实验材料与方法模板

1 材料与方法 1.1实验材料

1.2实验方法

1.2.1 MjCBP RNA水平组织分布和表达模式 1.2.2 MjCBP的克隆，重组表达载体的构建 1.2.3 MjCBP蛋白的重组表达、纯化 （1.2.4 MjCBP多克隆抗体制备）

（1.2.5 MjCBP蛋白水平组织分布、表达模式） 1.2.6 干扰后弧菌清除实验，过表达后弧菌清除实验

2 实验结果 2.1 进化树

2.2 组织分布和表达模式 2.3 纯化

2.4 弧菌刺激 血、肠 进化树

使用ClustalW1.8 软件, 将剑尾鱼P-gp 推断的氨基酸序列与GenBank 中登录的其他动物P-gp 进行多序列比对, 采用MEGA4.0 软件包进行构建系统树。

用NCBI BALST(http：//blast．ncbi．nlm．nih．gov／blast．cgi)、ExPASy_ProtParam(http：／／web．expasy．org／protpa—ram／)、PredictProtein(http：／／www．predictprotein．org／)、SignalP 4．1 Server(http：／／www．cbs．dtu．dk／cgi—bin／1和NCBI CDD(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Structure／cdd／)等在线工具对猪MNSF[3的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析

用DNAMAN软件对猪MNSF[3与人、小鼠等18个物种的MNSFl3进行蛋白相似性分析和进化树分析。

猪MNSFl3与其他物种MNSFIB的同源性分析利用NCBI BLAST在GenBank中搜索不同物种MNSFl3的同源序列，用DNAMAN软件对克隆得到的猪MNSFl3与18个不同物种的MNSFp蛋白序列进行相似性比对并绘制MNSFIB蛋白无根进化树。在蛋白水平上，猪MNSFl5与其他18个物种的相似性在91．73％～97．74％之间，与小鼠MNSFl3蛋白相似性最高，达到97．74％，与人的MNSFl3蛋白相似性为93．98％(附表1)。MNSFl3蛋白的无根进化树分析结果显示猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、绵羊(Ovisaries)、虎鲸(Orcinus orca)和宽吻海豚(Tursiops truncatus)可聚成一类，亲缘关系较近。在所有比较的物种中其进化距离都小于o．05，说明MNSFl3在不同物种间高度保守(附图2)。

从转录组文库中获取得到橘小实蝇8个Rab基因的核苷酸序列信息。用DNAman完成核苷酸序列编辑及氨基酸序列推导。通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点的BLASTX 0attp：／／www．nebi．nlm．nih．gov)查找各Rab基因的高相似性序列。用ClustalX 2．0对橘小实蝇Rab家族基因氨基酸序列进行多重比对，分析其保守性，揭示其活性位点。用MEGA5．0软件neighbor-joining方法对8个Rab基因构建进化树，根据bootstrap方法用1000个重复进行统计分析。

从NCBI中查找到的与橘小实蝇BdRabl氨基酸序列相似度较高的Rabl氨基酸序列所对应的不同昆虫，其中图3—2从上到下依次为欧洲熊蜂、印度跳蚁、顶端切叶蚁、佛罗里达弓背蚁、丽蝇蛹集金小蜂、赤拟谷盗、埃及伊蚊、橘小实蝇、黑腹果蝇、木槿曼粉蚧。其中橘小实蝇BdRabl与黑腹果蝇DmRabl进化距离最近。 组织分布

用实时荧光定量RT-PCR 法进行了P-gp 基因的组织分布

按照 QIAGEN RNeasy Mini Kit 试剂盒分别提取1.1 中保存的每尾剑尾鱼8 种组织总RNA, 每份RNA 作为１个样本, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性, 用核酸蛋白测定仪测定RNA样品的浓度和纯度。采用 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit进行反转录合成cDNA 模板。

荧光定量PCR在ABI 7500 (Applied Biosystems)实时荧光定量PCR仪进行, 目的基因的定量PCR引物序列(表1)。反应体系为20 μL: SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ(2×) 10 μL, ROX Reference Dye II (50×)0.4 μL, 20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL, cDNA 1 μL,加双蒸水补足反应总体积为20 μL。反应条件为: 95℃预变性30s; 然后95℃ 5s, 60℃ 34s, 扩增40个循环,60℃延伸时采集荧光信号, 反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析, 以确保特异性扩增。样本和内参分别设3个重复, 以β-actin作为内参基因校正实验误差。采用相对2?ΔΔCt法进行P-gp mRNA 在剑尾鱼各组织器官中的表达分析。结果用Excel软件进行计算和单因素方差分析,实验数据用平均值表示。

P-gp 基因在剑尾鱼不同组织分布的实时荧光定量检测

以 QSFPGP 为引物, 剑尾鱼心、肝、脾、肾、脑、肌肉、鳃、眼睛8 个样本cDNA 为模板, β-actin为内参基因,应用荧光定量RT-PCR 方法研究剑尾鱼P-gp mRNA 的组织器官表达特征(图2)。结果表明剑尾鱼P-gp mRNA 在8 种组织中均有表达, 在肝、脑的表达量显著高于其他几个组织, 其次是肾和眼睛, 脾中P-gp mRNA 表达量最低。方差分析结果表明, 肝与脑P-gp mRNA 表达量之间差异显著(P<0.05), 肝和脑与其他6 个组织部位之间存在着极显著差异(P<0.001), 而肌肉和鳃(P=0.053)、肾和眼睛(P=0.102) P-gp mRNA 表达量无显著差异。剑尾鱼各组织P-gp mRNA 表达量依次为肝>脑>肾>眼睛>肌肉>鳃>心>脾。

实时荧光定量PCR，是指在PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对起始模板进行定量及定性分析的方法。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR

反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

以2.1.4.3.2 生成的cDNA 链为模板，使用表2-1 中的引物，以表2-2 中的体系和程序在iCycler iQ Multicolor 荧光定量PCR 仪上进行PCR 扩增。PCR 结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

如图2-1 所示，经Trizol 法提取各种时期的胚胎及成体斑马鱼脏器的RNA，标号1 为肝脏的RNA；2 为脾脏；3 为肾脏；4 为心脏；5 为30hpf 的胚胎及6 为60hpf的胚胎。其中28s,18s,5s 三条条带都比较清晰，无明显DNA 污染，无明显降解条带，表明总RNA 提取比较成功。用Hox 基因和?-actin 定量PCR 引物扩增斑马鱼cDNA 模板。PCR 产物经电泳检测后可见大小介于200-500bp 的特异性目的条带，与设计的片段大小相符。通过溶解曲线分析发现cDNA 的PCR 产物呈现单一峰。计算ΔCt：ΔCt=Ct (靶基因)－Ct (?-actin)。该实验的靶基因分别为肝脏、脾脏、肾脏、心脏、30hpf 胚胎及60hpf 胚胎中的Hox 基因。按照2.1.4.3.3 的实验方法，分别对41 个Hox 基因在30hpf 胚胎、60hpf 胚胎及成鱼肝脏、脾脏、心脏及肾脏中的mRNA 表达水平进行检测。结果如表2-3 显示

采用Trizol法提取猪不同组织的总RNA，反转录得到cDNA，根据已克隆的猪MNSFfl全长cDNA序列，设计RT-qPCR特异性引物。上游引物P5：5’．CTTGGAGGTAAAGTTCAT-3’；下游引物P6：57一TATTGcATAcGTcTcTTG．3’。以

猪

p-actin

基

因

序

列

为模

板

设

计

内参

引

物

13-actin．F(5’．GGATGCA．GAAGGAGATCACG-3’)和13-actin-R(5’一CTCGTCG—TACTCCTGCTTGC．3’)。用RT-qPCR检测猪MNSFl3在各组织中的相对表达量。20此反应体系：cDNA模板2此，上下游引物混合液0．2“L(20 pmol／I．tL)，SYBRgreen Real—time PCR master mix 1 0 laL，加ddH20至20 pL。PCR扩增程序：95℃3 min；95℃10 S，55℃30 S，40个循环；最后为溶解反应，试验重复3次，使用Bio．Rad IQ5软件对RT-qPCR试验数据进行统计分析。

实时荧光定量PCR结果显示，猪MNSFfl在肝脏中表达量最高，其次是扁桃体和肾脏，在心脏、脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结、腹股沟浅淋巴结和下颌淋巴结中低水平表达，在肺脏中未检测到表达(图5)。

橘小实蝇转录组文库显示的参与发育和繁殖相关的8个差异表达基因分别是Jonah 44E1 Trypsin、AKT,mediator complex，hormone receptor 3，Broad，Rab7、ACPl。根据转录组测序信息设计目的基因的荧光引物，以非差异表达基因technical knockout作为对照基因，以橘小实蝇16S rRNA作为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测各基因的表达情况。

实时荧光定量PCR用iQTM SYBR@Green Supermix(Bio．Rad，usa)试剂盒在Bio—Rad iQ5双色实时荧光定量PCR仪上进行。每个样品设三个重复，根据需要设置相应空白对照，PCR总体系为lOul。荧光定量PCR结束后分析溶解曲线，以确保特异性扩增。实时荧光定量PCR结果由Optieon Monitor软件2．03Version(MJ research，USA)量值2-a ct方法分析，以1 6S rRNA表达量校正目的基因的相对表达量。

半定量 RT- PCR 根据已获得的围食膜蛋 白基因序列设计引物( PT1: 5'- ACAAGCCTT- CACTCGCCAC- 3'; PT2: 5'- TCGAATACCATG- CCATCTG- 3') ， 该引物用于感染 IHHNV 和抗感 染IHHNV 对虾肠道 肝胰腺等组织表达谱的研究， 设 立 内 参 - actin ( 引 物 序 列 为 actin1: 5'- CGAGAAATCGTTCGTGAC- 3'和 actin2: 5'- GATG- GAGTTGTAGGTGGTCT- 3') 半定量 RT- PCR 的 扩增体系为 cDNA 1 L， 10 mol /L 的上 下游引

体内清除实验

将约为7 g的对虾分成3组,每组18只。将冻存的重组蛋白溶液于PBS中透析,调整其浓度为400μg/mL。将500μL蛋白溶液与鳗弧菌(共4xl08个细胞，重悬于PBS中)混合置于28°C轻摇30 min,BSA和PBS作为蛋白的对照，也进行同样的处理。

将每组中蛋白与细菌的混合物50μL分别注射入对虾腹节内,因此每只虾注射的蛋白为10μg,细菌为2x10个。在2 min、5 min、10 min、30 min、1h和3h时,从3只对虾内抽取500μL血淋巴,将其与等体积抗凝剂混勾。将混合物以灭菌PBS稀释1000倍,取30μL样品涂布2216E平板(0.5%胰蛋白胨,0.1%酵母提取物,0.1tCl3,1.5%琼脂,2.4%海盐)。平板于37°C培养过夜后,对菌落计数,并计算细菌残留率(不同时间点时细菌数量/注射1 min时细菌数量)。

在抗体封闭实验中,选取6只虾,其中3只分别注射50μL兔FcLec4抗血清,另3只注射等量兔免疫前血清。注射1h后,每只虾注射2xl07个鳗弧菌。30 min后,抽血并计细菌数,计算残留率。实验重复3次,结果进行t-检验,当P<0.05时视为显著性差异。

FcLec4重组蛋白可加快机体对鳗弧菌的清除速度

7

由于FcLec4重组蛋白可以紧密结合于鳗弧菌表面,我们检测了其在体内的可能作用。将细菌与蛋白事先孵育,注射入对虾体内,然后检测蛋白对于细菌清除作用的影响。结果发现,如图3.8A所示,在FcLec4、BSA和PBS三组中,细菌清除速度在3 h内完成。在刚注射后,三组并没有明显差异。而在5min后,实验组的细菌数量(残留率)明显低于两个对照组,说明本组清除作用更为有效。在注射后1h时,实验组中将近95%的细菌都被清除,而相同的效果在对照组中知道3 h时才能达到。

另外,应用抗血清封闭对虾体内的天然蛋白,可以发现,在注射细菌30min后,实验组的清除速度要慢于对照组(图3.8B)。这些结果说明FcLec4能够促进对虾机体对于鳗弧菌的清除作用。

蛋白纯化

FcLec3重组蛋白的表达和纯化

设计一对编码FcLec3成熟肽的引物FcLec3mF (5'- TAC TCA GAA TTC GAA GTA GAG TAC TGT CCA TC -3')和 FcLec3mR (5'- TAC TCA GCG GCC GCC TAG TCG GTC CCG AGA TCC AC -3'),下划线分别为EcoRI和NotI酶切位点。采用该对引物扩增得到目的片段后，将其与己有的pET-30a(+)质粒分别进行双酶切，酶切体系为lO×H Buffer 2μL，BamHI 1μL, XhoI 1μL,片段/质粒10/6μL，补水至20μL。将酶切产物分别采用胶回收和PCR产物试剂盒进行回收。将回收后产物进行连接，连接体系为片段6.5μL ,载体2μL, T4 DNAligase 0.5μL, lO×ligation buffer 1μL, 16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞阳性克隆筛选及确认同上。

将阳性菌株进行试表达。过程如下：过夜培养液以1: 100比例接入3 mL新鲜LB培养基(内含0.1 mg/mL卡那霉素)于37℃振荡培养3 h。取出少许菌液为对照，向剩余菌液中加入IPTG至终浓度为0.1、0.2、0.5和1 mM，置于37°C

和28°C继续振荡培养。将诱导前后的菌液离心，沉淀以磷酸盐缓冲液(PBS:140 mM NaCl, 2.7 mM KCl,10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH7.4)重悬，每100μL加入 5×SDS-PAGE Loading Buffer 30μL，10% SDS 溶液10μL和疏基乙醇10μL，沸水浴5 min处理。另外，将剩余重悬菌液加入Triton X-100至终浓度0.2%,于冰浴中超声破碎细胞，超声2s、间歇2s,全程3min，后于4°C 10,000 rpm离心10min将上清和沉淀样品分别处理。将所有样品进行12.5%SDS-PAGE电泳检测，选择较好的表达菌株和条件，确定蛋白表达的形式。将选定菌种于-80°C保存。

取过夜培养的活化菌液，以1: 100比例接入200 mL新鲜LB培养基(内含0.1 mg/mL卡那霉素),按己确定条件进行大规模表达及破碎细胞。将破碎后沉淀以 Buffer A (50 mM Tris-HCl，5 mM EDTA，pH 8.0 )和 Buffer B (50 mM Tris-HCl,5 mM EDTA，2M脲，pH 8.0)交替洗漆两次，洗漆条件为充分悬起振荡后于4°C 12,000 rpm离心20 min,去上清。将沉淀以buffer C (0.1 M NaH2P04，lOmM Tris-HCl，8M 脲，pH 8.0)充分悬起于37℃以 200 rpm 快速震荡1h。于4°C 12,000rpm离心20min，收集上清待纯化。

将适量蛋白样品缓慢流通己用buffer C平衡的亲和层析柱；再次加入10倍柱体积buffer C平衡；加入6倍柱体积的buffer D (0.1M NaH2PO4,10 mM Tris-HCl，8M脲，lOmM咪挫，pH8.0)洗涤非特异性结合蛋白；加入6倍柱体积的buffer E(0.1M NaH2PO4,10mM Tris-HCl，8M脲，0.25M咪唑，pH8.0)洗涤蛋白，分管收集并以Bradford法测定蛋白含量,进行电泳检测。

将纯化后蛋白样品于100倍体积透析液(0.1M Tris-HCl，5mM EDTA，5 mM L型半胱氨酸，10%甘油，pH8.0)中于4°C透析复性于16h，重复两次。将复性后样品于4°C 12,000 rpm离心20 min后以聚乙二醇20000浓缩蛋白，测定蛋白含量后，将蛋白样品分装储存于-80°C待用。

rMjLTL1和PET30A在大肠杆菌中重组表达与纯化

为了得到重组表达的rMjLTL1，我们用引物MjLTL1 ExF和 MjLTL1 ExR （分别含有Bam HI and Sal I酶切位点，Table1）进行PCR，扩增得到编码MjLTL1结构域的片段，用T4连接酶克隆到pET30a (+)（用Bam HI and Sal I进行双酶切并回收）原核表达载体上转化克隆菌株大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pET30a-MjLTL1并转化表达菌株E. coli BL21 (DE3)。含有重组质粒的表达菌在37°C、0.4 mM IPTG进行诱导表达重组蛋白。经检测rMjLTL1是以包涵体的形式表达，纯化方法参考本实验室之前的方法(Du et al., 2006)。我们将空载体 PET30A (含有 His-tag) 转入E. coli BL21 (DE3)并进行诱导表达并纯化，诱导条件是0.4 mM IPTG、37 °C，纯化得到的蛋白用于做为对照。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/lba3.html