水稻原生质体分离及转化
更新时间:2024-06-19 11:45:01 阅读量: 综合文库 文档下载
水稻原生质体分离及转化
作者:植物逆境与光合实验室 | 发表日期:2014-04-11
实验目的:用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验
实验材料和试剂:
生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网(20 mm×20 mm)、离心机、摇床等。
溶液的配制: 母液的配制:
1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA
[Fluka PEG 4000 81240]
以下如有上述母液,则都是使用的母液
酶解液:20 mL ×2 MES 0.5
mL 1 mL Mannitol 7.5 mL 15 mL Cellucose(纤维素酶) 0.15 g 0.3 g Macerozyme(离析酶) g ddH2O mL 55℃ 10 min
冷却至RT后 加入200 uL CaCl2 加入200 uL 10% BSA
Mmg: 20 mL MES mL Mannitol mL MgCl2 mL ddH2O mL 0.075 0.15 g 1.8 3.6 mL 0.2 0.4 mL 5 10 mL 0.075 0.15 mL 4.725 9.45 mL
2 ×
PEG-CaCl2: 20 mL ×2 Mannitol 2.5 mL 5 mL CaCl2 1 mL 2 mL PEG4000 4 g 8 g ddH2O 3 mL 6 mL
W5: 200 mL
MES 2 mL NaCl 1.8 g CaCl2?2H2O 3.67525 g KCl 0.5 mL ddH2O 197.5 mL
具体实验步骤:
1、 从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗,去除幼苗外层包裹的叶子。
2、 用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片(越细越好,有利于酶解),大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可(剩余未切割的部分可以扔掉)。
3、 将酶解液(约20 mL)倒入100 mL锥形瓶中,然后轻轻地将细碎的幼苗倒入锥形瓶中(注意不要撒到锥形瓶壁上),然后轻轻地摇晃,使其均匀分散。
4、 黑暗条件下(用不透光的黑色塑料袋包裹即可,下同)置于摇床中(60 rpm/ min)摇晃5 h,使细胞充分酶解。此时也可以将PEG-CaCl2溶液一同置于摇床上摇晃,使溶质充分溶解。
5、 从摇床中取下已经酶解好原生质体的锥形瓶,用手轻轻摇匀后,再用移液枪吸取锥形瓶中已经酶解好的液体,让其经过过滤网(20 mm×20 mm)过滤后流入到BD管中。 6、 接着用W5溶液来洗涤锥形瓶中剩余的残渣,然后同样用移液枪将其吸出,经过过滤网后流入到BD管中,此步骤按照需要重复2-3次(尽量收集到更多的原生质体),所需要收集原生质体的BD管数按照需要来决定。
7、 收集完后,将含有原生质体的BD管置于离心机中,1200 rpm离心3 min。
8、 去掉BD管中的上清后,用W5溶液(约6 mL)洗涤沉淀,然后1200 rpm离心3 min。 9、 重复步骤8一到两次。
10、 去掉BD管中的上清,再在含有沉淀的BD管中加入mmg(加入的量根据液体的颜色来自行判断),然后将其混匀。
11、 Mmg加入完毕并混匀后,可吸取其中少量液体到计数板上,然后置于显微镜下观察(主要是查看原生质体是否完整、浓度是否达到和是否还含有大量的杂质),有时候凭经验而可以省去这一步。
12、 接着将BD管中的液体转移到事先已经装有质粒的另外的BD管中(加入的量根据每100 uL原生质体中加入10-20 ug质粒来确定,如果是双转,则每一种质粒都要加入这么多的样,即双倍的质粒),在这里可以转小量GFP对照来测定原生质体的转化效率。 13、 再加入等体积(原生质体+质粒)的PEG-CaCl2溶液(溶液比较粘稠,注意慢慢吸取),
轻轻混匀。
14、 黑暗条件下静置15 min(让质粒转入原生质体中)。 15、 然后加入1-2倍体积的W5溶液(终止反应)。 16、 混匀后,1200 rpm离心3 min,倒去上清。 17、 在沉淀中加入少量W5(约1 mL)混匀。
18、 最后将其吸取倒入事先加有6 mL W5的培养皿(事先经过胎牛血清润洗,以便原生质体均匀分散在培养皿中)中,并混匀。
19、 黑暗条件下静置培养16 h(让质粒在原生质体中表达出蛋白)。
20、 从黑暗中取出培养的原生质体,待吸去培养皿中一部分清澈的液体后,再用枪头将培养皿中剩余的液体和原生质体打匀,然后用移液枪将其吸取至新的BD管中。
21、 接着将BD管中的原生质体分装到1.5 mL的EP管中(分装的管数按需求决定)。 22、 此时可在EP管中加入不溶的PGN和Chitin进行处理,处理浓度为200 ug/mL,处理时间为10 min,处理时可上下颠倒摇晃EP管,这能让PGN和Chitin充分处理到原生质体。 23、 然后将EP管置于离心机中,12000 rpm,离心1 min。
24、 吸去EP管中的上清液,然后迅速将其置于液氮中,最后置于-80 ℃中冻存,待需要使用时再取出。 注意:
1、 配制溶液前需配制相关试剂母液,而且需要过滤除菌。 2、 溶液配制好后也需要过滤除菌。
3、 所用的器具最好是平时专门使用的,防止交叉污染。
4、 由于原生质体容易破裂,所以摇晃、打匀和转移原生质体的时候动作必须要轻。
实验一:GFP转原生质体转化效率观察
黑暗条件下静置培养16 h(让质粒在原生质体中表达出蛋白),取出已表达出GFP蛋白的原生质体,将原生质体打匀后再将其吸入2 mL EP管,然后1200 rpm离心3 min,吸取大部分上清后再打匀原生质体,最后吸取少量原生质体置于载玻片上,接下来便可在荧光显微镜下观察GFP荧光了。 实验二:用于BIFC实验 实验三:用于Co-IP实验
此方案来源于Yang Zhang, Jianbin Su and Hongbin Wang*. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods, 7:30, 2011. BioMed Central Highly Accessed.引用时请注明。
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