全长cDNA文库的构建方法

关于cDNA文库构建的方法原理流程及试剂盒等

中国农学通报第２２卷第２期２００６年２月

ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ

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全长ｃＤＮＡ文库的构建方法

董志敏

１，２

，张宝石１，关荣霞２，常汝镇２，邱丽娟

２

２

（１沈阳农业大学农学院，沈阳１１０１６１；中国农科院作物所农业部作物种质资源

与生物技术重点开放实验室，北京１０００８１）

摘要：全长ｃＤＮＡ文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径，克服了传统

ｃＤＮＡ文库的缺点，节省了基因克隆和功能鉴定的时间，促进了功能基因组的研究进程。目前有６种构

建全长ｃＤＮＡ文库的方法，包括Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ、ＣＡＰｔｕｒｅ、ＳＭＡＲＴ、ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ、ＣａｐＳｅｌｅｃｔ、ＣＡＰ－

文库构建技术、实验操作复杂程度和文库构建质量等方面构存ｊｕｍｐｉｎｇ。这几种方法在起始材料用量、

在不同程度的优缺点，但综合比较而言，ＳＭＡＲＴ和ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ这两种方法比较有实际应用价值。快速地构建一般质量的ｃＤＮＡ文库，如果采用Ｌｉｔｔｌｅ－ｃｙｃｌｅＳＭＡＲＴ和Ｌａｒｇｅ－ｓｉｚｅＳＭＡＲＴ法适于简单、

ＳＭＡＲＴ这两种改进技术，所建文库质量也非常好；ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ法虽然对实验技术要求较高，实验过程复杂，但所建文库全长率高，冗余性低，建库效率高，是目前构建高质量文库最好的方法。帽子结构；ｃＤＮＡ文库的构建关键词：全长ｃＤＮＡ；５’

ＴｈｅＭｅｔｈｏｄｓｏｆＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅＦｕｌｌＬｅｎｇｔｈｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ

ＤｏｎｇＺｈｉｍｉｎ１，２，ＺｈａｎｇＢａｏｓｈｉ１，ＧｕａｎＲｏｎｇｘｉａ２，

ＣｈａｎｇＲｕｚｈｅｎ２，ＱｉｕＬｉｊｕａｎ２

（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１；２ＫｅｙＬａｂｏｆＣｒｏｐＧｅｒｍｐｌａｓｍ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

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Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｉｓｒｅｇａｒｄｅｄａｓａｎｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ，ｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｗａｙｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｔｗｅｌｃｏｍｅｓｔｈｅｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇａｎｄｓａｖｅｔｈｅｔｉｍｅｏｆｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｒｅｓｕｌｔｉｎａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｉｎｃｌｕｄｅＯｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ，ＣＡＰｔｕｒｅ，ＳＭＡＲＴ，ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ，ＣａｐＳｅｌｅｃｔａｎｄＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．．Ｔｏｓｏｍｅｅｘｔｅｎｄ，ｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｅｘｉｓｔｔｈｅｉｒｏｗｎａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｓｔａｒｔｍａｔｅｒｉａｌｓ、ｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ．ＩｔｉｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｈａｔｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｔｈｅＳＭＡＲＴａｎｄＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒｍｅｔｈｏｄａｒｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｕｔｉｌｉｔｙ．ＴｈｅＳＭＡＲＴｍｅｔｈｏｄｉｓａｄａｐｔｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅａｓｉｌｙａｎｄｒａｐｉｄｌｙｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗｉｔｈａｖｅｒａｇｅｑｕａｌｉｔｙ．Ｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｃａｎｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄ，ｉｆｔｈｅＬｉｔｔｌｅ－ｃｙｃｌｅＳＭＡＲＴａｎｄＬａｒｇｅ－ｓｉｚｅＳＭＡＲＴｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｒｅｕｓｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ．ＴｈｅＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒｍｅｔｈｏｄｉｓａｄａｐｔｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗｉｔｈｈｉｇｈｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｒａｔｅ、ｌｏｗｒｅｐｅａｔｒａｔｅａｎｄｈｉｇｈｅｆｆｉｅｎｃｙ，ａｓｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｈｉｇｈａｎｄｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｉｓｃｏｍｐｌｅｘ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｈｅＦｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡ，５’－ｅｎｄｃａｐｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｃＤＮＡ文库的构建是研究生物体功能基因组的主要技术手段。传统ｃＤＮＡ文库构建方法由于反转录能力差、ｃＤＮＡ内切酶位点保护不彻底和非ｃＤＮＡ片断的插入，导致了文库中克隆片断短、全长率低和无效克

隆多，不适应目前大规模，高通量、高效的功能基因组

研究需要。而全长ｃＤＮＡ文库的构建可以高效，大规模获得基因序列，并且序列大多数包括３’和５’端的非编码区，能大幅度地加快计算机分析、蛋白质表达和功

基金项目：国家自然科学基金重大项目“大豆优异基因资源的发掘及基因组研究”（３０４９０２５０）资助。

第一作者简介：董志敏，女，１９７８年出生，在读博士研究生，现在中国农科院作物所农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室从事大豆功能基因组

方向的研究。通信地址：１０００８１北京市海淀区中关村南大街１２号中国农业科学院重大工程楼３０１。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｚｈｉｍｉｎ２００５＠１２６．ｃｏｍ，Ｔｅｌ：０１０６２１３８０６７。

收稿日期：２００５－１０－１７。

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ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２２Ｎｏ．２２００６Ｆｅｂｒｕａｒｙ

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能分析的进程；尤其是对基因组庞大，近期内不能进行全基因组测序的生物体来说，更是进行基因组研究的一条重要途径。

然而目前，全长ｃＤＮＡ文库构建方法还是个比较新的研究领域，已报道的构建方法有Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ法［１］、ＣＡＰｔｕｒｅ法［２］、ＳＭＡＲＴ法［３］、ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ法［４］、Ｃａｐ－Ｓｅｌｅｃｔ法［５］和ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ［６］法。这些方法在构建文库原理、所建文库的全长率及代表性和实际应用等方面都存在着明显的差异。

１Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ方法

Ｏｌｉｇｏ－Ｃａｐｐｉｎｇ法是ＳｕｍｉｏＳｕｇａｎｏ实验室于１９９４年开发的［１］，该法利用一个寡聚核苷酸链替换ｍＲＮＡ的帽子结构，达到标记ｍＲＮＡ５’端的目的。首先，以ｍＲＮＡ为起始材料，利用细菌碱性磷酸酶（ＢＡＰ）水解５’端不完整ｍＲＮＡ上的５’磷酸基团，防止截短的ｍＲＮＡ与寡聚核苷酸链连接；再用烟草酸焦磷酸酶（ＴＡＰ）除去ｍＲＮＡ５’端的帽子结构，在原ｍＲＮＡ的５’端帽子处只留下一个磷酸基团；通过用Ｔ４ＲＮＡ连接酶在ｍＲＮＡ的５’端连上一个寡聚核糖核酸，作为引发二链合成的引物，再经过反转录，ＰＣＲ扩增，这样只有完整的ｍＲＮＡ才能够被合成ｃＤＮＡ，即全长ｃＤ－ＮＡ。

该方法的不足之处在于：（１）需要多种酶参与反应，酶的效率直接影响文库的最终质量，尤其是Ｔ４ＲＮＡ连接酶的连接效率非常低，文库构建的反应效率比理论值低，因此构建文库对各种酶质量要求很高。（２）ｍＲＮＡ经多步酶处理，易产生降解，需要大量的起始材料。（３）各种酶对底物有一定的倾向性、ＰＣＲ反应对模板量和长度有一定的选择性，导致文库中某种类型克隆富集，冗余程度强；某种类型克隆丢失，文库缺失代表性，不能真实反映组织中各基因的存在情况。（４）烟草酸焦磷酸酶非常昂贵，实验所需成本较高［７］。

Ｊｕｎｇ－Ｈｗａ等（２００３）对这种方法做了一些改进［８］：即先以少量总ＲＮＡ（约１００μｇ）而不是ｍＲＮＡ为起始材料，寡聚核糖核酸替代帽子反应后再分离ｍＲＮＡ，进行ｃＤＮＡ合成。改进后的方法以总ＲＮＡ做为ｍＲ－ＮＡ的载体，防止酶处理过程中ｍＲＮＡ降解，起到保护ｍＲＮＡ的作用。因此其在建库效率、全长比例、代表性方面都稍好于原方法［９］，另外所用起始材料相对减少。

２ＣＡＰｔｕｒｅ方法

该方法始于１９９５年［２］，它通过亲和蛋白对帽子的亲和以及ＲｎａｓｅＡ对单链ＲＮＡ的切割来富集全长ｃＤＮＡ。Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白对ｍＲＮＡ甲基化的帽子具有强的特异绑定能力［１０］，能将有甲基化帽子和无甲基

化帽子的两种ｍＲＮＡ分开。被绑定的ｍＲＮＡ反转录

形成ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ杂合体，经过ＲｎａｓｅＡ和Ｔ１的联合作用，降解未被ｃＤＮＡ保护的单链ｍＲＮＡ，最后，只有具有甲基化帽子的完整ｍＲＮＡ与其相应的全长ｃＤ－ＮＡ被绑定到Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白上，经纯化、富集后建库。该方法亲和性蛋白的选择性强，酶促反应较少，降低了ｍＲＮＡ降解的风险，从而使文库的全长比例较高。该方法由于不进行ＰＣＲ反应，基因的冗余性降低。

这种方法具有明显的缺点：（１）Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白对甲基化帽子的绑定能力强，而对非甲基化的帽子几乎无绑定能力，从而导致了５’端帽子非甲基化的完整ｍＲＮＡ信息丢失。（２）亲和蛋白与帽子结合时，ｍＲ－ＮＡ５’端会有１０￣５０ｂｐ丢失，严格地讲，该方法所构建的文库并非全长文库，不利于分析。（３）所需起始材料用量大，约为１００μｇｍＲＮＡ，不适于有限材料建库。（４）Ａ－Ｅｉｆ－４Ｅ亲和蛋白的获取、纯化过程非常复杂，成本相对很高［７］。因此，该方法目前只能作为理论上的一种研究，很难在全长文库构建的实践中得到应用［１１］。３ＳＭＡＲＴ方法

ＳＭＡＲＴ方法是Ｃｈｅｎｃｈｉｋ等１９９６年提出的［３］，该方法利用ＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶ｓｆｉⅠ的特性，快速、简单地构建全长ｃＤＮＡ文库。

ＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＲＴ反转录酶是Ｍ－ＭＬＶＲ（Ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ａｓｅ）点突变而来的，丧失了ＲｎａｓｅＨ的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别ｍＲ－ＮＡ５’帽子结构，在相应的核酸３’端以ｏｌｉｇｏ（ｄＧ）寡聚核苷酸链为延伸模板互补上一段ｏｌｉｇｏ（ｄＣ）寡聚核苷酸序列。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。随着体系的优化，在一链合成的缓冲液中加了ＭｎＣｌ２，有的还含有ＢＳＡ，从而明显地提高了延伸效率［１２］。

用于反转录的５’端ｐｏｌｙ（Ａ）引物和延伸模板分别含有ｓｆｉＩ（Ａ）、ｓｆｉＩ（Ｂ）识别位点的寡聚核苷酸序列，以此为依据设计一对引物，ＬＤ－ＰＣＲ特异合成全长二链并扩增。而截短的一链ｃＤＮＡ，反转录酶没有识别到ｍＲＮＡ５’帽子结构，一链ｃＤＮＡ３／端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有ｓｆｉＩ识别位点的全长ｃＤＮＡ，经两种类型（Ａ、Ｂ）内切酶ｓｆｉＩ酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长ｃＤＮＡ内部由于ｓｆｉＩ识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。

与其他方法相比，此方法有其独特的优点：（１）所需起始材料少，一般０．５￣１μｇｍＲＮＡ（。２）ｍＲＮＡ在合

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成ｃＤＮＡ前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中ｍＲＮＡ的降解和损耗。（３）实验过程快速、简单，整个过程没有对ｍＲＮＡ和中间产物的复杂处理。（４）全长比例较高［１３］。

ＳＭＡＲＴ方法也有其自身明显的缺点：（１）ＰＣＲ扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于３ｋｂ片段和低峰度全长基因［１３］，同时也造成了文库冗余性强；（２）ｄＧ加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐［１４￣１７］，尤其是在医学领域中应用较广［１８￣２０］。在广泛的应用中，该方法的研究者和应用者又对其某些方面进行了技术改进，提高了该方法的应用价值。

ｇｏｖ／ｓｃｉ／ｔｅｃｈｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍｅｅｔｉｎｇｓ／ｂｉｔｓ２０００／ａｂｓｔｒａｃｔｓ／ｗｅｌｌｅ－

。需要注意的一点是：这种方法是对全ｎｒｅｕｔｈｅｒ．ｓｈｔｍ）

长反转录产物的选择而不是对完整ｍＲＮＡ的选择，因

此，为了得到大片段的全长克隆，需制备高质量的ｍＲＮＡ。

４ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ方法

ＣＡＰ－Ｔｒａｐｐｅｒ方法是由Ｃａｒｎｉｎｃｉ等提出的［４］，它是根据ｍＲＮＡ５’端及３’端存在一个共同二醇结构来建库。将这种二醇结构氧化后进行生物素修饰，再经过沉淀、酒精洗涤、无ＲＮａｓｅ的双蒸水重新悬浮等筛选步骤，得到生物素化的ｍＲＮＡ，经反转录酶催化合成ｃＤ－ＮＡ第一链，接着进行ＲＮａｓｅＩ处理，未被ｃＤＮＡ保护的ｍＲＮＡ（包括非全长ｃＤＮＡ与ＲＮＡ杂交体中暴露的ｍＲＮＡ５’端及所有的未被ｃＤＮＡ保护的ｍＲＮＡ）被

３．１Ｌｉｔｔｌｅ－ｃｙｃｌｅＳＭＡＲＴ

这种改进采用终端对终端的ＰＣＲ扩增，将循环数降解。后经青链霉素磁珠吸附并使用弱碱降解ｍＲ－由１８减少到３，这样就大大减小了ＰＣＲ扩增对长片ＮＡ，得到单链全长ｃＤＮＡ，在末端转移酶的催化下进段的不利影响，提高了长片段全长基因克隆的可能性，行５’端Ｏｌｉｇｏ（Ｇ）加尾，再进行第二链的合成，定向克提高了文库的代表性；而且，也明显降低了ＰＣＲ扩增隆即可得到全长ｃＤＮＡ文库。所产生的基因错配和文库的冗余程度［２１］。为了提高合成全长ｃＤＮＡ的能力和测序效果，该

方法进行了改进。一是用海藻糖、山梨糖醇热启动反转３．２ＳｕｐｅｒＳＭＡＲＴ

录反应。ｍＲＮＡ５’端二级结构阻碍反转录的进行，高这种方法以原有“ＳＭＡＲＴ”技术为基础，将起始

材料减少到１０￣１００个细胞，大概只需５０ｎｇ总ＲＮＡ，温破坏二级结构但同时也抑制反转录酶活性。海藻糖

的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保证反转录酶的使得该技术非常适合那些材料相当少的实验。另外可

活性在５５￣６０℃的高温下正常发挥［２３，２４］，有利于全长用受基因组ＤＮＡ污染的起始材料建库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．

ｃＤＮＡ的合成。二是用Ｓｓｔｈ或ＢｓａＩ、ＢａｍＨｌ＼Ｘｈｏｌ双酶ｏｚｙｍｅ．ｆｒ／＿ｐｒｏｄ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ｐｄｆ／ｓｍａｒｔ＿ｓｕｐｅｒｐｒｏｔｏ．ｐｄｆＢＤ

切替换ＥｃｏｌＩ＼Ｘｈｏｌ双酶切。ＥｃｏｌＩ对甲基化不敏感，容ＳｕｐｅｒＳＭＡＲＴＭｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）。

易将全长ｃＤＮＡ近端的内部已甲基化的识别位点切３．３Ｌａｒｇｅ－ｓｉｚｅＳＭＡＲＴ

割。用对甲基化敏感的限制性内切酶Ｓｓｔｈ或ＢｓａＩ、最近，ＲｕｔｈＷｅｌｌｅｎｒｅｕｔｈｅｒ等［２２］提出了一种获得长

ＢａｍＨｌ等替换ＥｃｏｌＩ，提高了文库全长比例。三是用序列的全长ｃＤＮＡ的方法，是针对ＳＭＡＲＴ很难获得

ＳＳＬＭ法加尾克服Ｏｌｉｇｏ（Ｇ）加尾对测序的干扰［２５］，虽大于３ｋｂ的全长ｃＤＮＡｓ这一局限而做的改进，即在

然加尾效率（４４％）稍抵于Ｏｌｉｇｏ（Ｇ）加尾（５２％），但该ＰＣＲ扩增合成双链ｃＤＮＡｓ前，先将一链产物按片段

且加尾时无须使用ＭｎＣｌ２和大小分出３￣４个等级，再分别ＰＣＲ扩增和克隆。这样，法加尾对片段无选择性，

ＣｏＣｌ２，不会造成全长ｃＤＮＡ降解，还利于全长ｃＤＮＡ就避免了ＰＣＲ扩增和载体连接对片段大小产生偏爱

性的缺点，使长片段的基因也能得到等效扩增和克隆。的转录和表达克隆［２６，２７］。

与其他方法相比，ＣＡＰ－Ｔｒａｐｐｅｒ方法可以说是一运用该方法构建的文库，不仅全长比例要比传统

种较好的构建高质量全长文库方法，它兼顾了文库代建库方法高的多［２１］，而且，大于３ｋｂ的插入片段中，全

表性好（９４％），全长比例高（７８％￣９０％），建库效率高长比例也比其它方法高［１３］。以往方法所构建的文库，即

的优点［１３，２８］。但也有些缺点：（１）使以λ噬菌体为载体也很少能得到大于７ｋｂ的全长（２．２×１０６ｐｌａｑｕｅｓ／９μｇ）

ｍＲＮＡ长期暴露在酶反应体系中，有降解风险；（２）各克隆，而该方法所构建的最大片段级的λ噬菌体亚文

反应难于控制，所需实验技术高；（３）实验流程长，过程库中，插入片段的平均长度可达到７ｋｂ，最长的可达到

复杂，耗时，费力。１０ｋｂ［２２］。由此可见，该方法明显地提高了文库的代表

５ＣａｐＳｅｌｅｃｔ方法性，为获得大片段全长克隆和低丰度克隆提供了可能

该方法是奥地利的Ｗｏｌｆｇａｎｇ于１９９９年提出的［５］，性。该技术可以用于构建目的基因所在片段范围的文

与ＳＭＡＲＴ有两点不同，一点是一链全长ｃＤＮＡ延伸库，提高获得全长目的基因的概率（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｎｌ．

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ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２２Ｎｏ．２２００６Ｆｅｂｒｕａｒｙ

ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ

机制不同。ＣａｐＳｅｌｅｃｔ是反转录酶催化合成到５’端时，识别帽子结构，在全长一链ｃＤＮＡ３’端延伸了３￣４个Ｇ。另一点不同就是该方法运用了ＣＲＴＣ技术［２９］，即ｃＤＮＡ末端可控加尾技术。通过优化末端转移酶的反应条件，在已加有３￣４个的全长一链ｃＤＮＡ末端以９３％的效率添加３￣４个Ａ，再通过优化的Ｔ４ＤＮＡ连接反应，将有突出端的双链接头与全长一链高效连接，根据接头和５’端Ｐｏｌｙ（Ｔ）特点设计引物，ＰＣＲ扩增后得到全长ｃＤＮＡ。

该方法延袭了ＳＭＡＲＴ的优点，同时对ＳＭＡＲＴ方法的ｄＧ加尾效率低，信息丢失的缺点加以改进，增加了全长ｃＤＮＡ选择强度，可靠性更高。缺点在于：（１）即使条件优化，也仅约有８２％的全长ｃＤＮＡ得到筛选（２）无法剔除ｃＤＮＡ混合样中的非全长ｃＤＮＡ。从实际应用上看，该方法与ＳＭＡＲＴ相比，建库效果无明显优越性，加之ＳＭＡＲＴ试剂盒的完善，相比之下，ＳＭＡＲＴ试剂盒更受欢迎。因此，该方法很少见报道［３０］。６ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ方法

该方法是Ｅｆｉｍｏｖ在２００１年报道的［６］，其基本原理为ｍＲＮＡ两端的二醇基团经高碘酸氧化为二醛基团，再与乙二铵的氨基结合，这样３’端经高碘酸氧化的寡聚核糖核酸（延伸模板）可化学连接到ｍＲＮＡ的５’端。５’端带有一段核糖核酸的ｍＲＮＡ作为反转录的模板合成一链ｃＤＮＡ，反转录酶在高浓度Ｍｎ２＋存在的条件下发挥了极强的末端转移酶活性，使一链ｃＤＮＡ的３’端加上３￣５个Ｇ，从而越过帽子结构，以寡聚核糖核酸为模板延伸。依据延伸模板和３’端Ｐｏｌｙ（Ｔ）设计引物，ＰＣＲ特异扩增合成全长二链ｃＤＮＡ。

该方法结合了ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ和ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ的特点，但也有区别之处。与ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ法相比较，二者都是在ｍＲＮＡ的５’端化学连接上了一段寡聚核糖核酸链，设计特异引物，ＰＣＲ扩增合成二链。不同之处在于，ｏｌｉｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ方法是用一段寡聚核糖核酸链替换了帽子结构，帽子结构被去除；而该方法不去除帽子结构，直接在５’端化学连接上一段寡聚核糖核酸链。与ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ方法相比较，两者都用高碘酸钠氧化ｍＲ－ＮＡ两端的二醇基团为二醛基团；但ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ中的二醛基团被生物素的氨基替换，而该方法的二醛基团被乙二铵的氨基替换。还有值得一提的是，Ｅｆｉｍｏｖ提

［６］

出的改进方法“ｓｉｍｐｌｅｐｈａｓｅｐｒｉｃｅｄｕｒｅ”在生物素标记ｍＲＮＡ５’端的延伸摸板，磁珠筛选全长ｍＲＮＡ方面的原理都与ｃａｐ－ｔｒａｐｐｅｒ法相应部分相同。由于ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ在实践中还未展开应用，其明显的优缺点还不清楚，有待人们在进一步的研究与应用中发现和改正。

综上所述，ＳＭＡＲＴ方法和ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ方法的研究比较成熟，而且在实际应用中有其鲜明的优点，因此，这两种方法在全长ｃＤＮＡ文库构建中将会有广阔的应用前景。ＳＭＡＲＴ方法本身虽然具有冗余性高、插入片段短的缺点，但其改进技术Ｌｉｔｔｌｅ－ｃｙｃｌｅＳＭＡＲＴ和Ｌａｒｇｅ－ｓｉｚｅＳＭＡＲＴ一定程度上克服了这两个缺点。这两种改进技术已分别在人脑瘤组织［１９］和德国人群全长ｃＤＮＡ文库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｋｆｚ．ｄｅ／ｓｍｐ－ｃｅｌｌ／ｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｇｒｏｕｐｓ．ａｓｐ？ｓｉｔｅＩＤ＝７ＴｈｅＧｅｒｍａｎＨｕｍａｎｃＤＮＡｃｏｎｓｏｒ－ｔｉｕｍ）构建中得到了成功的应用，但目前还未见到将两种技术同时应用在全长ｃＤＮＡ文库构建上的报道。如果能做到这一点，相信ＳＭＡＲＴ方法在将来会成为一种简单、快速、高质量的全长ｃＤＮＡ文库构建方法。ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ方法虽然对试验技术要求高，过程复杂，但文库质量高，这对于有一定基础和规模的实验室来讲是大规模构建全长ｃＤＮＡ文库进行深入研究最有价值的方法。利用该方法美国人成功构建了老鼠全长ｃＤＮＡ文库［３１］，日本人也成功构建了拟难芥［２８］、水稻全长ｃＤＮＡ文库［３２］，文库全长比例都在９０％左右。从这些文库中，研究者们不仅获得了大量有价值的全长序列，对其功能基因组进行深入研究，而且对基因组结构进行了预测。可见，构建高质量的ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ文库会带来一劳永逸的效果。

参考文献

１

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关于cDNA文库构建的方法原理流程及试剂盒等

中国农学通报第２２卷第２期２００６年２月

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（责任编辑：回文广）

２２ＷｅｌｌｅｎｒｅｕｔｈｅｒＲ，ＳｃｈｕｐｐＩ，ＰｏｕｓｔｋａＡ，ｅｔａｌ．ＳＭＡＲＴａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ

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