是这样,你可以把你的样品加点盐酸,这样变成酸性环境那你的醋酸应该可以游离出来,毕竟蛋白会和盐酸成盐,或者用硫酸也可以,然后你用气相色谱的氢焰检测器就可以检测,而且很灵敏,这样应该就好了

谢谢，醋酸盐可以用GC测定，但若形成的是其它盐如硫酸盐或磷酸盐该如何测呢？

如果是这些酸我可不知道怎么检测了, 这得看无机化学怎么分析这些酸了. 其实你的蛋白在碱性条件下就不会成盐了,没有这么复杂吧.

205)请教chromatography：最近我想做关于蛋白纯化方面的实验，因为是新手，所以想请教几个问题，谢谢！

我的蛋白是70～80KD左右的，HIS标签，怎样确定是以可溶形式还是包涵体形式表达呢？若是包涵体是先让其溶解、复性再进行纯化，还是先纯化再进行溶解复性呢？我想用Ni+琼脂糖凝胶进行亲和纯化，应选用什么型号的填料呢？实验过程应注意些什么呢？

破碎你的菌后, 有上清也有沉淀, 分别跑电泳, 如果上清有目标蛋白, 沉淀没有那说明是可溶的, 如果沉淀也有, 说明两个都有, 但是看哪个更浓, 如果沉淀更多, 那应该是包涵体.

据说蛋白越纯越好复性, 所以我觉得应该先纯化再复性, 至于填料我们一直用我们公司的产品, 和进口没有什么差别, 我把我们的材料发给你一份, 里面很全面, 希望有所帮助.

206)我今天本打算试试你所说的分级沉淀法初纯包涵体，但仔细想想还是有点疑问，需要再请教你一下。 1、具体的操作步骤是不是应该用含8M尿素的buffer来超声破碎菌液沉淀，然后把上清用不含尿素的buffer来稀释呢？

2、稀释时是将上清分为几份分别稀释后离心，还是要先稀释到7M,离心，再把上清稀释为6M,依此类推呢？

3、比如说我稀释到3M时沉淀里的目的蛋白最纯，那我下面是应该选择含3M尿素的buffer洗涤包涵体，再用含8M尿素的buffer溶解沉淀；还是应该直接用含3M尿素的buffer溶解包涵体，离心后取上清用于下一步的纯化呢？

总之，我不太理解这样做的原理，还望不吝赐教，多谢！！！

1,一般都是破碎后再用变性剂溶解包涵体, 不是先加的. 溶解后的上清再分级沉淀. 2.是后面的那么操作,不是分几份.

3.应该是得到的沉淀用8M溶解后再纯化,3M不溶解怎么纯化呢.

不好意思，再问一下，那我是不是应该先用一小部分包涵体试一下，如果发现3M最纯就直接稀释到3M. 还是摸好条件后还要分级沉淀至3M呢？

另外，上清稀释后就可以直接离心吗？还是需要静置一段时间再离心呢？ 先试试,摸好了就直接稀释到那个浓度就可以了,一般最好静置一两个小时 每一步都要静置吗？那岂不是要很长时间？

207)Hitrap的脱盐柱如何使用？我的样品是否需要浓缩后到1.5ml的体积再上脱盐柱，然后接样品即为脱盐后的样品。

我不知道你的除盐柱是多大的柱子,一般除盐可以做到20-30%的柱床体积,你根据你的柱子可以算出你能除盐的体积,你的预装柱都有说明书教怎么用,很简单,用平衡缓冲液冲柱子3个床体积,然后上样,再用缓冲液冲,收集蛋白峰得到的就是不含盐的样品.

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208)1.我用酵母表达系统做肠三叶因子表达，如果用融合蛋白（c－myc）有利于纯化，但不知如何去除融合蛋白？2.如果不用融合蛋白，又不知如何纯化？

据说这样的融合蛋白不需要酶切,改变温度或pH就可以自动切去,除去还用原来的亲和柱就可以,你也许可以带his标签,这样不大影响你的蛋白的结构和活性,如果不是融合蛋白,那得看你蛋白特性,用疏水,离子交换等常规方法去纯化.

209)请问chromatography老师，蛋白质糖基化修饰后其纯化时的条件与修饰前会有什么样的改变？我用毕赤酵母表达的蛋白可能被糖基化了，而组织中该蛋白是非糖基化的，用组织中的提取条件怎么也不能将我表达的蛋白提纯，应怎么考虑，怎么办？

210)纯化糖蛋白可以用凝集素亲和或者硼酸亲和柱子去纯化,一般的蛋白不会被挂住.

211)我纯化的原核蛋白以可溶形式存在，但活性没有（含三对二硫键）。我看到一篇文章，发现蛋白经还原和烷基化处理后，活性出现。不知那位高手告知原因为何以及还原和烷基化的方法？

我怀疑是二硫键错配,所以没有活性,当还原后再烷基化,这样不会再形成二硫键,也许这样导致蛋白有活性,还原的方法很简单, 加巯基乙醇或者DTT, 搅拌, 就可以还原, 烷基化,应该是巯基的修饰剂,常用的有DTNB,PDS,PMB(参考<酶工程>中的酶修饰章节)

212)关于蛋白质分离提纯方面,蛋白质的测定除了凯式定氮外,还有那些比较新而且权威的方法,（BCA法过时了吗）?分离纯化时疏水层析,凝胶过滤,离子交换等方法梯度洗脱时,洗脱液浓度是怎样变化的? 我可不是什么前辈,我们一般用BCA比较多, 没有觉得过时, 好象很多人都用这个方法.

洗脱离子交换盐浓度由低到高,可以用梯度混合仪或者机器自己带的混合系统实现,当然也可以用阶段洗脱的方法,这样不需要专门设备,重现性好,很容易放大.

疏水和离子交换刚好相反,开始是高盐,洗脱是逐渐降低盐浓度,洗脱方式也可以用线性或者阶段洗脱. 213)我发酵液中的目的蛋白含量少，所以想在等电点进行硫酸铵沉淀，请教仁兄：是不是用酸碱把我的发酵液ＰＨ调到目的蛋白等电点，再进行硫酸铵沉淀就可以了？能用强酸强碱吗，有什么注意事项吗？ 如果你的目标蛋白含量太低不大适合用硫酸铵沉淀,当然你要调到等电点附近去沉淀也许能行,得试试才知道,不知道这样蛋白是不是有活性,你只有试试才知道,你电泳要不浓缩看不见目标蛋白的话,用这样的方法怕很难有好的结果.你也可以把pH调到等电点用冷的丙酮沉淀试试.最好用弱酸,醋酸等非用强酸也要用浓度低的溶液.注意事项应该在搅拌情况下缓慢滴加,避免局部浓度过高,此外沉淀对蛋白浓度是有要求的,太低不适合.

表达的蛋白如果有亲和标签的话,不需要浓缩可以直接上柱,柱子本身就可以浓缩富集你的目标蛋白,如果没有标签,用离子交换或者疏水都可以浓缩你的样品而且可以初步纯化.

214)我想请教一下，我现在提取植物中的一种酶，含量可能很低（GUS酶），我直接用提取液来提取，然后经过80％硫酸铵纯化，结果感觉特别粘稠。 是否多糖未除干净，有何简便的高招啊？

另外，跑聚丙烯酰胺凝胶电泳时发现跑的极其难看，很歪，而且是一开始浓缩胶的时候就跑的歪歪扭扭的。（看溴酚蓝指示）

最后染色是可以将所提取酶染成蓝色的一种染色剂，结果发现没有条带！真晕啊！ 我是第一次做蛋白相关的东西，请指教！

（GUS酶）是这个β-葡糖醛酸苷酶吗, 我怀疑没有提取好或者浓度太低所以电泳没有跑出来, 至于电泳开始就歪, 怀疑是你的样品溶解不好, 有沉淀或者盐干扰, 电泳最好先除盐, 此外浓度太低不能用硫酸

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铵沉淀, 我怀疑也许浓度低, 你要的也许还在沉淀上清里.多糖按理过离子交换柱子, 植物中的样品做得不多, 你多看看文献吧.

215)你好,我现在用的QAE A-25出现死吸附,不能再生,看看有什么好的方法,我用过的再生方法是2N 的NaOH，0.3N的酸、碱，还洗不下来就又用了0.5N的丙酮溶液(50%),还是不行,请教一下您还有什么高招吗?

那就用盐酸胍或者脲洗看看,也许变性沉淀了, 用通常的方法也许洗不下来. 也可以加点蛋白酶试试. 216)分子量700的化合物应该选择G-10 或G-15 ,如果是离子型的或用离子型交换剂可以除去杂质的话就用QAE 或DEAE, 不过工业生产建议用G,因为QAE或DEAE体积受酸碱及离子强度变化太大. 小分子物质最好别用凝胶过滤去分离,估计没有什么效果,除非是和很大分子的分离还可以,带电荷那就选离子交换,也可以选择反相

217)您好，我有一个非常头疼的问题请教：现在在装一根XK1.6cmx100cm长的superdex prep grad 75柱，系统使用的是AKTApurify100，用装柱器一次性装入胶体，柱效测得8850N/m，低于10000N/m的要求，但是由于流速1ml/min时压力逐渐升高我将在线滤器卸下，压力降低后再测柱效为何变成了5500N/m？还想问问您装柱头时是否不能压得过紧？技术支持说这样会导致峰前倾，我在最大流速3ml/min冲了1小时后将柱头压下6mm，测得的对称因子是1.75，低于0.3-1.3的要求，请问是否是因为我压胶过紧？ 还想问问您装这种极细长的凝胶柱除了将胶一次性倒入外到底还有哪些因素影响柱效？问了技术支持说没别的就得一遍遍装，逮到哪次算哪次，真是这样吗？柱子太大流速太慢，从装好到测完柱效要2、3天，所以急盼您的指点，非常感谢！

我觉得测定柱效是其中的一个方面,最重要的是跑个样品试试看,我觉得你装柱子的一个问题是在一次倒入填料后应该用最大流速去过柱子,等压力平稳后,你把柱子的转换头接上压紧,这样再用低于你最大流速的来操作,压力不会升高,柱床也不会变化,其实对于压紧的柱子也不一定需要重装, 你可以反冲, 这样压力一般就会平稳, 别太迷信柱效测定, 因为还是有误差的,如果装完的柱子柱子前后效率差这么多,那这个填料就不好用,但是填料本身应该没有问题,所以说不应该太相信这个东西, 我一般装完柱子根本不测柱效, 一样用,此外我觉得纯化也别过分依赖凝胶过滤, 装柱子时间长, 而费时间也长, 上样量也少, 其实成本很高,效率却不一定高. 能用别的方法就别用这个方法.

如果峰型不对称,那你要柱子中填料的面一定要平,这样才能保证你的峰型好. 218)我的蛋白酶分子量可能在300KD以上，可以用 可以用Sephadex G-25 Fine去除其中的盐份吗？

应该没有问题,蛋白不会沉淀或者过不了柱子的,它可以从填料的缝隙中过去,别担心,一样能用,如果不放心,那也可以用G50,你先试试就知道了.

219)我正在做蛋白活性的分析，需用空载体PET28B-HIS 蛋白 作为空对照，但是它太小了怎样才能得到呢?

抱歉,我不是做上游的,我觉得你可以随便找一个带his标签蛋白,它肯定没有你目标蛋白的活性,这样做对照就可以了.

220)现有一个困扰我多时的问题向您请教。我们的蛋白以包涵体形式在E.coli中表达，利用SP-sepharose FF纯化时，在梯度10%-100%都有目的蛋白被洗脱。请问您是否遇到过这种情况，据您考虑这是什么原因。非常感谢。

这个我没有做过，我觉得变性条件下蛋白特性和普通不一样也许造成这样的结果，你可以参考包涵体清洗，那样就可以得到比较纯的蛋白，我觉得在变性条件下，非亲和的方法很难做好纯化．

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221)神经细胞膜N－甲基－D－天冬氨酸受体蛋白纯化的技术路线及关键点的指导，有功能活性，量少就可以，105KD的复合蛋白，用抗体结合柱子是否需要抗体量很大？ 洗耳恭听！

抗体肯定需要很多的，一般每ml偶联抗体应该在１０－２０mg，那需要２０－３０mg抗体，抗体也不便宜，你这样不如直接把N－甲基－D－天冬氨酸或者天冬氨酸偶联到填料上做成亲和填料，然后用这两物质竞争洗脱也许更好一点．你可以试试，如果天冬氨酸可以那就更简单，我们公司可以帮你合成，或者提供活化好的介质自己偶联．

222)我现在用glutathione sepharose 4B纯化原核表达的GST融合蛋白(可溶性的），目的蛋白大小47KD,pI=9.9, 但是纯化后在融合蛋白（73KD）下面60KD左右 处有一条含量较多的带，并且在50KD左右,40KD左右,26KD处都有很清晰的带，我裂解细菌时加了PMSF，纯化过程是照说明做的，PBS洗的次数超过说明书的用量，还有一次加了1%的Tritonx-100,用还原型谷胱甘肽洗脱的pH=8.0 ,总共做了三次，但每次结果都一样，目的蛋白只占1/8左右，我的要求也不是很高，最起码也要60%就可了，但为什么那么多杂带呢？很郁闷，请搂主帮帮我，谢谢！

怀疑是降解或者表达后自己降解或者破碎时候条件剧烈而断裂，所以有好几条带，你可以用GST抗体做WB试试，你也而已用不同浓度原型谷胱甘肽洗脱看能不能得到更好的结果．

您说的降解的问题我也考虑过，但是我超声的时候加了PMSF,是不是还需要加别的东西，表达后降解如何避免呢？我用GST 以及目的蛋白做了WB,但我的这两个抗体都是多抗，做出来都有带，特异性不是很好。 您说的不同浓度原型谷胱甘肽洗脱，我可以试试。您还有什么建议，请不吝赐教，非常感谢。 别客气,超声如果时间过长或者强度比较大,那也可以使蛋白断裂,杂带增加,所以你可以试试缩短点时间,这种断裂加PMF也没有用.此外由于GST纯化用的填料本身也是有离子交换作用的,因此在缓冲液中适当加0.5M NaCl可以降低非特异吸附,使杂带减少.

我还有一点不明白，您说的（缓冲液中适当加0.5M NaCl），其中缓冲也是指用来平衡柱子的缓冲液吗？还是指超声时的缓冲液？还是洗脱时的缓冲液，对不起，我没有很好的理解您的意思。再次让您费心了。谢谢！

抱歉是我没有说清楚.是平衡缓冲液,洗脱可以不加

我已经照您以上的意见作了，但结果还是一样，请问我该怎么办啊？求求您帮帮我！

那也许本身你表达出来已经降解或者象他们说的非完全表达,那这样是上游的问题,所以最好是能确定问题出在哪里.实在不行没有办法从上游解决,亲和一步也解决不了.你只好用离子交换,凝胶过滤或者疏水做进一步纯化

223)我的物质也是个小分子,分子量800左右的一个修饰过的肽.用凝胶过滤除不去带色杂质,用QAE 或DEAE就去除的很好,可是带色的杂质在柱子上就洗不下来了.

那可以用低浓度酸碱去洗，应该可以洗下来，如果还洗不下来用５０－７０％的乙醇试试．

224)请问亲和层析样品上柱之后目的蛋白洗脱不下来怎么办？我按照文献上面的方法，用pH4.0，1M NaCL的醋酸缓冲液洗脱，杂蛋白可以洗下来，但是目的酶跑电泳检测和酶活检测都没有，并且平衡缓冲液冲出的杂蛋白也没有目的酶。所以我怀疑是吸附在柱子上没洗掉，又用含10％DMSO的洗脱液洗，还是没有。请帮忙指点一下该怎么办？

用更高浓度的盐,更低pH试试,此外也可以用一点变性剂如1-2M脲试试,加DMSO要小心变性蛋白沉淀 225)我是一个新手,刚开始做RP-HPLC纯化蛋白.我想请教一下

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1.进样峰大是什么原因呢?尽管进样前已用约10-15倍柱体积的5%bufferA(0.1%TFA)去平衡柱子了. 2.用vydac c4的柱子纯化lysozyme标准品(SIGMA),上样量为100ug时总有多个峰,改为30ug时就只剩下一个峰;但将浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰.这是为什么呢? 谢谢!

我没有做过几次HPLC分析蛋白,进样峰大也许还是样品本身的问题,你可以直接用缓冲液或者水试试,看看是不是也这样.

后面的问题我不明白浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰是什么意思,是洗脱梯度吧,我想如果是这样,那也许是上样浓度过高,而你的洗脱有机溶剂浓度高溶解不好吧,仅供参考

226)请教chromatography大哥, 我欲纯化精浆蛋白(前列腺特异抗原),前面的同仁最初试过从精液中提取纯化,但据说跑出来的带分子量不对,请问这是怎麽回事?谢谢!

我不知道在哪里看过这个蛋白的纯化,好象是用亲和的方法,分子量不对差多少,仅靠分子量是不行的,最好有活性测定的方法.

227)请教chromatography兄，我欲纯化一个分子量16K的蛋白，pI5.5-6.0,为什么很多文献中提到的纯化方法是用阳离子柱，缓冲液pH7.0,那样的话，蛋白不就带负电荷了吗？还有，我用酵母表达该蛋白，试用Q柱纯化时，色素大部分结合到柱上，不知道该怎么办？

用阳柱是不是主要去杂质的，色素不和你蛋白下来没有关系，最后可以用00.5MNaOH+2MNaCl洗看能不能洗掉。

228)还有个问题就是我做的工作是将鼠抗体人源化,肯定要用到大量抗原来筛库,前面人纯化的精浆蛋白是不够的,有人告诉我将剩下的精浆蛋白在原核中表达,会比从前列腺组织块中提取快,而且量也多,但有人说这样复杂,时间也长,我不知究竟该如何?请赐教!

我觉得如果在前列腺组织块含量高就不需要表达，如果不高那就表达，但是我觉得最简单的方法还是提取，毕竟表达也天然的蛋白有时候是不一样的，何况也不是所有的表达都好做，所以我觉得能提取还是提取的好。

229)请教chromatography兄，我是一个新手，欲纯化一个嗜盐性的酶，该酶至少需1M的Nacl才能有活性，请问我该如何设计纯化方案？

那只好用疏水了，我记得当初中科院微生物所的我的校友用的就是我们的苯基琼脂糖凝胶，硫酸铵沉淀，过疏水．

230)我的（101kd）在上清中我已把它纯化，但有条杂带（30kd），请问我如何去掉杂带？如果用DEAE-52层析柱，我容蛋白的buffer(50mMNaH2po4 100mMNacl 250mMimidalole)，Nacl浓度是不是太高了，如何处理？

我要做分子筛，针对线粒体蛋白，能给我一些建议吗？贵公司能否提供？ 谢谢。

最好优化你的纯化条件，没有必要再去做别的纯化，实在没有办法再做，否则浪费时间不说就怕效果也不一定好，何况凝胶过滤处理量很小，不知道你用的什么方法纯化的，线粒体蛋白分子量有多大，杂质有多大．线粒体蛋白有什么特性．

231)我有一个GST融合蛋白，分子量大概60KD，经亲和层析纯化后，SDS电泳检测，有3条主要的蛋白带（也有其他的杂蛋白带），最浓的是我得目的蛋白，但是另外两条带的浓度也很大，这两条带的大小加起来差不多是目的蛋白的大小。试了两次都这样。我想请问这到底怎么回事？是目的蛋白降解的还是其他的杂蛋白？如果是降解的，如何确定？为什么亲和纯化效果会这么差那？

我是蛋白领域的生手，正在为这个问题困扰不安，正好发现了chromatography 的帖子，请多指教！我已

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