蛋白质及酶工程试验

实验目录 实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

实验二 β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化 实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定 实验四 酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究 实验五 植物体内可溶性蛋白质含量的测定 实验六 酵母蔗糖酶的结晶 实验七 酵母蔗糖酶的化学修饰 实验八 酶法澄清苹果汁加工工艺优化 实验九 原果胶酶的提取与活性测定 实验十 层析柱装填及柱效测定

实验十一温度对酶活力的影响－－最适温度的测定

实验一 尼龙固定化木瓜蛋白酶

一、原理

通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。固定化酶的特性主要表现在：①稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。(化学式见课件)

二、实验材料、仪器和试剂

CHO—(CH2)3—CHO

1、材料 ????

尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm

2、仪器

(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱 3、试剂

(1)18.6êCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液 (4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)

(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5

(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液

(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。

(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。 三、操作步骤

1、固定化酶的制备

(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6êCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。

(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至PH值中性。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。

(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.5～1mg/mL)在4℃下固定3.5h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL)。

(5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

2、酶活力测定

(1)溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热

10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。

在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位(U)(以下同)。 (2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。

(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。 四、结果计算

固定化酶总活力

活力回收= ---------------×100%

溶液酶总活力 固定化酶总活力数

相对活力= ----------------------- ×100% 溶液酶总活力数-残留酶活力数 五、注意事项

(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。

(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。

(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。

实验二 β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化

采用物理或化学的方法固定化微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。对于固定化细胞，以微生物细胞在固定化后的生长状态可分为：固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞三类。固定化死细胞是在固定化前或固定化后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂、化学试剂等处理，使细胞处于死亡状态；固定化活细胞是在固定化后细胞仍存活但并不增殖；固定化增殖细胞是固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增殖。这三类固定化细胞中最令人感兴趣的是固定化增殖细胞。因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。

完整细胞的固定化对于细胞内酶的利用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。当反应需要辅助因子时，固定化细胞的优点更加突出，因为活细胞能再生辅助因子。

微生物细胞的固定化方法与固定化酶的方法类似，有吸附法、包埋法和不用载体法。固定化细胞的活力及其它性质与游离细胞有所不同。细胞经固定化后，一般细胞的稳定性增加。固定化细胞的最适反应温度、最适pH值、最大反应速度大多与游离细胞相同；饱和常数与游离细胞相比有的不变，有的变化很大，这可能是由于载体与底物间静电相互作用以及存在扩散效应的缘故。 一、实验目的

学习细胞固定化的原理，通过用海藻酸钠包埋法固定含β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌，掌握菌体细胞包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。

二、实验原理

固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。 三、实验步骤及方法

1、试剂

（1）芽孢杆菌细胞：将对数生长期的芽孢杆菌离心(3200r/min，20min)，收集

细胞。

（2）海藻酸钠溶液：用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，灭菌后备用。 （3）2％氯化钙溶液。

（4）2mmol／L ONPG溶液。

（5）0.1mol／L pH7.O磷酸缓冲液。 （6）lmol／L Na2C03。 2、细胞悬浮液的制备

称取产β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌湿菌体3g，加无菌水6mL，搅拌均匀制成悬浮液。

3、细胞的固定化

（1）取芽孢杆菌菌体悬浮液3mL，悬浮在10mL海藻酸钠溶液中混合均匀。 （2）用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴人到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min。

（3）滤出凝胶珠用无菌水洗涤，得到固定化细胞，称重。 4、酶活力测定 （1）细胞悬浮液酶活力测定：将菌体悬浮液3mL稀释10－20倍，取试管2支，每管加入2mmol／L底物邻硝基苯β一半乳糖苷(ONPG)溶液1mL，在65℃恒温水浴中预热5min后，每管分别加入上述菌体悬浮稀释液1.0mL，65℃精确反应15min后。每管加入2mL lmol／L Na2CO3溶液终止反应，3200r/min离心5min，取上清液在分光光度计上比色，读取420nm处的吸光度值。取2支测定管的平均

值。空白管以1.0mL 0.1mol／L pH7磷酸缓冲液代替菌体悬浮稀释液，其余操作同上。

（2）固定化菌体细胞的酶活力测定：精确称取固定化菌体细胞60mg于一试管内，加入1mL 0.1mol／L pH7磷酸缓冲液，加入预热的2mmol／L底物ONPG溶液1.0mL，以下操作同菌体悬浮液酶活力的测定。空白管内不加固定化菌体，也不需离心。

所测数据填入下表：

总量 测定平均值（A420）稀释倍数 总酶活力 菌体悬浮液

3 mL a 固定化菌体细胞 mg b 5、计算

（1）菌体悬浮液总酶活力a (相对值)

测定平均值（A420）×3（总量）×稀释倍数

a＝----------------------------------------- 1.0×15

（2）固定化菌体细胞总酶活力b(相对值)

测定平均值（A420）×固定化菌体总量（mg） b＝------------------------------------------ 60（mg）×15

（3）酶活力回收＝(b／a)×100％ 四、结果与讨论

（1）固定化细胞内酶活力回收值的高低与哪些因素有关?

（2）固定化细胞的活力、底物专一性、反应温度、动力学常数与游离细胞相比有否不同?

（3）比较各种细胞固定化方法的优缺点。

实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定

酶的纯化

一、原理

酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。

离子交换层析法(ion-exchange chromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度 (或两者同时改变)来实现。与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。 二、实验材料、仪器和试剂 1、实验材料 干酵母 2、仪器

(1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器 3、试剂

(1) 95% 乙醇溶液 (2) DEAE-Sepharose Fast Flow (3) 1mol/L醋酸溶液 (5) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)

(6) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3 三、操作步骤 1、破碎细胞

取15g 干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约20~30min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15min，留0.5ml上清液为第一组分。 2、加热除杂蛋白

将上清液倒入三角瓶，将1mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入到50℃的水浴中，保温30min。在温育过程中，注意经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000r/min的转速离心20min，取0.5ml上清液为第二组分。弃去沉淀。 3、乙醇沉淀

量出上清液的体积，并加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30min)，于冰浴中温和搅拌20min。然后以12000r/min的转速离心25min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5min以上)使其完全溶解，以12000r/min的转速离心25min，取出0.5ml上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步骤操作。 4、上柱

装DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3) 平衡，然后用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0~1mol/L)洗脱，层析柱连上线性梯度混合器，混合器分别装30ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)和30ml含有100mmol/L NaCl的0.08mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)，每1min收集1管。洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。

用尿糖试纸进行半定量测定：

在点滴板中滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置20min，浸入尿糖试纸，1s后取出，60s钟比较颜色的深浅，与比色卡对照。 尿糖试纸的原理：

尿糖试纸使将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶和无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧。原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。当这种酶试纸与溶液（或尿液）相遇时，很快就会因溶液（或尿液）中葡萄糖含量的少到多而依次呈现出浅蓝、浅绿、棕或深棕色。尿糖试纸是固定化酶实际应用的范例之一。

四、结果分析

以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。 五、注意事项

梯度洗脱装置中的贮液瓶和混合瓶两者容量应相等，且置于同一水平位置。混合瓶装起始洗脱液，贮液瓶装高浓度洗脱液。洗脱前先开动搅拌器，后开启连接两瓶的活塞，这样使混合瓶中的洗脱液呈直线式递增。

圆盘电泳测定纯度

一、原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electrophoresis，简称PAGE)根据其有无浓缩效应分为连续的和不连续的两种。前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要有电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中的泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。下面就这3种物理效应分别加以说明。

（1）电荷效应：各种样品分子按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极、以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：相对分子质量或分子大小和形状不同的样品分子，通过一定孔径分离胶时，受阻碍程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。相对分子质量小、形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力较小，移动较快；反之，相对分子质量大、形状不规则的分子在电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过程中的情况不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：

①由于两层凝胶孔径不同，样品向下移动到两层凝胶接口时，阻力突然加大，速度变慢，这样就在两层凝胶交界处使待分离的样品区变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH值为6.7，下层分离胶的pH值为8.9。HCI是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都发生电解，Cl-布满整个胶体。待分离的样品加在顶部，浸在PH值8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。在pH值6.7的条件下，解离度仅有0.1%～1%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后面，成为慢离子(尾随离子)。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的接口。在pH值6.7的条件下，带有负电荷的样品其有效泳动率介于快、慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐渐形成一个区带。

由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区及低电导区。因为电位梯度U、电流I和电导率k之间有如下关系：

U=I/k

所以，在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于样品和甘氨酸慢离子，使其加速前进，追赶快离子。本来夹在快、慢离子之间的样品区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种样品分子又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条分离得很近但又不同的“起跑线”。后来，当样品分子和慢离子都进入分离胶后，pH值从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，其有效迁移率迅速加大到超过所有样品分子，此时，快、慢离子的接口跑到被分离的样品分子之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，在此后的电泳过程中，样品在一个均一的电位梯度和pH值条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分离条带清晰度及分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。 二、仪器和试剂 1、仪器

(1)稳流稳压电泳仪 (2)垂直式圆盘电泳槽 (3)微量加样器 (4)长针头注射器 2、试剂

(1)凝胶贮存液(A液)：聚丙烯酰胺32g、甲叉双丙烯酰胺1.0g，加水使其溶解后定容至100mL，过滤除去不溶物，置棕色瓶中，于4℃下贮存。

(2)凝胶缓冲液(pH值8.9)(B液)：取24mL 1mol/LHCl溶液、18.15g Tris、0.25mlTEMED，加水定容至100mL。

(3)0.2%过硫酸铵溶液(C液)：取0.2g过硫酸铵加水溶解，定容至100mL。现配现用。

(4)上极电极缓冲液：取6.32g Tris、3.94g Gly，加水溶解，定容至100mL，使用时稀释10倍。

(5)下极电极缓冲液：取12.1g Tris、50mL 1mol/L HCl溶液，加水溶解，定容至100mL，使用时稀释10倍。

(6)溴酚蓝-甘油溶液：取5mL 50%甘油溶液、5mL上极电极缓冲液、5mL 1%溴酚蓝溶液混匀。

(7)12.5%三氯乙酸溶液。

(8)染色液：取0.25g考马斯亮蓝R250、90.8mL50%甲醇溶液、9.2mL冰乙酸混匀。

(9)脱色液：取7.5mL乙酸溶液、5mL甲醇溶液。加水87.5mL混匀。 三、操作步骤 1、凝胶柱的制备

将A液、B液按1:1的比例混合于烧杯中，另取2倍体积C液于另一烧杯中，有条件的可将它们一同放在真空干燥器里减压抽气，以排除溶液中的气泡。每组准备好用封口膜封底的4支玻璃管后，取A液2.5ml，B液2.5ml，C液5ml置烧杯中，轻轻混匀，用移液管沿玻璃管壁小心向每支玻璃管中加2ml混和液，用手指轻弹管壁，以将管中胶液可能含有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入蒸馏水至管顶，以防胶液凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。当水层与胶液交界处出现一清晰界面时，表明胶已聚合。 2、样品的制备

取第一组分 50μL，加10μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液） 取第二组分 50μL，加10μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液） 取第三组分 80μL，加20μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液） 取第四组分 250μL，加50μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液） 混合后供电泳分析用。 3、加样和电泳

聚合后,从玻璃上小心去掉封口膜，用滤纸吸干凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电泳槽的槽洞橡皮塞中，上、下槽分别加入约600mL的上、下极电极缓冲液，使玻璃管上、下端及上、下电极均浸没在缓冲液中，并使两端管口都不存在气泡。然后用滴管或微量进样器分别往凝胶管表面加入第一、二、三、四组分样品液。上槽接负极，下槽接正极，以2mA/管的电流强度电泳30min后，电流强度加大到4mA/管，当指示剂溴酚蓝带移至凝胶柱下端约1cm处时，停止电泳。

4、脱胶、染色及脱色

把从电泳槽中取出的凝胶管用带长针头的注射器脱胶。将吸满水的注射针头沿壁插入到玻璃管壁与凝胶之间，边注水边推进针头，并缓慢放置玻璃管，使凝胶与管壁分离，则胶柱自然滑出，若不能滑出可用洗耳球吹出。将脱出的

凝胶放在盛有固定液的试管中固定30min，再转入染色液中染色30min，然后用脱色液浸泡至蛋白区带清晰为止。 四、结果分析

观察并记录实验结果，判断酶的纯度，画出圆盘电泳酶纯度的检验结果。 五、注意事项

(1)注胶前应检查准备好的玻璃管是否有漏。

(2)加满胶液的玻璃管应尽量放直静置，以使凝结后的胶面平整并与管壁垂直。 (3)脱胶时注意勿使针头损伤凝胶柱而妨碍观察谱带。

实验四 酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究 一、原理

酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其K m值也不同，K m值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，K m值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；K m值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。

酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制两种类型。而可逆抑制又包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m,Vmax等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。 二、仪器和试剂 1、仪器

(1)恒温水浴锅（2）电炉（3）722分光光度计 2、试剂

（1）0.2mol/L乙酸缓冲液 （2）0.5mol/lL蔗糖溶液 （3）8mol/L 脲 三、操作步骤 1、时间作用曲线

取试管编号，按下列顺序加入各种试剂，待测酶样用组分4，其稀释倍数以酶活力测定时的数据为准。 试剂 管号 CHO—(CH)—231 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.7 1.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — — 0 1 2 4 8 10 12 15 20 25 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 置沸水浴20min

CHO???? 加入顺序 0.2mol/L乙酸缓冲液（mL） 0.5mol/L蔗糖溶液（mL） 水（mL） 酶液（mL） 保温时间（min） Nelson试剂（mL） 砷酸钾试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 A510nm 以还原糖的量（μmol）为纵坐标、时间为横坐标作时间作用曲线。 2、底物浓度的影响 取试管编号，按下表加样。

试管 加入试剂顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.2mol/L乙酸缓冲液（mL） 0.5mol/L蔗糖溶液（mL） 水（mL） Nelson试剂（mL） 酶液（mL） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.02 0.04 0.060.08 0.10 0.2 0.4 0.2 0.4 — 0.6 0.58 0.56 0.540.52 0.50 0.4 0.2 0.4 0.2 — — — — — — — — — 1.0 1.0 — 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — Nelson试剂（mL） 室温下放置10min 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 — — 1.0 置沸水浴20min后冷却 砷酸钾试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温5min后加入7mL水比色 A510nm 计算个试管中的蔗糖浓度和反应速率V（单位：），用反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算K m和Vmax。 3.脲对蔗糖酶的抑制

取试管编号，按下表加各种试剂。 试管 加入试剂顺序 0.2mol/L乙酸缓冲液（mL） 0.5mol/L蔗糖溶液（mL） 8mol/lL脲（mL） 水（mL） Nelson试剂（mL） 酶液（mL） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.2 0.4 0.2 0.4 — 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.45 0.43 0.41 0.39 0.37 0.35 0.25 0.05 0.25 0.05 0.85 — — — — — — — — 1.0 1.0 — 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 — 室温下放置10min

Nelson试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 — — 1.0 置沸水浴20min后冷却

砷酸钾试剂（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 A510nm 以反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算出表观K m、Vmax、Ki，说明其抑制类型。 四、注意事项

1．研究酶的活力应以酶促反应的初速度为准。

2．本实验采用的是一种定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作带来的误差。因此，在配置各种底物浓度时，应用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性。各种试剂的加样量也应准确，并严格控制酶促反应时间。

实验五 植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大

光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计，10ml量筒1支；研体；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度试管14支。 【试剂】

（1）牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；

（2）考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月；

（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，W/V）。 【方法】

1.标准曲线的绘制

（1）0～100μg/ml标准曲线的制作 取6支试管，按表28-1数据配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液

（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。

表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。 3.结果计算

样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=

式中 C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；

V－提取液总体积（ml）； a－测定所取提取液体积（ml）； W－取样量（g）。

二、LOWRY法

【原理】

Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。 Lowry法 的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被 酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。 【仪器与用具】

试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。 【试剂】

Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；

牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。 【方法】 1.酚试剂的制备

（1）取Na2WO4·2H2O 100g，Na2MoO4·2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。安上回流冷却装置（使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li2SO4·H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。

使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为1mol/L H＋，此为Folin-酚试剂乙液。

（2）首先配制①4% Na2CO3溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO4溶液；④2%酒后石酸钾钠溶液；使用前①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液；将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按50︰1混合；配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。 2.标准曲线的绘制

（1）取7只试管编号,分别加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml标准蛋白质溶液，用水补到1ml，便成为每管含蛋白为0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg标准系列（必要时可做重复）。 （2）加5ml试剂甲，混匀，于30℃放置10min。

（3）喷射加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。 （4）准确到30分后，以不加标准蛋白的管为空白，在500nm波长下比色测定吸光度值。

（5）以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3.样品测定

（1）取50μl样液加入试管中，（样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例，提取方法见各酶活测定）加蒸馏水补至1ml，然后重复步骤2的（2），（3），（4），以空白为参比，测吸光度值。

（2）根据吸光度值，查标准曲线求得蛋白质含量。 4.结果计算

蛋白质含量（mg/g鲜重）＝

式中 C－查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量（mg）；

V－提取液总量（ml）； a－测定时取样液量（ml）； W－取样量（g）。 【注意事项】

1.Folin试剂乙只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。 2.为了保证反应进行完全，反应在25～30℃水浴中进行，反应30min后准时比色。

3.还原物质干扰本实验。 【方法评述】

上述两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法，前者稳定，后者简便；二者均优于现有的其它方法。二者的缺点是：Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰；考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。 【思考题】

1.测定植物体可溶性蛋白含量有什么意义和用途？试举二例说明。 2.两种测定方法各有何优缺点？在实验中如何选择合适的方法并排除其缺点？

3.用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的方法中，标准曲线制作与其他实验有何不同？

4.Lowry法测定蛋白质含量的原理是什么?测定中应注意什么问题？

实验六 酵母蔗糖酶的结晶

一、原理

常用的蛋白质结晶方法有：微池法结晶，蒸汽扩散法，液-液扩散法和透析结晶法等。现有的结晶方法结晶量小，需要使用高度纯化的蛋白质，常使用离子交换或亲和层析等方法进行纯化。常用的结晶剂包括盐、有机溶剂、聚乙二醇4000等。与结构研究相比，用作交联酶晶体催化剂的酶晶体对晶体质量要求相对较低，但要求数量大。从纯化程度较低的酶液中结晶酶，其结晶时间可能较短，结晶液可达数升至数百升，所用试剂相对较少，从而大幅度降低酶晶体的成本。硫酸铵．丙酮协同沉淀要优于单独硫酸铵分级沉淀，可能有以下几点：(1)硫酸铵和丙酮分级沉淀的机理不同，前者是中和蛋白质的表面电荷使其沉淀，而后者是降低溶液的介电常数使其沉淀，两者在协同沉淀时使其作用互补，使效率更高。(2)当单独使用硫酸铵沉淀时，随着其饱和度的升高，溶液的密度也变大，不利于离心分离，而加入一定体积丙酮后，溶液的密度减少，有利于离心分离。(3)与单独硫酸铵、丙酮沉淀相比，它的第一次沉淀量大，除杂多，纯化效果好。

二、实验材料、仪器和试剂

1、实验材料 实验三纯化得到的酵母蔗糖酶 2、仪器

（1）高速冷冻离心机 （2）真空干燥器 3、试剂

（1）硫酸铵（2）丙酮 三、操作步骤

1、丙酮一硫酸铵协同除杂

首先向原酶液中加硫酸铵至45％饱和度，冰浴，搅拌，5min加完。然后加入0.3倍酶原液体积的丙酮，5min加完。此时溶液会分相，用低速大容量多管离心机离心除去沉淀，保留上清液。此步操作为丙酮一硫酸铵协同除杂。 2、浓缩

向上清液中快速加入硫酸铵至75％饱和度，5min加完。由于丙酮和硫酸铵的协同作用，静置15～30min后溶液分相，上相约占总体积的1／3，为丙酮及过氧化物酶的混合物；下相几乎无活性，可直接弃去。 3、结晶

将上相离心，取相界面处沉淀，即为浓缩过氧化物酶。将沉淀抽真空除去丙酮后，在显微镜下观察。用测微尺测量晶体尺寸。

四、结果分析

将得到的酵母蔗糖酶的晶体显微镜下观察形态并描述，用测微尺测量晶体尺寸并记录。

实验七 酵母蔗糖酶的化学修饰

一、 原理

蛋白质的化学修饰是研究蛋白质结构与功能的重要方法，对蛋白质侧链基团进行化学修饰，不仅可以探明酶活性部位的结构，也可为改进酶的原有性质(如稳定性等)提供理论基础。其中苯甲基磺酰氟可以特异性修饰丝氨酸残基、三硝基苯磺酸可以特异性修饰赖氨酸残基、对氯汞苯甲酸可以特异性修饰巯基、IAc可以特异性修饰组氨酸残基、N一溴代琥珀酰亚胺可以特异性修饰色氨酸残基、二硫苏糖醇可以特异性修饰二硫键、EDTA 是金属离子的螯合剂，可与酶活性中心的金属离子发生作用 二、 仪器和试剂 2、试剂

（1）苯甲基磺酰氟(PMSF) （2）三硝基苯磺酸(TNBS) （3）对氯汞苯甲酸(PCMB) （4）IAc

（5）N一溴代琥珀酰亚胺(NBS) （6）二硫苏糖醇(DTT) （7）EDTA

（8）0.2 mol/L乙酸缓冲液（pH4.6） （9）0.5 mol/L蔗糖溶液

（10）砷钼酸试剂：将50g钼酸铵溶于900mL水，边搅拌边加入42mL浓硫酸；另取6g砷酸钠溶于50mL水，加入到前一溶液中，彻底摇匀，定容至1000mL，于37℃下保温24h，然后在室温下储存于棕色瓶中。 （11）Nelson试剂：

A液：取25g无水碳酸钠、25g酒石酸钾钠，加水溶解后再加入20g碳酸氢钠、200g无水硫酸钠，加水定容至1000mL。

B液：将15gCuSO4·5H2O溶于90mL水，滴加2滴浓硫酸，定容至100mL。

将A液与B液按50：2的比例（体积比）进行混合，即为Nelson试剂，用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。 三、 操作步骤

1、将浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的各种修饰剂0.5 mL与酶液0.5 mL在37 ℃下作用20 min，测定其剩余活力，以pH4.6的乙酸缓冲液代替抑制剂溶液测得的活力为100%。

2、以蔗糖为底物，采用Nelson's法测定蔗糖酶的活力。 Nelson's法步骤：

1、仪器 （1）恒温水浴锅 （2）电炉 （3）722分光光度计

1、加入0.2mol/L 乙酸缓冲液0.2mL、0.5mol/L 蔗糖溶液0.1 mL、水0.6mL、酶液0.1mL保温20min。

2、然后加入Nelson试剂1mL置沸水浴20min。

3、然后加入砷钼酸试剂1mL保温5min后，加入7mL水混匀，A510 nm处比色。

四、结果分析

以抑制剂的浓度为横坐标，以相对酶活为纵坐标，绘出各种抑制剂的酶活曲线图。

实验八 酶法澄清苹果汁加工工艺优化

一、实验原理与目的

苹果汁中存在的果胶，有很强的保护胶体的作用，能保持稳定的混浊度。同时，果胶溶液黏度大，如果不加处理，过滤是困难的，而且即使过滤之后，在果汁中所存在的果胶和其它高分子物质，在贮藏中，由于分解、与金属离子结合及其他作用，也会产生凝固沉淀。因此，在过滤之前，必须先进行澄清。常用的澄清方法主要有自然澄清法和热处理法、冷冻法、酶法、加澄清剂法、离心分离法、超滤法等。酶法同其他方法比较,具有用量少、作用时间短、澄清效果好等诸多特点,且酶法的作用机制是生物降解。

本实验利用果胶酶对苹果汁进行澄清,通过优化酶法澄清苹果汁的工艺参数，使学生理解饮料加工工艺中酶法澄清的原理和操作方法。

二、实验材料与设备 1. 实验材料

新鲜苹果、果胶酶、抗坏血酸溶液。 2. 实验设备

秤、榨汁机、循环水真空泵、可见分光光度计、色差计、水浴锅、压榨机或离心分离机。

三、实验内容 1．工艺流程

原料选择→清洗→破碎→榨汁( 加抗坏血酸护色)→过滤→原汁→加入果胶

酶澄清→灭酶→过滤→清汁。 2．操作要点 （1）苹果汁制备

取新鲜苹果清洗后，去皮，去核或不去皮，不去核,后切分成长约2cm的小块, 放入榨汁机。在榨汁时放入苹果质量0.1%的抗坏血酸溶液护色或不护色, 将榨出的苹果汁用滤布粗滤得原汁，使用压榨机或分离机分离苹果渣中的果汁，与过滤的清汁混合。

（2）果胶酶澄清苹果汁的工艺条件优化

根据果胶酶对果胶等大分子物质的生物降解特性,本实验着重考察果胶酶用量 (0.10%, 0.15%, 0.2%)、酶作用温度 (40℃, 50℃, 60℃)和时间 (1h, 2h, 3h)3个主要影响因素。在单因素实验的基础上,选用L9(34)正交实验设计对酶法澄清苹果汁的工艺条件进行优化，从而确定果胶酶澄清苹果汁的最佳工艺条件。

（3）果汁澄清度的测定

采用可见分光光度法,以蒸馏水作参比,在波长660nm下,测定苹果汁的透光率。用透光率表示苹果汁的澄清度。

四、问题讨论

1．果胶酶澄清苹果汁的原理是什么？ 2．苹果去皮去核对于果汁的澄清度有何影响？ 3．使用抗坏血酸护色对于果汁的色泽有何影响？ 4．各单因素对苹果汁有何澄清效果？

5．通过正交实验得出果胶酶对苹果汁澄清处理的最适工艺条件是什么？

五、参考文献

1．邵长富. 软饮料工艺学，中国轻工业出版社, 2005. 2．汪东风. 食品科学实验技术，中国轻工业出版社, 2006

实验九 原果胶酶的提取与活性测定

一、实验原理与目的

原果胶酶在食品、酿酒、环保、医药、纺织及洗涤剂行业应用十分广泛。 盐析是通过破坏蛋白质表面的亲水基团和带电颗粒而使蛋白质发生沉淀的方法，不同蛋白质分子颗粒不同，故盐析所需要的浓度不同，从而将蛋白质分离。

通过硫酸铵逐级沉淀原果胶酶进行初步的分离纯化，通过凝胶层析法进一步分离纯化。学习果胶酶的提取方法，并测定果胶酶的酶活。

三、实验材料与设备 1. 实验材料

原果胶酶工程菌、硫酸铵、考马斯亮蓝R250、原果胶、甲醇、醋酸缓冲液、BMGY培养基 2. 实验设备

电子天平、恒温水浴锅、可见光分光光度计、透析袋、凝胶Sephadex G-75

三、实验内容

1．果胶酶粗酶液的制备

挑取酵母原果胶酶工程菌单菌落，接种于装有25 mL BMGY培养基的250 mL 摇瓶中，在30 ℃、250 r/min 条件下培养约18 h，然后室温下6 000 r/min 离心5 min，收集菌体，用mBMMY 诱导培养基(约200 mL ) 重新悬浮菌体，使OD600约为1.0；将上述菌液置于1 L 的摇瓶中，用双层纱布封口，置于30 ℃ 、250 r/min 的摇床上继续培养，每24h 向培养基中添加甲醇至其体积分数为1%，诱导培养96h，4℃、6 000 r/min 离心20 min。收集上清液，即为原果胶酶粗酶液，于4 ℃保存备用。 2．原果胶酶粗酶液的硫酸铵沉淀

取9份50ml果胶酶液粗酶80ml离心管中，加入硫酸铵粉末，使离心管中硫酸铵的饱和度分别为0、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%和90%，4 ℃静置过夜, 10000 r/min 离心20 m in，收集上清液, 4 ℃保存，沉淀用

10 mL 醋酸缓冲液（pH 5.8） 溶解，然后在同种缓冲液中充分透析，检测上清液和透析处理液中原果胶酶的活性。

测定随着硫酸铵饱和度的增减，上清液中酶的相对活性的变化情况，并标出在饱和度为多少时，上清液中酶活性下降最快，这时表明原果胶酶沉淀量在相应增大；当硫酸铵饱和度超过某一数值时，上清液中原果胶酶活性下降呈现出减缓趋势，此时表明原果胶酶已经基本沉淀完毕。在硫酸铵饱和度达到此数值时，原果胶酶回收率，继续提高饱和度，原果胶酶的回收率基本不变。 3．Sephadex G75 凝胶柱洗脱

取经硫酸铵沉淀、透析和浓缩后终体积为2 mL 的原果胶酶液加入到充分平衡的凝胶中，然后用醋酸缓冲液(pH5.8) 洗脱，控制洗脱速度，建议为0.3 mL/min，每3 min 收集一管，测定每管中的蛋白质含量和原果胶酶活性，当检测不到原果胶酶活性时，终止洗脱，并用测得的蛋白质含量和酶活数据绘制凝胶过滤曲线。 4．原果胶酶活性测定

取10 mg 原果胶，加入0.95 mL pH 5.8 的NaAc-HAc 缓冲液和50 uL适当稀释的原果胶酶提纯液，在37℃下保温1 h，冰浴以终止反应，10 000 r/min 冷冻离心10min，取上清液，在530 nm 波长下测定上清液中的果胶物质。

在上述酶反应体系中，每小时催化原果胶生成相当于1umol半乳糖醛酸的果胶物质的量，定义为一个酶活单位(U )。

四、思考题

1. 利用盐析方法提取酶的原理？ 2. 酶的其他分离纯化的方法有哪些？

实验十 层析柱装填及柱效测定

一、实验目的和内容

目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程；

3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填； 2. 凝胶柱柱效测定；

3．凝胶再生的方法。

二、实验仪器和试剂 1. 实验仪器

层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管 2. 实验材料和试剂

Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）

三、实验步骤

清洗层析柱

测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积

根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量

称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去

用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出

关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液 （重复使用的填料，从此步开始）

边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降

等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积

待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口

通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)

始终保护凝胶上端有一段液体

准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪

打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切

沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免

打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子

按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次

加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽

将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置

洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/L pH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间16：00）

柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2

其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精确到1mm。

[Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000]

四、注意事项

1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

将床面凝胶冲起

（参考完成时间11：30）

2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。

3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。

4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。

五、演示

（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法

1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。

2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。

3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。 4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。

5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在\位 。

6. 上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过

检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。 7. 测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。

记录仪光吸收A读数

当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。

数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)

当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。

当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:

A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A （二）部分收集器的操作方法：

1. 将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开\慢\和“定”，再按一下\停\设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。

2. 定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。

六、实验报告

1．如实完整地记录实验流程、现象及结果，计算理论塔板数并对其进行深入分析和讨论。

2．结合理论塔板模型，分析柱效的影响因素，以及如何提高柱效。

七、背景资料

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。

凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子, 也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。以下对凝胶层析的使用进行具体介绍。

图1 凝胶层析的原理

（一） 层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用 20 -30cm 长的层析柱，分级分离时，一般需要 100cm 左右长的层析柱，其直径在 1 -5cm 范围内，小于 1cm 产生管壁效应，大于 5cm 则稀释现象严重。由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱 (一般制备用凝胶柱，直径大于 2cm , 但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上 ) 。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过 1m。 ⑴ 分组分离时用短柱，一般凝胶柱长 20－30cm ，柱高与直径的比较 5:1─10:1 ，样品溶液体积应小于 凝胶床体积为的 20% 。 ⑵ 分级分离时柱高与直径之线为 20:1─100:1 （层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的 1/1000 ），样品溶液体积 应小于 凝胶床体积为的 5 % 。 ⑶ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为 SephadexG-10 、 15 、 25 或 Bio-Gel-p-2 、 4 、 6 。柱长与直径之比为 5-15 ，样品体积可达柱床体积的 20 — 25 % ，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

（二）凝胶的类型

常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：

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