芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定

实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定

一、实验目的

掌握各种培养基的配制方法；

理解选育营养缺陷突变株的选育原理；

掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法； 获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。 二、实验原理

营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。

筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、

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鉴定缺陷型。

1.诱变处理

基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。

亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用

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1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。 2.淘汰野生型

诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。

菌丝过滤法：该方法只适用于真菌，在基本培养基中野生型孢子可以发育成菌丝体，而突变型的不可以，这样经诱变后的孢子在基本培养基中培养一段时间后过滤，重复几次后就可达到浓缩突变型菌体的作用。

抗生素法：是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型不能生长，将诱变处理液在基本培养基中培养让野生型生长一周，而缺陷型无法生长，加入一定量的抗生素，使活化的野生型杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 高温杀菌法：本实验利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。 3.营养缺陷型的检出

营养缺陷性的检出方法包括影印法、夹层法、限量补充法、逐个检出法。

影印法：先将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。在完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。将基本培养

基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。然后将CM和MM在恒温箱中培养。在两平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。

夹层法：先在培养皿上倒一层基本固体培养基，凝固后涂上一层含菌的基本固体培养基，凝固后再倒一薄层基本固体培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层完全固体培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。

限量补充法：方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。

逐个检出法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到

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基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。 4.鉴定营养缺陷型菌株

鉴定营养缺陷型一般采用生长谱法。

生长谱法：指在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况。

其原理是：在缺乏某种营养物质的，含有指示剂的培养基上接入某种微生物，再在接菌平板上置入这种营养物质，经一定条件培养后，即可通过指示剂变化情况来判断对不同营养物质的利用情况。该法可以定性，定量地测定微生物对各种营养物质的要求，在微生物育种，营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。 三、实验材料及仪器

3.1菌种：枯草芽孢杆菌。 3.2 培养基

3.2.1 细菌完全培养基 葡萄糖 0.5 g 牛肉膏 0.3 g 酵母膏 0.3 g 蛋白胨 1 g

MgSO4·7H2O 0.2 g 蒸馏水 100 mL

pH 7.2 100 Pa 灭菌20min。 3.2.2 细菌基本培养基 葡萄糖 0.5 g (NH4)2SO4 0.2 g 柠檬酸钠 0.1 g MgSO4·7H2O 0.02 g K2HPO4 0.4 g KH2PO4 0.6 g 重蒸水 100 mL

pH 7.2 100 Pa 灭菌20 min。

配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂，全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水

或重蒸水冲洗2~3 次。 3.2.3 无氮基本培养基

在基本培养基中不加(NH4)2SO4 和琼脂。 3.2.4. 二倍氮源基本培养基

在基本培养基中，加入2 倍(NH4)2SO4，不加琼脂。 3.2.5. 补充培养基(限制培养基)

向配制好的液体基本培养基中加入0.1-0.5%的完全培养基，加入2%的琼脂。

注：配制基本培养基的药品均用分析纯，使用的器皿应洁净，需用蒸馏水冲洗2~3 次，必要时用重蒸水冲洗。 3.3溶液

3.3.1. 部分氨基酸组合液

另取20 种氨基酸按表1 组合成9 组氨基酸混合液。1~5 组每组含4 种氨基酸，6~9 组每组含5 种氨基酸，添加至基本培养基后，使每种氨基酸同时在两组中出现，供营养缺陷型标记确认用。

表 1 氨基酸不同组合表

3.3.2. 青霉素溶液 10 000 u/mL。 3.3.3. 其他溶液

磷酸缓冲液(pH 6.0，0.2 mol/L)、生理盐水、硫代硫酸钠溶液（0.5 mol/L)、亚硝基胍溶液（0.5mg/mL)。

（1）0.5 mol/L 硫代硫酸钠溶液(浸泡沾染过NTG 的破璃器皿)

称取124 g 硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)，溶于蒸馏水中，定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，保存备用。

（2） 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 5.8、pH 6.0、pH 7.4)

Na2HPO4·2H2O 相对分子质量为178.05，0.2 mol/L 溶液含35.61 g/L，称取35.61 g Na2HPO4·2H2O ，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。

NaH2PO4·H2O 相对分子质量为138.01，0.2 mol/L 溶液含27.6 g/L，称取27.6 g NaH2PO4·H2O ，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。

3.4 仪器

台式离心机、旋涡混合器、恒温培养箱、电炉等。

无菌移液管、无菌试管、无菌离心管、无菌锥形瓶、无菌培养皿、无菌玻璃涂棒、无菌牙签或插有大头针的无菌软木塞、稀释分离、平皿菌落计数所需的无菌生理盐水和无菌器皿等。 四、实验步骤 (一) 诱变处理 1. 前培养

取新活化的棒杆菌T6-13 斜面菌种—环，接入盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养14~16 h，再取1mL 培养液转接于另一盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养4~6h，使细胞处于对数生长期。 2. 菌悬液制备

取10 mL 培养液于无菌离心管中，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，打匀管底菌团，加入5mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液，摇匀后倒入盛有45 mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲

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液并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中，振荡10 min，调整细胞浓度为5×10个/mL，用完全培养基平板菌落计数法测定总菌数。 3. 诱变处理 (1) 称取0.5 mg NTG 于无菌离心管中，再加0.05mL 甲酰胺助溶，然后加入0.2 mol/LpH 6.0 磷酸缓冲液1mL，使完全溶解，用黑纸包好在30℃水浴中保温(临用时配制)。

NTG 是一种超诱变剂，需小心操作。称量药品时，戴好塑料手套和口罩，称量纸用完后立即烧毁；取样需用橡皮头的移液管，绝不能直接用嘴吸，接触沾染有NTG 的称液管、离心管、锥形瓶等玻璃器皿，需浸泡于0. 5 mol/L 硫代硫酸钠溶液中，置通风处过夜，然后再用水充分冲洗；溶液外溢时，用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布擦洗；诱变处理后含NTG 的磷酸缓冲液及稀释液，立即倒入浓NaOH 溶液中，若手接触NTG，应立即用水冲洗。NTG 在可见光下会放出NO，使溶液颜色由土黄色变为黄绿色，故应放在棕色瓶中保存。

(2) 取4 mL 细胞悬浮液(5×108 个/mL 左右)加入上述离心管中，充分混匀，立即置30℃水浴振荡处理30 min(NTG 处理终浓度为100 ug/mL)后，离心收集菌体，将含NTG 的上清液倒入浓NaoH 溶液中弃去，用无菌水洗涤菌体3 次，以大量稀释法终止NTG 的诱变作用。最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水，摇匀后从中取出0.5 mL NTG 处理后的菌悬液，用4.5 mL 生理盐水稀释至10-3 稀释度。用倾注分离法在完全培养基平板上进行存活菌计数，每个稀释度做三个平皿，计算杀菌率。 4. 中间培养

将1 mL 诱变处理洗涤过的菌液，加入装有20 mL 完全培养基的250 ml 锥形瓶中，30℃振荡培养过夜(时间不宜太长，否则同一种突变株增殖过多)。 (二) 淘汰野生型(青霉素法) 1. 饥饿培养 取10 mL 中间培养液，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体3 次，加到无氮源的基本培养基中，30℃振荡培养4~6 h。 2. 加青霉素

将上述经饥饿培养的菌液，3500 r/min 离心10 min，加到二倍氮源20 mL 基本培养基中，

30℃振荡培养3~4 h，待野生型细胞刚进入对数生长期，对于G+菌加入青霉素的终浓度一般为50~100 u/mL，对于G-加入青霉素的终浓度为500 u/mL(青霉素母液过滤除菌后加入)。若在加青霉索同时，加入无菌的20%蔗糖和0.2% MgSO4(高渗透压培养液可防止野生型菌株因青霉素处理细胞壁裂解后原生质体涨破而提供营养缺陷型突变株营养物质)，再继续培养5~6 h，达到淘汰野生型、浓缩缺陷型目的。 3. 制备悬液

取10 mL 上述菌液，3500 r/min 离心10 min。弃上清液，菌体用生理盐水洗涤一次，再加10 mL 生理盐水制备菌悬液。

用NTG 作诱变剂，突变率大，进行营养缺陷型突变株筛选时，可以不经中间培养和淘汰野生型步骤。诱变处理后经生理盐水洗涤和稀释的菌悬液，可直接进行营养缺陷型捡出。 (三) 营养缺陷型检出 1. 涂布菌悬液

各取0.1 mL 菌悬液，涂布于完全培养基和补充培养基平板上，各涂布10 个平皿，30℃培养36~48h。在补充培养基上生长的大菌落为野生型，小菌落为缺陷型，挑出小菌落直接进行营养缺陷型鉴定。完全培养基平板上长出的菌落再用逐个检出法检出缺陷型。 2. 制备平板

制备完全培养基平板和基本培养基平板，在平板底面可沾上一张划有36 个方格的硬纸片（如图1）。 3. 接种

用灭菌牙签或灭菌大头针从完全培养基平板或补充培养基平板上逐个挑取菌落或小菌落，对应点接种在基本培养基平板和完全培养基平板上。注意应先点接种基本培养基平板，后点接种完全培养基平板，接种量应少些。30℃培养48 h，在完全培养基平板上生长，而在基本培养基平板的对应位置不长的菌落，可能是营养缺陷型菌株（如图2）。将其接种于完全培养基斜面，30℃培养24 h，作为营养缺陷型鉴定用菌株。

图2 逐个检出法示意图

[+]完全培养基； [-]基本培养基

(四) 营养缺陷缺陷型菌株鉴定（营养缺陷型生长谱法鉴定） 所得菌株的营养缺陷型可能是氨基酸缺陷型、核酸碱基缺陷型、维生素缺陷型或双重营养缺陷型，氨基酸缺陷型较为常见。

(1)挑取可能为营养缺陷型的菌种在完全培养基平板上37℃扩大培养48h。 (2)用接种环挑取培养的营养缺陷型菌于10ml无菌生理盐水中制成菌悬液。

(3) 取1ml待鉴定营养缺陷型菌悬液，涂布于基本培养基上，用蘸有不同氨基酸混合液（氨基酸浓度均为10mg/mL）的9种无菌滤纸片覆盖其上，28℃培养2~3天，观察滤纸片表面菌落情况，据此判断突变株的营养缺陷型。 五、实验结果

(一) 记录并计算NTG 处理后的杀菌率。

（二）NTG 处理后的杀菌率

（三）营养缺陷型菌株的鉴定结果。 六、注意事项

NTG是超诱变剂，也是致癌因子，操作时要特别注意 ：

1.称量药品时，戴好塑料手套和口罩，称量纸用完后立即烧毁；

2.取样需用橡皮头的移液管，绝不能直接用嘴吸，接触沾染有NTG 的称液管、离心管、锥形瓶等玻璃器皿，需浸泡于0.5mol/L 硫代硫酸钠溶液中，置通风处过夜，然后再用水充分冲洗；

3.溶液外溢时，用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布擦洗；

4.诱变处理后含NTG的磷酸缓冲液及稀释液，立即倒入浓NaOH溶液中，若手接触NTG，应立即用水冲洗。

5.NTG在可见光下会放出NO，使溶液颜色由土黄色变为黄绿色，故应放在棕色瓶中保存。

参考文献：

[1]杜连祥.工业微生物学实验技术，天津科学技术出版社，1992,172-193. [2]宋德贵，黄鹤.卡那霉素链霉菌营养缺陷型菌株的筛选，广西师范大学学报，1989,7（1），59-62.

[3]诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994,384-406.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/l8mf.html