原稿桑枝总黄酮提取分离及抗氧化活性研究

桑枝总黄酮提取分离及抗氧化活性研究

中文摘要

桑树为灌木或落叶乔木，桑属植物体的各个部分在传统医学上均可入药，历代中国药典均收载了桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹的药用功效。

桑枝是桑科桑属植物桑Morus alba L.的干燥茎，含有很多生物活性的物质，如黄酮、生物碱、甾体、香豆素、二苯乙烯、萜类化合物等，其中黄酮类化合物具有抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤等广泛的生物活性，但尚未得到有效利用。本文以桑枝为原料，对桑枝总黄酮的提取分离纯化及抗氧化活性等方面作了较为系统的研究，主要研究内容和实验结果如下：

1 桑枝皮总黄酮提取工艺的研究

本实验考察了提取时间、乙醇浓度、料液质量浓度及温度对总黄酮提取效果的影响，在此基础上利用正交试验，采用极差和方差分析法确定了总黄酮的最佳提取工艺条件：温度为80℃、料液质量浓度33g/L、乙醇体积分数70%、浸提时间2h。在该条件下，其提取率可达1.01%。

2 桑枝总黄酮的分离纯化

本实验研究了聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的静态吸附和动态吸附的技术参数，聚酰胺树脂静态吸附静态吸附桑枝总黄酮上样量为1：274g/g（净黄酮量：树脂量），动态吸附上样量为1:61（g/g）。上样浓度为2.149mg/ml，上样量为2BV，吸附流速和解析流速均为1ml/min，吸附时间为1h，70%乙醇作为洗脱剂，其总黄酮的洗脱量可达92.29%。 3 一种黄酮类化合物桑色素的分离纯化及鉴定

采用95%乙醇浸提，有机溶剂萃取，聚酰胺树脂吸附色谱法对桑色素进行分离纯化；用薄层层析色谱与高效液相色谱相结合的方式进行定性分析。结果表明此方法可得到高纯度的桑色素。

4 几种黄酮类化合物和桑枝总黄酮体外抗氧化活性的研究

本实验以ve做对照，从清除自由基能力和还原能力两方面评价了芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝提取分离物的抗氧化能力。对DPPH·的清除能力：槲皮素的清除能力最强，是ve的1.4倍，桑色素和桑枝皮总黄酮清除能力相近且弱于槲皮素，芦丁清除能力最弱。在

0.02-0.08mg/ml范围内，槲皮素的还原能力最强，桑色素和桑枝皮总黄酮与ve的还原能力相近且弱于槲皮素，芦丁的还原能力最弱。 5 不同桑树品种资源桑枝总黄酮含量的比较

本实验对西南大学桑树种质资源圃中农民广泛种植的几种桑树栽培品种的桑枝总黄酮含量进行了测定比较，结果显示， 不同品种之间桑枝总黄酮含量的差异较大,嘉陵20号>西农6071>桂优62>嘉陵16号>湖桑32>云桑1号>7920。

关键词：桑枝：总黄酮：提取：分离纯化：抗氧化活性

第一章 文献综述

桑树属桑科（Moraceae）桑属（Morus L .），为落叶乔木或灌木。植物体含乳液，树皮黄褐色，叶互生，卵形或椭圆形，花单性，雌雄异株，雄花成柔荑花序，雌花成穗状花序，花期4月至5月，果期6 月至7月。桑树为多年生叶用经济作物，喜光、耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐烟尘、抗风、抗有毒气体，适应性强，原产我国中部，有约四千年的栽培史，栽培范围广泛，东北自哈尔滨以南；西北从内蒙古南部至新疆、青海、甘肃、陕西；南至广东、广西；东至台湾；西至四川、云南；以长江中下游各地栽培最多，垂直分布大都在海拔1200m以下。

我国是世界上桑种资源最多的国家，共有15个桑种，5个变种。其中栽培的有：鲁桑(M. multicaulis)、白桑 (M．alba)、广东桑(M．atropurpurea)、山桑(M．bombycis)、瑞穗桑(M．mizuho)。野生种有长穗桑(M．wittiorum)、长果桑(M．laevigata)、黑桑(M．nigra)、华桑(M．cathayana)、细齿桑(M．serrata)、蒙桑(M．mongolica)、川桑(M．notabilis)、唐鬼桑(M．nigrifor mis)、滇桑(M．yunnanensis)、鸡桑(M．australis)。变种有鬼桑(M．mongolicavar. duabolica)、大叶白桑(M．alba var. macrophylla)、白脉桑(M．alba var. venose)、垂枝桑(M．albavar. pendula)、鞑靼桑（M．alba var. tatarica）等。

桑枝为桑科植物桑（Morus alba L）的干燥嫩枝, 嫩桑枝呈长圆柱形，表面灰黄色或黄褐色，有黄褐色点状皮孔及细纵纹，并有灰白色略呈半圆形的叶痕和黄棕色的腋芽。质地坚韧不易折断，断面具纤维性，皮部较薄，木部黄白色，射线放射状，髓部白色或黄白色。气微，味淡略苦。

1.1 桑枝的药理作用研究进展

来源于桑科植物(Morus alba L．)的药材，包括桑叶、桑枝、桑椹、桑白皮，具有良好的降血糖、降血脂、提高免疫力、抗衰老等药理活性，对于糖尿病及其并发症有预防和治疗作用，因毒副作用小而适宜长期服用。近年来，国内外学者重点研究了桑类药材的降糖成分和作用机制，同时加强了对其有效单体的分离和筛选。

1.1.1 降血糖作用

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，当胰腺不能产生足够的胰岛素或者人体无法有效地利用所产生的胰岛素时就会出现糖尿病。糖尿病患者体内长期持久的高血糖，将导致各种组织，特别是眼睛、肾脏、神经、心脏及血管的损伤、功能缺陷和衰竭。世界卫生组织最新将糖尿病分为三种类型：Ⅰ型糖尿病（过去称为胰岛素依赖型，青少年或儿童期发病型糖尿病），特征是缺乏胰岛素分泌能力，需要每天注射胰岛素；Ⅱ型糖尿病（过去称为非胰岛素依赖或成人发病型糖尿病）是由于人体无法有效利用胰岛素造成；妊娠期糖尿病，是高血糖症，最早在妊娠期间发病或被确诊[1] 。其中Ⅱ型糖尿病在所有糖尿病患者中占90％-95％。

目前全世界约有1.5亿糖尿病患者，预计到2025年将突破3亿。糖尿病已成为危害人类健康的继

[2]

心脑血管、肿瘤之后的第三大杀手。因此研发治疗糖尿病的药物受到高度重视。

桑枝降血糖药用早有记载，《本草图经》中记载：桑枝“疗遍体风痒干燥，兼疗口干”；《本草纲要》中也记载：桑枝具有“利关节，养津液，行水祛风”的作用，由此可知桑枝除用于风寒湿痹外，还具有“养津液、疗口干”之功效，即可用于治疗糖尿病。α-葡萄糖苷酶抑制剂能够延缓饮食中碳水化合物的分解产物寡糖或二糖水解为葡萄糖,从而减少人体对葡萄糖的摄入, 降低餐后血糖浓度水平，是一类比较成熟地治疗糖尿病的口服药物。F. Ye等

[4]

[3]

研究结果表明，桑枝水提取物在小鼠小肠内具有有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其效果

与α-葡萄糖苷酶抑制剂相似，能够降低由四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠进食后的血糖浓度，并能维持空腹正常小鼠和糖尿病小鼠的血糖浓度水平。吴志平等研究发现，桑叶、桑白皮、桑枝和桑皮 4种中药材的乙醇提取物对链脲佐菌素 ( strep tozotocin STZ)诱导的糖尿病小鼠均具有明显的降血糖作用，其中桑枝的功效最为显著。研究推测促进外周组织特别是肝脏的葡萄糖代谢、提高肝细胞对胰岛素的敏感性可能是桑枝防治Ⅱ型糖尿病作用的机理之一。

[6]

[5]

1.1.2 降血脂作用

血脂异常是血液脂质代谢异常的简称，主要是指血清甘油三酯( TG)、总胆固醇( TC)、低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C) 水平过高，高密度脂蛋白胆固醇( HDL-C) 水平过低。血脂异常是动脉粥样硬化 (As)形成及发展的主要因素。何雪梅等研究表明，桑枝提取物能显著降低高脂血症大鼠的TG、TC、LDL-C和提高HDL-C的含量。吴娱明等研究也表明桑枝水提物和95％乙醇提取物能减低高血脂症小鼠的TG和TC水平，其中95%乙醇提取物与阳性组比较差异极显著。邹宇晓等观察了桑枝提取物对高脂血症小鼠的降脂作用，也发现桑枝提取物能够降低小鼠的TG和TC水平。说明桑枝具有很好的降血脂作用，对动脉粥样硬化的形成和发生也具有一定的预防作用。

[9]

[8]

[7]

1.1.3 抗炎镇痛作用

炎症是血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，病理过程一般分为早期的毛细血管通透性亢进、血管内容物渗出、水肿和晚期的结缔组织增生、肉芽肿形成。陈福君等

[10]

首次报道了桑枝对巴豆油所致小鼠耳肿胀、角叉莱胶所致足浮肿有较强的抑制作用,还可

[11]

抑制醋酸引起的小鼠腹腔液渗出,表现出较强的抗炎活性。王蓉等用桑枝乙醇提取物的不

同萃取部位对小鼠灌胃给药进行抗炎实验表明，石油醚和正丁醇萃取部位对二甲苯导致的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，其中石油醚萃取部位还具有明显的抑制毛细血管通透性的作用。刘明月等

[12]

也证明桑枝95％乙醇提取物能显著抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀、醋酸所致小

鼠腹腔血管内染料的渗出，并显著拮抗鸡蛋清所致小鼠足跖肿胀和滤纸片所诱导的肉芽组织增生。Zuofa Zhang等

[13]

从桑枝中分离到一种cis-mulberroside A，并证明了该化合物对角叉莱

胶所致小鼠足浮肿具有显著地抗炎活性，同时还能有效地缓解由福尔马林所引起的小鼠疼痛反应。说明桑枝具有很好的抗炎止痛作用。

1.1.4 增强免疫力作用

免疫力是人体对各种疾病的抵抗能力，而抵抗力来自体内的免疫系统，它由免疫器官，

免疫细胞及免疫因子组成。免疫力下降或免疫免疫功能失调会导致各种疾病，如败血症、中耳炎、脑膜炎、腹泻、皮肤感染等。研究报道

[14]

，桑枝多糖可显著提高免疫低下小鼠的吞噬

指数，增强网状内皮细胞的吞噬功能和小鼠迟发型变态反应能力，增强T细胞活性。费建明等

[15]

也证实桑枝皮多糖可增强正常小鼠因2，4-二硝基氟苯(DNFB)引起的迟发性变态反应

以及免疫器官的发育和脾脏淋巴细胞增殖能力，并能提高试验组小鼠的血清溶血素抗体积数、碳廓清能力、NK细胞活性和白介素-2(IL-2)。说明桑枝对增强机体免疫力有一定的作用。

1.2 桑枝的化学成分及活性研究进展

桑树在传统医学上全身均可入药，自二十世纪60年代以来，中国、日本、前苏联等国家的学者对桑属植物各个部位的化学成分、生物活性、药理作用、临床应用等方面做了深入的研究。其中桑枝所含化学成分种类较多,主要有黄酮类、 生物碱、多糖、香豆精和茋类化合物,尚含有氨基酸、有机酸、挥发油及多种维生素等。 桑枝中还含有鞣质、游离的蔗糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、水苏糖、果糖、棉籽糖、 阿拉伯糖、唬拍酸和腺嘌呤等。

1.2.1 黄酮类

许延兰等

[16]

首次从广东桑枝中分离到桑皮素（mulberrin）、环桑皮黄素（cyelomulberrin）、

桑辛素（morusin）、环桑黄酮(cyclomorusin)、2，4，4，2\、mulberrofran G、moruchalcone A等7个黄酮类化合物，还分离到了山奈酚（kaempferol）。张庆建等

[17]

在鸡桑桑枝中分离到了五个黄酮类化合物：桑根酮C ( sang genon C)、异甘草黄酮醇( isolicoflavonol) 、二氢桑色素( dihydromorin) 、槲皮素( quercetin) 和山柰酚( kaempferol)；谭永霞

[18]

从桑枝中分离到了6个黄酮类化合物：Quercetin、

5,7,3’,4’-tetrahydroxy-3-methoxyflavone,norartocarpanone,

dihydrokaempferol,euchrenone a7,morachalcone A，此外，桑枝中还含有异槲皮苷（isoquercitrin）、桑酮（maclurin）、桑色素 (morin ) 、环桑色烯素（cyclomulberrochromene）、桑色烯（mulberrochromene）、2,4,4’,6-四经基二苯甲酮(2,4,4’， 6-tetrahydroxystilbene)、2,3’, 4,4’, 6一五经基二苯甲酮(2,3’,4,4’, 6-pentrahydroxybenzophenone)、桦皮酸（betulinic acid）、黎芦酚（reseratrol）、二氢山奈酚（dihydrokaempferol）、氧化芪三酚（oxyresveratrol）、及二氢氧化芪三酚（dihydrooxyres-veratrol）等黄酮类化合物

[19]

。

1.2.2 生物碱

Yoshiaki等

[20]

首次从桑枝中分离到了1一脱氧野民霉素（1-deoxynojirimycin）,陈震等

[21]

在桑枝水提物也分离得到了1-脱氧野民霉素（1-deoxynojirimycin），还分离到了N-甲基-1-脱氧野民霉素(N-methyl-1-deoxynojirimycin),类荞麦碱（fagomine）,4-O-β-D-glucopyranosyl

fagomine三种生物碱，在长穗桑枝中分离到了七种多羟基生物碱fagomine、3-epi-fagomine、1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol、

[18]

：1-deoxynojirimycin、

2-O-D-galactopyranosyl-1-deoxynojirimycin、4-O-β-D-glucopyranosyl fagomine、1,4-dideoxy-1,4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-D-arabinitol。

1.2.3 茋类化合物

茋类化合物主要包括二苯乙烯类,2-苯基苯并呋喃类和茋类低聚物三类。桑枝中二苯乙烯类有

[17]

：resveratrol、oxyresveratrol、4’-prenyloxyresveratrol、3, 3′, 4, 5′-tetrahydroxystilbene,2-[18]

苯基苯并呋喃类有wittifuran (A-D,F,G,J,K,N-T),

1.2.4 多糖

王佩香等

[22]

从桑枝中分离纯化出RMPS1 和 RMPS2 二个多糖组分，其中RMPS1有鼠

李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖组成； RMPS2有鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成。此外桑枝木质部含有丰富的半纤维素和纤维素等多糖成分，桑枝韧皮部还含有果胶成分。

1.2.5 氨基酸类

桑枝中含有18种常见的氨基酸：天冬氨酸(Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly ）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys ）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、色氨酸（Trp）、赖氨酸（Lys）、 精氨酸（Arg），此外还含有其他两种氨基酸

[21]

：γ-氨基丁酸和L -天门冬氨酸。

1.3 黄酮类化合物的研究进展

1.3.1黄酮类化合物的的定义及发展史

黄酮类化合物是自然界广泛存在的一类天然有机化合物，大多具有颜色，是药用植物中的主要活性成分之一。这类化合物多存在于高等植物及羊齿类植物中，苔类植物中也有极少的黄酮类化合物，藻类、微生物、细菌中还没有发现黄酮类化合物的存在。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-7658AOC412'21'33'B6'5'4'O环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮，结构如图所示。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。经过多年对黄酮类化合物生物合成的研究，多数科学家认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。经同位素标记实验证明了A环来自于三个丙二酰辅酶A，而B环则来自于桂皮酰辅酶A。

黄酮类化合物的发现历史悠久。早在20世纪30年代初，欧洲一位药物化学家在研究柠

檬皮的乙醇提取物时无意中得到一种白色结晶，并将其命名为―维生素P‖。动物试验证实：维生素P的抗坏血作用胜过维生素C的10倍。2年后，这位科学家进一步发现：维生素P实际上是一种由黄酮组成的混合物而非单一物质，故后来有人形象地将维生素P更名为柠檬素。据后人研究，柠檬素含多种黄酮，其主要组分为橙皮苷。这位最早发现维生素P的科学家在8年后荣获诺贝尔化学奖，但包括柠檬素在内的黄酮的药用研究却始终未有实质性进展。 20世纪80年代末，法国一家保健食品厂商率先推出一种黄酮类保健新品―碧萝芷‖(Pycnogenol)，它是从法国地中海沿岸地区生长的滨海松树皮中提取的一种黄酮混合物，能预防和治疗西方国家极为常见的冠心病与心肌梗塞等心血管疾病，该产品在上市10年以后，临床医学研究人员不断发现碧萝芷具有抗哮喘、防止长期抽烟引起的脑动脉硬化与脑血栓形成以及降血压等作用。据科学家研究，法国生产的碧萝芷含有极其复杂的黄酮成分，其中包括：儿茶素、表倍儿茶素、紫杉素、原花青素及其单体、2倍体、3倍体与多倍体混合物。此后黄酮类化合物引起了人们的广泛关注。至1814发现第一个黄酮类化合物-白杨素（chrysin）以来，新发现的黄酮类化合物的数量每年都以较快速度增长，1950年以前发现的黄酮类化合物仅104个，截止到1974年，国内外已发表的黄酮类化合物共1674个，而到1993年止，短短的40多年的时间，黄酮类化合物的总数一已达超过了4000个至2000年其总数已超过8000种。

[23]

，据统计

1.3.2 黄酮类化合物的分类及在植物界的分布特点 1.3.2.1黄酮苷的糖的结构分类

天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。组成黄酮苷的糖类主要有：

单糖类：D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-葡萄糖醛酸等。 双糖类：槐糖（Glcβ1-2glc）、龙胆二糖（Glcβ1-6glc）、答香糖（Rhaα1-6glc）、新橙皮糖（Rhaα1－6glC）、刺槐二糖（Rhaа1－6gal等 。

三糖类：龙胆三糖（Glcβ1－6glcβ1－2fru）、槐三糖（glcβ1－2Glcβ1－2glc）等。 酰化糖类：2－乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖等。

1.3.2.2 黄酮类化合物的主要结构类型及分布特点

根据中央三碳的氧化程度、B-环连接位置（2-或3-位）以及三碳化合物是否成环等特点，可将该类化合物分为一下结构类型： 类型 黄酮类（Flavones） 母体结构 分布特点 黄酮类广泛分布于被子植物中，以芸香科、菊科、玄参科、伞形科、苦苣苔科及豆科植物中存在较多。以芹菜素（apigenin）和木犀草素（luteolin）最

为广泛。 黄酮醇类（Flavonol） 黄酮醇类较广泛地分布于双子叶植物，尤其是一些木本植物的花和叶中，以山柰酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）最为常见。 二氢黄酮类 二氢黄酮类分布较普遍，尤其在被子植物的蔷薇科、芸香科、姜科、菊科、杜鹃花科和豆科中分布较多。与黄酮和黄酮醇相比，其结构中C环C2-C3位双键被饱和，他们在植物体内常与相应的黄酮和黄酮醇共存。 二氢黄酮醇类（dihydroflavonol） 二氢黄酮醇类在双子叶植物中分布较普遍，在裸子植物、单子叶植物姜科的少数植物中也有分布，在豆科、蔷薇科植物中较多。 异黄酮类（isoflavone） 异黄酮类主要分布在被子植物中，以豆科鸢尾科及蔷薇科植物居多。具代表性的化合物有大豆素（daidzein）、葛根素（purerarin） 二氢异黄酮类（dihydroisoflavone） 绝大多数分布于豆科植物，仅个别存在于蔷薇科的樱桃属。结构较复杂，如鱼藤酮类。 （dihydroflavone） 查尔酮类（chalcone） 分布广泛，在菊科和豆科植物中分布较多，在极少的蕨类植物和单子叶植物中也有分布。查尔酮C环未成环，可以看作是二氢黄酮在碱性条件下C环开环的产物，两者互为同分异构体，常在植物体内共存。同时两者的转变伴随着颜色的变化。 橙酮或噢哢类（aurones） 在中药中比较少见，多存在于玄参科、菊科、苦苣苔科及单子叶植物莎草科中。是黄酮的同分异构体，属于苯骈呋喃的衍生物，黄花波斯菊花中含有的硫磺菊素就属于此类。

黄烷醇类（flavanols） 包括黄烷-3-醇类和黄烷-3，4-二醇类。黄烷-3-醇的衍生物为儿茶素类，在植物中分布较广，主要存在于含鞣质的木本植物中。黄烷-3，4-二醇衍生物为无色花色素类，其中在含鞣质的木本植物和蕨类植物中存在较多。该类化合物常因分子聚合而具有鞣质的性质。 花色素类（anthocyanidins） 广泛地分布于被子植物中，花色素类是使植物的花、果、叶、茎等呈现各种颜色的化学成分。以矢车菊素（cyanidin）、飞燕草素（delphinidin） 和缔纹天竺素（pelargonidin）以及他们所组成的苷最为常见。 双黄酮类（biflavone） 双黄酮类较集中地分布于除松科以外的裸子植物中，如银杏科、松科、杉科；在苔藓植物、蕨类植物以及被子植物中也有发现。在被子植物中，大约分布于14个科，但较集中于藤黄科Calophyllum和Garcinia两属中，多以amentoflavone及其衍生物存在。 双苯吡酮或呫吨酮类 (xanthones) 主要分布在被子植物的龙胆科、桑科、豆科、远志科、藤黄科中, 其苷类大部分都存在于龙胆科。集中于单子叶植物鸢尾科和百合科。在真菌、地衣、蕨类植物中也有发现。 高异黄酮类 (homo-isoflavones) 高异黄酮类化合物(homoisoflavonoids)是黄酮化合物中特殊的一类，母体结构比异黄酮多1个碳 原子。这类化合物在植物中很少见。主要分布于百合科沿阶草属 （Ophiopogon）、绵枣儿属 （Scilla）、波罗兰属（Eucomis）和蓝

壶花属 （Muscari）等植物中 。在豆科云实属植物金凤花 （Caesalpinia pulcherrima）、苏木（ C．sappan）、鹰叶刺 （C．bonducella）等植物中也有少量发现。

1.3.3 黄酮类化合物的生物活性

黄酮类化合物是药物植物的主要活性成分之一，具有广泛的生物活性。黄酮类化合物具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病及抗衰老等作用。随着研究方法和技术的不断提高，发现黄酮类化合物还具有清除自由基、抗菌消炎、抗过敏、抗病毒、抗癌和提高免疫力等作用。

1.3.3.1 抗氧化、清除自由基的作用

自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统。但自由基产生过多而不能及时地清除，则会导致各种疾病的产生，如动脉粥样硬化、肝损伤、神经退化、癌症等疾病，自由基与人体的衰老也有密切关系。

对自由基的清除能力间接地反应了抗氧化能力。黄酮类物质具有还原性和捕获自由基的特性，在抗氧化反应中不仅能清除链引发阶段的自由基，而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基，阻断自由基链反应，起到预防和断链双重作用[24]。Zhonghong Gao等[25]研究表明，黄芩黄素（baicalein）和黄芩苷（baicalin）对羟自由基（OH·）、DPPH·和烷基自由基（R·）清除能力呈剂量-效应关系。此外，还能有效抑制由含Fe的抗坏血酸、AAPH或NADPH引起的大鼠脑皮质线粒体脂质过氧化,并能明显保护细胞免受H2O2的损伤。黄酮类化合物还能抑制氮氧自由基(NO·)的产生[26]。黄酮类化合物抗氧化活性的强弱与酚羟基的取代位置和数目有关。酚羟基数目越多，抗氧化活性越强。 其中C3羟基具有明显的清除自由基和抗氧化活性的作用[27]。

2+

1.3.3.2 保肝作用

谷丙转案酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是目前临床上反映肝细胞功能最常用的指标，与肝病程度呈正相干。广西藤茶总黄酮能明显降低四氯化碳、D -半乳糖胺和异硫氰酸萘酯致肝损伤小鼠血清中ALT、AST 和T-BL（总胆红素）水平[28]。李素婷等[29]实验也表明，黄芩茎叶总黄酮能够明显抑制H2 O2 和 CCl4 引起的肝细胞培养液中 ALT活性的升高，升高肝细胞存活率，还可明显恢复 H2 O2 引起的肝细胞 MDA含量的升高和 GSH-px活性的降低。

说明黄酮类化合物对肝脏具有一定的保护作用。其机制可能是：通过清除自由基及提高清除自由基酶的活性 ,拮抗自由基引起脂质过氧化反应而发挥肝细胞保护作用的[29]。

1.3.3.3 抗菌消炎作用

梁瑞燕等

[30]

实验表明，柚总黄酮可显著降低小鼠二甲苯所致的耳肿胀度和大鼠角叉菜胶

所致足肿胀,还能显著减轻大鼠棉球肉芽肿重量, 千里光总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、小鼠棉球肉芽肿的形成也有明显的抑制作用，还能抑制醋酸致小鼠毛细血管通透性的增加。表明总黄酮具有较好的抗炎作用

[31]

。此外，黄酮类化合物对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆

[32-34]

菌、黑曲霉和青霉、福氏痢疾杆菌、沙门氏菌、白葡萄球菌都有明显的抑菌作用。

1.3.3.4 抗病毒作用

核因子-kB／Rel蛋白(NF—kB) 是一种分布和作用均十分广泛的真核细胞转录因子, NF-kB的活化可启动细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)的激活和释放，增加天然杀伤（NK）细胞活性，进而增强免疫功能，在抵抗HBV感染中起着关键作用。两种黄酮苷类化合物apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside 和 apigenin-7-O-(6’’-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside具有明显的抗HBV活性,其中黄酮苷中没食子酰基取代基在抗HBV活性中起着至关重要的作用

[35]

。一种双黄酮类化合物-银杏素（ginkgetin）是流感病毒唾液酸酶有效的抑制剂，银杏素-[36]

唾液酸结合物在体内表现出显著地抗流感病毒活性。呼吸道合胞病毒（RSV）是在婴儿时期和儿童早期导致支气管炎和肺炎的主要原因，梁荣感等实验表明，荔枝核黄酮类化合物浓度在128 m g /L以上时, 对RSV 抑制程度达100% 。此外，黄酮类化合物及其衍生物还具有抑制植物性病毒的活性，如Quercetin, quercetin7,4'-dimethyl ether, quercetin 3,7,4'-trimethyl ether,fisetin 4'-methyl ether 能够有效地抑制番茄中TomRSV病毒的传染。

[38]

[37]

1.3.3.5 抗肿瘤作用

对黄酮类化合物的抗肿瘤作用研究，国内外都有较多的报道。主要的作用机制有：抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、干扰细胞信号传导、调节抑癌基因和癌基因关系等。 槲皮素对人胃癌细胞的增长具有显著的抑制作用[39]。染料木素(genistein)、芒柄花黄素 (formononetin)、鸢尾种苷元 (tectorigenin)对人胃癌细胞(BGC) 和人淋巴样白血病细胞(HL 260) 的生长均有不同程度的抑制作用[40]，其中染料木素对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、皮肤癌等也有不同程度的抑制作用[41]。侯华新等[42]发现黄芩黄酮A能抑制人肝癌细胞BEL- 27402 端粒酶的活性从而抑制癌细胞的增值，具有体外抗肿瘤活性。唐勇等[43]实验表明，鸡血藤黄酮类组分具有直接抗肿瘤作用，对人肺癌A549 和人大肠癌 HT229 细胞系有明显生长抑制作用，能阻滞肺癌细胞系 A549于S和G2/M 期，肠癌细胞系HT229于G2/M 期。近年来还有报道黄荆果黄酮类化合物能够诱导人结肠癌细胞COLO 201凋亡，从而有效地抑制了结肠癌细胞的增长[44]。

1.3.3.5 免疫调节的作用

木犀草素和槲皮素均有有免疫调节的作用，可显著促进T、B淋巴细胞转化并增强对白介素Ⅱ的产生[45]。李长彪等[46]研究表明，大豆异黄酮能有效地提高小鼠非特异性免疫功能。在免疫功能低下的机体中，T细胞亚群的表达处于抑制状态 ,黄芪总黄酮能选择性的提高 CD4 +T H1细胞 ,使以 IFN-γ为主的T H1细胞处于优势状态，从而抑制了以 IL-4 为主的 T H2 细胞的表达，增强了机体的细胞免疫功能[47]。罗丽萍等[48]研究表明，蔓总黄酮能显著提高正常和免疫低下小鼠的廓清指数 K，提高单核巨噬细胞系统的吞噬功能，增强小鼠的非特异性免疫功能。

第二章 引言

2.1 研究背景

我国是世界蚕丝业的发源地，也是世界上最大的蚕茧和生丝生产国，其总产量约占到全世界的70%左右。但我国的传统蚕丝业产业链单一，抵御市场风险的能力较弱。桑树除可供采叶养蚕外，还产生大量的桑枝。目前桑枝均以燃料为主要用途，价值十分低廉。因此急需依靠科技，对其进行深入地开发研究，变废为宝，以期提高其经济价值。

桑枝作为传统中药，始载于《本草图经》：味苦性平，具有祛风除湿，利关节、行水、清热、消食除积、补肾、利尿和益肺气等作用，临床上常用于治疗风寒湿痹、哮喘咳嗽、咳血、神经痛、神经麻痹、四肢痉挛、脚气浮肿和肌体风痒等症，多用于风湿痹痛[49、50] 。

自二十世纪60年代以来，中国、日本、前苏联等国家的学者对桑属植物各个部位的化学成分、生物活性、药理作用、临床应用等方面做了深入的研究。前人研究发现桑枝中含有很多具有生物活性的化合物，如黄酮类、 生物碱、多糖、香豆精和茋类化合物。其中黄酮类

化合物具有降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病及抗氧化、抗衰老、抗菌消炎、抗过敏、

抗病毒、抗癌和提高免疫力等作用。

这些化合物往往对人类有较大的利用价值。因此，很有必要对桑枝中的化合物及其生物活性进行研究，为今后的桑资源开发利用奠定基础。

2.2 研究目的和意义

本文主要对桑枝中的黄酮类化合物进行了研究，一是可以提高桑树的附加值、为增加农民种桑收入奠定基础，从而提高农民栽桑养蚕的积极性。二是能够为桑资源的开发利用提供理论依据，从而提高桑资源的利用率。

2.3 研究内容

（1）本研究以西南大学生物技术学院桑树种质资源圃中嘉陵20号的桑枝为材料，对提取时间、乙醇浓度、料液质量浓度及温度对桑枝总黄酮提取效果进行了单因素实验，在此基础上利用正交试验，采用极差和方差分析法确定了桑枝皮总黄酮的最佳提取工艺条件。

（2）以聚酰胺为材料，通过静态和动态吸附实验，研究了了聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的最佳技术参数。

（3）采用95%乙醇浸提，有机溶剂萃取，聚酰胺树脂吸附色谱法对桑色素进行分离纯化；用薄层层析色谱与高效液相色谱相结合的方式进行定性分析，确定了分离纯化及鉴定桑色素的技术路线和方法。

（4）以ve做对照，从清除自由基能力和还原能力两方面评价了芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝提取分离物的抗氧化能力。

（5）利用 NaNO2 -Al(NO3)3-NaOH分光光度法测定了农民广泛种植的几种桑树栽培品种桑枝总黄酮含量并对其差异性进行了比较。

2.4 技术路线

2.4.1桑枝总黄酮粗提工艺优化

利用实验的仪器设备条件对人工三倍体嘉陵20桑枝总黄酮进行粗体工艺优化，技术路线如图1所示:

桑枝粉末 单因素条件下提取 不同时间 不同乙醇浓度 不同温度 不同料液比 提取液 提取液 提取液 提取液 计算提取率 设置正交实验 计算提取率 正交实验最优组合 重现性实验 精密度实验 加样回收实验 稳定性实验 结果与分析

2.4.2聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的研究

采用聚酰胺树脂对嘉陵20桑枝总黄酮进行分离纯化，技术路线如图2所示:。

桑枝 95%乙醇 浸 提 滤渣 滤液 减压浓缩 浓缩液 萃取 新树脂 预处理 氯仿 部分 薄层检测 水 部 分 乙 部 酸 分 乙 酯 精制树脂 装 柱 上 样 上样 弃去 弃去 浓缩液 树脂柱床 70%乙醇洗脱 洗脱液 薄层检测 无效成分 洗脱液 有效成分洗脱液 减压浓缩 弃去 浓缩液 HPLC检测

第三章 桑枝总黄酮粗提工艺优化

桑枝作为传统中药材，具有泻肺利水、祛风湿、利关节、补肝益肾等多种药效[51]。其主要活性成分为黄酮类化合物，包括桑色素（morin）、桑素(mulberrin)、桑色烯

(mulberrochromene)、环桑素(cyclomulberrin)、环桑色烯(cyclomulberrochromene)和桑酮(kuwanon)等。黄酮类化合物具有抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤等广泛的生物活性。

研究表明，不同的提取方法及工艺条件对桑树中各种活性成分的提取效率具有显著影响

[52-54]

。为此，本试验从提取温度、时间、料液质量浓度、溶剂浓度等几个方面对桑枝总黄酮

的提取工艺进行了优化，为桑枝中黄酮的进一步研究及桑枝的开发利用提供技术参考。

3.1材料和方法 3.1.1材料 3.1.1.1供试材料

桑树品种为嘉陵20号的新鲜桑枝，采自西南大学生物技术学院桑树种质资源圃。将新鲜桑枝皮在80℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎待用。

3.1.1.2主要仪器：

电子天平（FA2104，上海精天电子仪器有限公司）

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9071A，上海一恒科技有限公司） 数显恒温水浴锅（HH-2 ，国华电气有限公司）

T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 旋转蒸发仪（RE52-99，上海亚荣生化仪器厂）

3.1.1.3 主要试剂

芦丁标准品（上海生工生物工程技术服务有限公司）

乙醇、Al(NO3) 3、NaOH、NaNO2（分析纯，成都科龙化工试剂厂） 3.1.2 方法

3.1.2.1 芦丁标准曲线的绘制[55]

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品 0.10 g ，用 30% 的乙醇溶解并定容至1000 mL，分别准确吸取1.0 mL、2.0 mL、3.0mL、4.0 mL、5.0 mL置于10mL 容量瓶中，各加 30% 的乙醇至 5.0 mL，加 5% 的亚硝酸钠 0.4 mL，摇匀，放置 5 min，再加 10% 的硝酸铝溶液 0.4 mL，摇匀，放置 5 min，加 4% 的氢氧化钠溶液 4.0 mL，摇匀，最后加 30% 的乙醇定容至10mL，放置 10 min。试剂空白作参比，在波长 510 nm 处测定其吸光度。以芦丁质量浓度 (mg/mL) 为横坐标，吸光值（OD） 为纵坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程为：Y=12.07X-0.0019（R2=0.9995）。

3.1.2.2 桑枝总黄酮的提取及含量的测定

将桑枝粉末用0.1g/mL石油醚浸泡1h，倾出石油醚，挥发至干，制成桑枝粉末样品。称取桑枝粉末样品若干份（1.00g/份）分别用不同浓度的乙醇溶液在单因素实验设计的条件下提取总黄酮。将不同工艺条件下获得的提取液分别用相应浓度的乙醇定容至100ml，再分别准确量取2.0ml，按照“3.1.2.1”的方法测定吸光值后，根据回归方程计算提取液中总黄酮的质量浓度。

3.1.2.3 桑枝总黄酮的提取率计算[56]

桑枝总黄酮得率（%）= [c×10×100/(m×1000)] ×100；式中：c为总黄酮浓度（mg/mL），2m为桑枝皮质量（g）。

3.1.2.4 桑枝总黄酮提取工艺条件的单因素试验

以提取温度50℃、原料质量浓度50g/L、乙醇体积分数30%作为基本条件，分别设置不同的提取时间、乙醇体积分数、原料质量浓度、提取温度做单因子平行试验，每个试验设置3个重复。以样品总黄酮得率为考察指标。

3.1.2.5 桑枝皮总黄酮提取工艺条件的正交试验

根据单因素试验的结果选择提取温度、乙醇浓度、原料质量浓度、提取时间4 因素中有意义的3个水平作正交试验。应用 L9(3) 正交表进行优选，并采用极差分析和方差分析法确定最佳提取工艺条件。数据统计分析软件为DPS 7.05 专业版本。

4

3.1.2.6 重复性试验

准确称取 1.00 g 桑枝皮粉5份，用石油醚处理后，以最佳提取工艺进行 5 次平行试验，按照“3.1.2.1”的方法测定样品总黄酮含量。

3.1.2.7 精密度试验

以最佳提取工艺制备提取液，分别准确量取 2.0 mL 于 5 个 10 mL容量瓶中，按照“3.1.2.1”的方法对样品总黄酮含量的测定。

3.1.2.8 加样回收试验

准确称取已知总黄酮含量的桑枝粉末5份，每份 1.00 g，用石油醚处理后，分别加入一定量的芦丁标准品，以最佳提取工艺制备提取液，然后按照“3.1.2.1”的方法进行总黄酮含量的测定，计算回收率。

3.1.2.9 稳定性试验

准确称取 1.00 g 桑枝皮粉末，用石油醚处理后，以最佳提取工艺条件进行试验，每隔10min 测定一次样品吸光度，以检验亚硝酸钠-硝酸铝比色法中生成络合物的稳定性。

3.2 结果与分析

3.2.1 单因素试验的桑枝总黄酮最佳提取工艺条件 3.2.1.1提取时间

采用50 g/L桑枝粉末样品，以30%乙醇作溶剂，在50℃下分别浸提60、90、120、150、180 min，考察对桑枝总黄酮的提取效果的影响，结果以提取时间120 min为宜，桑枝总黄酮的得率达到0.55%（图1）。

Extraction rate of total 0.6000.5000.400

总黄酮得率/%

Flavonoids 0.3000.2000.1000.0000306090120150180210 t / min 图中的三条线为三次重复，图2-4

The three lines represent three repeated experiments,respectively the same in fig.2 to 4

图 1 不同提取时间的桑枝皮总黄酮提取效果

Fig.1 Effects of various extraction durations on total flavonoids from mulberry barks

3.2.1.2 溶剂乙醇浓度

采用50 g/L桑枝粉末样品，在 50℃下，分别用30％、40％、50％、60％、70％乙醇溶液浸提120 min。结果显示，随着乙醇浓度的升高，桑枝皮总黄酮的得率也逐渐增加，但当溶剂乙醇的体积分数超过60%后，桑枝皮总黄酮的得率无明显变化（图2）。因此，选择60%乙醇作溶剂。

Extraction rate of total 0.8000.7000.600

总黄酮得率/%

Flavonoids 0.5000.4000.3000.2000.1000.000203040 50607080 φ（乙醇）/ % ethanol concentration 图 2 不同乙醇浓度的桑枝皮总黄酮提取效果

Fig.2 Effects of various ethanol concentration total flavonoids from mulberry barks

3.2.1.3 原料质量浓度

以60%乙醇作溶剂，在提取温度50℃条件下，分别对20、25、33、50、100g/L的桑枝粉末样品浸提120min，以25 g/L桑枝粉末样品的总黄酮提取效果最好（图3）。

1.000.90 0204060Extraction rate of total 0.800.70总黄酮得率/% Flavonoids 0.600.500.400.300.200.100.00 80-1100120ρ（原料）/（g·L） Raw material

图 3不同原料质量浓度的桑枝皮总黄酮提取效果

Fig.3 Effects of various raw material mass concentration o on total flavonoids from

mulberry barks

3.2.1.4 提取温度

采用25 g/L桑枝皮粉末样品，以60%乙醇作溶剂，在分别以30、40、50、60、70、80、90℃的提取温度浸提120 min，结果表明，总黄酮提取得率随温度升高而增加，当温度为80℃时达到最高，但提取温度继续升高时提取得率又显著下降。因此，提取温度选择 80℃为宜。

1.40Extraction rate of total 1.20 总黄酮得率/%

Flavonoids

1.000.800.600.400.200.000102030405060708090100 t / ℃

from mulberry barks

水平 Level of factor

A 提取时间/min Extraction time

图 4 不同提取温度的桑枝皮总黄酮提取效果

Fig.4 Effects of various extraction temperatures on total flavonoids from mulberry barks

3.2.2桑枝皮总黄酮提取工艺条件的优化

在上述单因素试验的基础上，采用正交试验方法优选最佳提取工艺。按4因素3水平设计（表1），考察提取时间(A)、乙醇体积分数（B）、原料质量浓度(C)、提取温度(D)对桑枝皮总黄酮提取效果的影响程度，各因素的影响程度依次为 B＞D＞A>C（表2）。据各对应水平的效应估计值，桑枝皮总黄酮的最佳提取条件为：提取时间150 min、乙醇体积分数70%、原料质量浓度20 g/L、提取温度80℃。从表3可以看出，溶剂乙醇的浓度和提取温度对桑枝皮总黄酮提取得率有非常显著的影响，而提取时间对总黄酮提取得率影响程度较小，可将优化方案中的 A3 换为 A2，同时原料质量浓度之间的差异也不显著，为节约成本，可取优化方案中的C1。最终确定桑皮总黄酮的最佳提取工艺条件选择表2中的6号组合：提取时间120 min，溶剂乙醇的体积分数为70%，原料质量浓度33g/L，提取温度80℃。

表 1桑枝皮总黄酮提取工艺条件优化试验因素水平设计

Table1 Design of factors and levels for optimization of technological conditions in total flavonoids extraction

因

素 Factor

B

乙醇体积分数/ % Ethanol volume fraction

C

原料质量浓度/（g·L） Row material Mass concentration

of

-1

D 提取温度/℃ Extractiom temperature

1 2 3

90 120 150

50 60 70

33 25 20

70 80 90

表 2 桑枝皮总黄酮提取工艺条件优化 L9(3) 正交试验

Table 2 L9(34) Orthogonal on technogical conditons for total flavonoids extraction from mulberry barks

试验编号Test No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9

90 90 90 120 120 120 150 150 150

50 60 70 50 60 70 50 60 70 6.58 7.15 8.66 0.73 0.79 0.96 0.23

33 25 20 25 20 33 20 33 25 7.49 7.41 7.49 0.83 0.82 0.83 0.01

70 80 90 90 70 80 80 90 70 6.46 8.04 7.89 0.72 0.89 0.88 0.18

A

B

C

D

总黄酮得率/（Extraction rate

of total flavonoids 0.62 0.88 1.01 0.77 0.62 0.97 0.87 0.93 0.73

0.54 0.82 0.96 0.77 0.59 1.06 0.84 0.88 1.01

0.65 0.80 1.01 0.72 0.79 1.00 0.80 0.84 0.91

1.82 2.51 2.98 2.26 2.00 3.03 2.51 2.66 2.65

1）

4

Tr

2）

T1 T 2 T 3

7.29 7.29 7.81 0.81 0.81 0.87 0.06

T=22.41

xxx1 2 3

极差

Range

1）

3组平行试验 Three group of parallel test

Tr 三组平行试验总黄酮体积分数之和

1）

2）

Tr represents the sum of extraction rates of total flavonoids from three groups of parallell tests

2）

表3 桑枝皮总黄酮提取工艺条件优化结果的方差分析

Table3 Variance analysis of the optimized results of technogical conditons for total flavonoids extraction from

mulberry barks

变异来源 Source A B C D

误差Error

总变异Total variation

平方和 Sum of squares

0.0012 0.0102 0.0001 0.0065 0.087 5 =0.1055

自由度 Degrees of freedom

2 2 2 2 18 26

均方 Mean square 0.0100 0.1284 0.0002 0.0845 0.004 9

F值 F values 2.0594 26.3953**

<1 17.3793**

F0.05 F0.01

3.55

6.01

注：* 表示当F值> F0.05具有显著性差异 **表示F值> F0.01具有极显著性差异

* represents significant difference when F value>F0.05 and ** represents extremely significant difference when F value>F0.01

3.2.3 重现性试验结果

按选定的最佳提取条件A2B3C1D2进行5次平行试验（表4）。结果表明，用此工艺提取桑枝总黄酮，相对标准偏差较小，结果重现性好，该工艺稳定可行。

表 4 重现性试验结果

Table 4 reproducibility experiment of results

序号numbler 得率yield（%）

RSD%

1 1.08

2 1.13

3 1.08

3.04

4 1.13

5 1.06

3.2.4 精密度试验结果

从精密度试验结果（表5）。可以看出，用分光光度法测定桑枝皮总黄酮含量，相对标准偏差较小，精密度高，所得数据可靠。

表 5 精密度试验结果

Table 5 Precision experiment of results

序号 numbler 得率yield（%）

1 1.08

2 1.08

3 1.08

4 1.04

5 1.07

RSD% 1.61

3.2.5 加样回收实验

加样回收实验（表6）显示，回收率在97-112%之间，平均回收率为 104%，RSD=8.33%，表明该方法准确度较高，此工艺提取桑枝总黄酮可取。

表 6 加样回收试验结果

Table 6 Recovry experiment of results

试验号 numbler

样品中总黄酮含量（mg） 芦丁加入量(mg)

Flavonoids Content

amount of additive

of rutin 1 2 3 4 5

测

定

量

(mg)

回收率% recovery rate

平均回收率% average recovery rate 104

8.33 RSD%

measuredquantity

10.10 10.10 10.10 10.10 10.10

3.0 4.3 5.8 7.3 8.6

13.46 14.95 15.56 17.89 18.47

111.97 112.08 93.62 106.73 97.34.

3.2.6 稳定性试验

稳定性实验（表7）结果表明，相对标准偏差较小，表明黄酮类化合物与亚硝酸钠——硝酸铝比色法中生成络合物在1h内相对的稳定。可以以此作为试验基础。

表 7 稳定性试验结果

Table 7 Stability experiment of results 时间 time

10min 20min 30min 40min 50min 60min

吸光度absorbance 0.289 0.292 0.290 0.294 0.295 0.292 RSD% 0.67

3.2.7 小结

本试验确定了桑枝总黄酮最佳提取工艺条件为提取温度80℃、原料质量浓度33g/L、乙醇体积分数70%、提取时间120min，重现性和加样回收试验结果显示其工艺条件稳定可行，在此工艺条件下桑枝皮总黄酮的得率可达1.01％。

3.3 讨论

本试验采用紫外分光光度计测定桑枝提取液总黄酮含量，操作简单易行，但由于桑枝成分复杂，黄酮类成分主要吸收范围内仍可能有其它成分产生吸收而干扰测定，可能导致本试

验所测定总黄酮含量偏高，因此测定方法还有待进一步提高。同时，仅以芦丁作为对照品来测定桑枝总黄酮含量的方法还不够完善，因为提取物中含有多种黄酮成分，芦丁的最大紫外吸收波长并不一定是其它黄酮的最大吸收波长，可能会导致总黄酮含量的测定存在一定的误差。但本方法操作简便，对仪器设备的要求不高，适合生产过程中总黄酮含量的检测。

在本试验确定的桑枝总黄酮最佳提取工艺条件中，提取温度为80℃，这与文献［56-58］所报道的其它几种植物总黄酮的最佳提取温度相同。虽然黄酮和多酚的结构都比较稳定，但高温时酚羟基可能被氧化，一般提取具有生物活性的物质温度不易长时间高温性物质的提取率变化不显著的情况下，应该尽可能地降低提取温度。

[59]

，因此在活

第四章 聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的研究

聚酰胺( Polyamide)是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物,层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66，是中药提取分离纯化中常用的优良吸附剂。其优点是：性质稳定，无有害残留物，可重复使用多次。

树脂分离技术的操作方法可分为两种类型：静态吸附分离和动态吸附分离。静态吸附法是一种最为简单原始的方法，吸附效率差，该方法是将一定数量的吸附树脂与样品液混合并搅拌，然后采用过滤、倾泻、离心等方法将吸附了样液树脂与溶液分离。然后用合适的溶剂对树脂进行静态洗脱。静态法一般用于实验室研究，主要探讨影响吸附分离的因素，并进行工艺条件的优化。动态吸附法又称为管柱法，是将待处理的样液通过装有树脂的层析柱，在此过程中，药液首先与柱的上部树脂接触，并首先达到吸附饱和状态，然后这种吸附饱和状态逐渐向下推移，构成色谱带，当全部树脂吸附到一定程度，待欲分离的有效成分开始渗漏，停止动态吸附，静置吸附一段时间后，用合适溶剂洗脱吸附于树脂上的有效成分

[60]

。动态吸

附主要为了综合考察树脂的各种性能指标，如流速、水洗量、洗脱剂用量、洗脱率等。

本实验通过静态吸附试验和动态吸附试验相结合的方法，考察了聚酰胺树脂分离纯化总黄酮的最佳技术参数。

4.1材料和方法 4.1.1材料 4.1.1.1供试材料

桑树品种为嘉陵20号的新鲜桑枝，采自西南大学生物技术学院桑树种质资源圃。将新鲜桑枝皮在80℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎待用。

4.1.1.2主要仪器

玻璃层析柱（直径2.5cm，长度30cm，上海信谊仪器厂） 电子天平（FA2104，上海精天电子仪器有限公司）

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9071A，上海一恒科技有限公司） 数显恒温水浴锅（HH-2 ，国华电气有限公司）

T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 旋转蒸发仪（RE52-99，上海亚荣生化仪器厂）

4.1.1.3 主要试剂

聚酰胺（80-100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

芦丁标准品（上海生工生物工程技术服务有限公司）

乙醇、Al(NO3) 3、NaOH、NaNO2（分析纯，成都科龙化工试剂厂）

4.1.2 方法

4.1.2.1 聚酰胺树脂的预处理和再生

取聚酰胺用90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。再依次用2-2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用

[61]

使用过的聚酰胺一般用5%氢氧化钠溶液洗涤，然后水洗，再用10%醋酸液洗，然

后用蒸馏水洗至中性，即可。

4.1.2.2 桑枝总黄酮提取液的制备

按照“第三章”所确定的最佳提取桑枝总黄酮的参数条件制备提取液，将提取液浓缩至干，用一定浓度的乙醇溶液稀释成已知浓度的总黄酮提取液，备用。

4.1.2.3 静态吸附参数的考察 4.1.2.3.1上样量的确定

分别取聚酰胺1、2、3、4g置于四个50ml的锥形瓶中，加入适量的水使聚酰胺充分吸附膨胀（本试验所用聚酰胺均做此处理），再分别加入一定浓度的桑枝总黄酮提取液，每隔一段时间震摇一次，使其达到饱和吸附吸附，静止24h，吸取上清液测定总黄酮浓度，再折算成黄酮吸附量和吸附率。黄酮吸附量=[(初始浓度－吸附后浓度)×吸附液体积]/树脂量，黄酮吸附率＝(初始浓度－吸附后浓度)/ 初始浓度）。

4.1.2.3.2 吸附时间的确定

取一定质量的聚酰胺于锥形瓶中，按最佳上样量上样，震摇后静置，分别在不同时间段取样，测定黄酮浓度，再换算成吸附量。以时间为横坐标，吸附量（mg/g）为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线图。

4.1.2.3.3 洗脱剂乙醇浓度的选择

取一定质量的聚酰胺于锥形瓶中，按最佳上样量上样，待充分吸附后，分离出

树脂，晾干，再分别加入浓度为20、30、40、50、60、70、80、90、100%的乙醇溶液各100ml，连续震摇2h后静止一段时间，使其充分解析。取上清液测定总黄酮浓度，计算解析率。 黄酮解析量＝（解析后浓度×解析液体积）/树脂量，解析率%=（黄酮解析量/黄酮吸附量）×100

4.1.2.4 动态吸附参数的考察 4.1.2.4.1吸附流速的选择

取聚酰胺3g装入适宜大小的层析柱中，按最佳上样量上样，分别以0.5、1、2ml/min的流速上样，收集各流速下的洗脱液，测定流出液总黄酮浓度，计算出吸附率。

4.1.2.4.2 吸附浓度的选择

取1g聚酰胺（6份）分别装入适宜大小的层析柱中，按最佳上样量上样，分别测定黄酮浓度，再计算出吸附率。以上样黄酮浓度为横坐标，吸附率为纵坐标做曲线图。

4.1.2.4.3泄露曲线的绘制

准确称取取5g聚酰胺于层析柱（柱高30cm，内径2.5cm）中，测定其树脂柱床体积为20ml，按最佳上样量上样，分段收集流出液，每10ml为1份，分别测定其黄酮浓度，绘制泄露曲线。

4.1.2.4.4 不同乙醇浓度对黄酮洗脱量的影响

准确称取100g聚酰胺于层析柱中，按最佳上样量上样。先用水洗脱至无色，然后分别用浓度 10％、30％、50%、70％、95%的乙醇溶液进行梯度洗脱,洗脱至洗脱液无色为止，收集不同浓度的乙醇洗脱液于烧杯中,再将各浓度洗脱液浓缩干燥，测定黄酮含量。

4.2 结果与分析

4.2.1 静态吸附试验 4.2.1.1 上样量的确定

分别取聚酰胺1、2、3、4g置于四个50ml的锥形瓶中，分别加入20ml，总黄酮浓度为0.363mg/ml提取液，每隔一段时间震摇一次，使其达到饱和吸附吸附后静止24h，吸取上清液测定总黄酮浓度，再折算成黄酮吸附量和吸附率。结果见表一。

表一 不同上样量的静态吸附测定结果

净黄酮量：树脂量（g/g） 吸附后浓度（mg/ml）

黄酮吸附量（mg/g）

黄酮吸附率（%）

1：137 1：274 1：411 1：548

0.093 0.028 0.009 0.005

5.402 3.351 2.358 1.794

74.353 92.257 97.389 98.757

由表一可以看出，黄酮量和树脂量比例不同，吸附率也不同。当黄酮量与树脂量的比值为1:247时，树脂吸附率为92.257%，聚酰胺树脂吸附总黄酮量基本达到饱和，因此上样量为1:274较为适宜。

4.2.1.2 聚酰胺静态吸附动力学研究

按1:247上样量上样，准确称取4g聚酰胺树脂于100ml锥形瓶中，加入40ml，黄酮浓度为0.363mg/ml提取液液，震摇后静置，分别在不同吸附时间0.25hmin、0.5h、1h、2h、3h、4h取样，计算黄酮吸附量。以时间为横坐标，吸附量（mg/g）为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线图。

吸附量（mg/g） 3.4503.440 3.4303.420 3.410 3.4003.3903.3803.3703.3603.350 0 图1.静态吸附动力学曲线

0.511.522.533.544.5时间（h） 从图1可以看出，1小时内吸附量变化较大，1h到2h之间吸附量变化趋于平缓，2h后吸附动力学曲线接近直线，达到吸附平衡。在实际应用中，为提高生产效率，上样后静态吸附时间1h为宜。

4.2.1.3 乙醇洗脱剂浓度的选择

基于所选洗脱剂廉价、低毒、宜回收、环保等因素综合考虑，选乙醇做为洗脱剂最适宜。 准确称取2g（9份）聚酰胺分别置于9个锥形瓶中，加入20ml，黄酮浓度为0.363mg/ml的提取液，待充分吸附后，分离出树脂，晾干，再分别加入浓度为20、30、40、50、60、70、80、90、100%的乙醇溶液各100ml，连续震摇2h后静止一段时间，使其充分解析。取上清液测定总黄酮浓度，计算解析率。结果如表2

表二 洗脱剂浓度对解析率的影响 乙醇浓度（%） 20 30 40 50 黄酮吸附量mg/g 2.40 2.41 2.41 2.42 黄酮解析量mg/g 0 0 0.11 0.13 0.00 0.00 4.43 5.33 解析率（%）

60 70 80 90 100 2.37 2.39 2.37 2.36 2.27 1.59 2.22 2.22 2.36 2.28 67.22 92.59 93.39 100.00 100.00 由表二结果表明， 20-50%乙醇解析效率低，浓度达到60%以上解析率明显增高，浓度超过70%解析率达到90%以上，因此可用30%乙醇除去杂质，用70%乙醇作为洗脱剂。

4.2.2 动态吸附试验

4.2.2.2 吸附流速和洗脱流速的选择

取聚酰胺3g装入适宜大小的层析柱中，取样品液30ml，黄酮浓度为0.289mg/ml的提取液，分别以0.5、1.2ml/min的流速上样，收集各流速下的洗脱液，测定流出液总黄酮浓度，计算吸附率。结果如表三

表三，吸附流速的确定

吸附流速（ml/min） 吸附量（mg/g） 吸附率（%） 0.5 1 2 7.109 7.071 6.239 82.314 81.882 72.241 上述结果表明，吸附流速是影响吸附率的一个重要因素之一，吸附流速越慢，有利于聚酰胺对黄酮的充分吸附，吸附效果就越好。反之，吸附流速太快，黄酮没有被充分吸附就随流出液流出，结果与陈凯云等吸附速度为1ml/min。

通常情况下洗脱流速是吸附流速1/3-1/2

[60]

[62]

类似。但为保证黄酮既能被充分吸收又能提高效率，本实验选择

,洗脱流速一般都要求慢,这是因为流速过快,

洗脱性能差,洗脱带宽,且拖尾严重,洗脱不完全，而且严重浪费溶剂；流速过慢,洗脱时间延长，生产效率又会降低。因此本试验采用了1ml/min的洗脱流速。

4.2.2.3吸附浓度的选择

取1g聚酰胺（6份）分别装入适宜大小的层析柱中，对应加入15ml,黄酮浓度分别为1.031、1.605、2.149、3.363、4.410、8.808mg/ml的提取液，使其充分吸附后放出流出液，分别测定黄酮浓度，计算吸附率。以上样黄酮浓度为横坐标，吸附率为纵坐标做曲线图。如图2所示。

90.00%

88.00?.00?.00%

吸附率 82.00?.00x.00v.00t.00%

图2上样浓度对吸附率得影响

由图2可知，随着黄酮浓度的增大，吸附率也有所提高，但当浓度超过2.149mg/ml时，因样品过浓成浸膏状，不利于扩散和吸附，反而吸附率开始下降。故选择上样浓度在2.149mg/ml左右为宜。

4.2.2.4 泄露曲线的绘制

准确称取取5g聚酰胺于层析柱中，测其树脂柱床体积为20ml，取黄酮浓度2.040mg/ml提取液170ml上样，分段收集流出液，每10ml为1份，分别测定其黄酮浓度，绘制泄露曲线。如图4

1.2

流出液黄酮浓度（mg/ml） 10.8 0123456780.60.40.20 柱床体积（BV）

图4 泄露曲线图

由泄露曲线可知，从2.5BV（即第5份，50ml）开始，流出液黄酮浓度明显增大，说明此时黄酮开始明显泄露，当6BV（即12份，120ml）时，吸附基本趋于饱和。故在黄酮浓度为2.040mg/ml时，最大上样量为2BV（即40ml）最好。将其换算成净黄酮量和树脂量的比值，最佳上样量约为1:61g/g，与静态吸附上样量（1：274）相比，动态吸附效率明显高于静态吸附效率。

4.2.2.5不同乙醇浓度对黄酮洗脱量的影响

准确称取100g聚酰胺于层析柱中，取黄酮浓度为1.95mg/ml的样品液187ml上样。先用水洗脱至无色，然后分别用浓度 10％、30％、50%、70％、95%的乙醇溶液进行梯度洗脱,洗脱至洗脱液无色为止，收集不同浓度的乙醇洗脱液于烧杯中,再将各浓度洗脱液浓缩干燥，测定黄酮含量。结果如表四、表五

表四 不同乙醇浓度洗脱所得黄酮含量

乙醇浓度 （%） 10 30 50 70 95 黄酮含量（mg） 4.300 6.785 73.728 20.313 8.778 占洗脱得总黄酮比例% 3.78 5.96 64.73 17.83 7.71

表五 不同浓度乙醇洗脱混合后黄酮的含量 8%4%6%乙醇浓度% 10、30、50、70、95 10、30、50、70、 10、30、50 10、30、 10 混合物总黄酮含量mg 113.904 105.126 84.814 11.085 4.300 占洗脱得总黄酮比例% 100 92.29 74.46 9.73 3.78 183451 2 3 4 5 10%乙醇洗脱黄酮量 30%乙醇洗脱黄酮量 50%乙醇洗脱黄酮量 70%乙醇洗脱黄酮量 95%乙醇洗脱黄酮量 64%图五 不同乙醇浓度洗脱所得黄酮比例示意图 从表4、表5、图5 可以看出，10%、30％、50％、70％乙醇洗脱混合物黄酮量的量占洗脱所得总黄酮的 92％，占洗脱所得得总黄酮绝大部分。而10%、30％乙醇洗脱混合物黄酮量仅占洗脱所得总黄酮的 10％。考虑到成本和效益问题，因此可用70%乙醇作为洗脱剂较为适宜。这与静态吸附实验结果较为一致。

4.2.2.6 本章小结

本实验从静态吸附实验和动态吸附实验两个方面研究了聚酰胺树脂分离纯化桑枝总黄酮的工艺条件。综合成本和效益两方面考虑，静态吸附上样量为1：274g/g，动态吸附上样量可为1:61（g/g）。上样浓度在2.149mg/ml左右，上样量为2BV，吸附流速和洗脱流速均为1ml/min，吸附时间为1h，用30%乙醇去除杂质，70%乙醇作为洗脱剂。

4.3 讨论

聚酰胺的层析机理目前主要有两种说法：一种是“氢键吸附”学说，一种是“双重层析理论”。聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基团, 酰胺基团上的O、N原子在酸性介质中结合质子而带正电荷，以静电引力形成吸附溶液中的阴离子，故可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等富含酚羟基的化合物形成氢键而吸附，吸附的强度主要取决于这两种化合物中羟基的数目与位置、以及溶剂与化合物或溶剂与聚酰胺之间形成氢键的缔合能力大小。溶剂分子与聚酰胺或黄酮类化合物形成氢键缔合的能力越强,则聚酰胺对这两种物质吸附作用越弱。聚酰胺层析柱即是利用此性质对各种植物中黄酮、茶多酚等进行吸附、洗脱而分离的,即所谓的“氢键吸附”学说[63]。但此学说不能解释当以氯仿：甲醇为洗脱液时，为何黄酮甙元比黄酮甙先洗脱下来。“双重层析理论”则认为当用极性流动相(含水溶剂系统)洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，当用有机溶剂洗脱时，聚酰胺作为极性固定相，其层析行为类似正相分配层析。但固定相 (吸附剂)的极性是由其本身结构及性质决定的，不应随洗脱液的改变而改变，况且聚酰胺层析属于吸附层析，不是分配层析。因此这两种理论都没有很好解释聚酰胺的层析机理。

第五章 桑枝中桑色素的分离纯化及其鉴定

桑色素（morin）是从黄桑木、桑橙树等桑科植物的树皮和许多中草药中提取到的一种浅黄色色素

[64]

，属于黄酮类化合物，是一种天然的具有生物活性的物质。桑色素最早用于分

[65]

析化学，作为荧光指示剂普遍应用在荧光分析中。现代药理研究表明，桑色素具有抗肿瘤抗炎免疫

[66、67]

、

、抗氧化

[68]

等作用。此外，桑色素还具有抗金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和伤

寒杆菌的作用

[69]

。但迄今为止，对桑色素的提取分离纯化还未见报道。为此本实验对桑枝中

桑色素的提取分离纯化作了初步的探索，为桑资源中桑色素进一步研究和桑枝条的开发利用奠定理论基础。

5.1材料和方法 5.1.1材料 5.1.1.1供试材料

桑树品种为嘉陵20号的新鲜桑枝，采自西南大学生物技术学院桑树种质资源圃。将新鲜桑枝皮在80℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎待用。

5.1.1.2主要仪器

薄层层析硅胶板（10×20cm，烟台江友硅胶开发有限公司） 玻璃点样毛细管（0.3×100mm，华西医科大学仪器厂）。 玻璃层析柱（上海信谊仪器厂）

电子天平（FA2104，上海精天电子仪器有限公司）

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9071A，上海一恒科技有限公司） 数显恒温水浴锅（HH-2 ，国华电气有限公司）

T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 旋转蒸发仪（BUCHI R-210，瑞士BUCHI公司）

暗箱式紫外分析仪（IF-20D，巩义市仪器有限责任公司）

5.1.1.3主要试剂

桑色素(分析标准品,上海晶纯试剂有限公司）

甲醇、乙醇、氯仿、冰乙酸、磷酸(分析纯，为成都科龙化工试剂生产) 甲醇（色谱纯,上海星可生化有限公司）。

聚酰胺（80-100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

5.1.2 方法 5.1.2.1 提取

将15kg桑枝用95%的工业乙醇浸泡7天，过滤，滤渣反复浸提3次，合并滤液，于45℃减压浓缩至浸膏。

5.1.2.2 萃取

浸膏用适量的蒸馏水溶解，分别用1L乙酸乙酯和氯仿萃取，萃取液以桑色素标准品为对照，利用TLC（硅胶薄层层析）法检测。

5.1.2.3 桑色素的分离纯化

将含有桑色素的萃取液浓缩，上80-100目聚酰胺柱，70%乙醇洗脱，洗脱液以柱体积为单位进行检测。再将含有桑色素的洗脱液浓缩，上80-100目的聚酰胺柱，70%乙醇洗脱，反复纯化至较高纯度。

5.1.2.4 高效液相色谱定性检测

1 色谱条件

symmetry?C-18(4.6×150mm)色谱柱，流动相为甲醇：水：磷酸，体积比为（50：49.8：0.2），流速1mL/min，柱温30℃，检测波长370nm，进样量10uL。 2 样品液的制备

分别将适量的标准品和含有桑色素的洗脱液的浓缩物用色谱乙醇溶解，再用微孔滤膜过滤，过滤液经高效液相色谱检测。

5.2 结果与分析

5.2.1 萃取液薄层色谱检测

将萃取液所得的乙酸乙酯、氯仿和水部分点样于薄层层析高效硅胶板上，以氯仿：甲醇：醋酸（20：1：4）为展开剂，1%硝酸铝醇溶液显色后于365nm紫外灯下观察。结果如图1所示：标准品显绿色荧光，在与标准品RF值相同的位置，仅样品1有与标准品颜色相同的物质，说明桑色素在乙酸乙酯部分。

图1萃取液的薄层层析图

Fig.1 Extraction of Thin-layer chromatography picture

注：（1乙酸乙酯部分、2标准样、3氯仿部分、4水部分）

5.2.2 桑色素的定性鉴定 5.2.2.1 TLC鉴定

将经聚酰胺分离纯化后的洗脱液适当浓缩，点样于薄层层析高效硅胶板上，以氯仿：甲醇：醋酸（15：5：2）为展开剂展开， 1%硝酸铝醇溶液显色后于365 nm紫外光下观察。结果如图2所示，在与标准品RF值相同的位置，样品1、样品2和样品3都有与标准品颜色相同的物质，显绿色荧光。但样品1还有带蓝色荧光和淡绿色荧光的物质，样品2还有带淡绿色荧光的物质，样品3仅有带绿色荧光的物质。说明萃取液用聚酰胺一次分离后，桑色素的纯度已较高，仅含有带蓝色荧光和淡绿色荧光的两类物质，用聚酰胺再次分离后，带蓝色荧光的物质被除去，仅含有带淡绿色荧光的物质。结果表明聚酰胺能很好地分离纯化桑色素，经三次分离则能得到高纯度的桑色素。此外，聚酰胺对各种黄酮类化合物都有较好的分离效果

[70]

。

图2 经聚酰胺分离纯化后的TLC图

Fig.2 Thin-layer chromatography picture of purification by polyamide

注：（1经聚酰胺第一次分离的样品、2经聚酰胺第二次分离的样品、3经聚酰胺第三次分离的样品、4标准品） Note:(1 the first time separation of sample 2 the second time separation of sample 3 the third time separation of sample 4 standard samples)

5.2.3 反相高效液相色谱的定性鉴定

用反相高效液相色谱对其进行定性鉴定，结果如图3、图4和图5所示，经分离纯化后，待测样品和桑色素标准品在同一色谱条件下的单一色谱峰具有相同保留时间，说明本试验所得到的高纯度物质为桑色素,大概纯度>95%。有文献报道桑色素在250nm、300nm和350nm

处有吸收峰

[71]

，从本实验色谱图中可以看出，色谱峰单一且峰形很好，表明在370nm处桑

色素也具有良好的吸收峰。

图3标准样品色谱峰

Fig.3 Chromatographic peak of standard sample

图4 乙酸乙酯浸膏部分色谱峰

Chromatographic peak of ethyl acetate extract part

图5分离样品色谱峰

Fig.4 Chromatographic peak of sample by purification

5.2.4 小结

本章对桑枝皮中桑色素的提取分离纯化做了定性研究，用工业乙醇浸提，乙酸乙酯萃取，再用聚酰胺树脂分离，70%乙醇作为洗脱剂，可得到高纯度的桑色素。

5.4讨论

选择合适的展开剂是薄层色谱分析的关键, 其影响因素为展开剂和待分离样品。本试验所分离的桑色素由于羟基较多，酸性较强，拖尾现象严重，加入醋酸后拖尾现象有所减轻。在展开剂中加入有机酸可防止待分离物质在分离过程中的扩散,从而减少拖尾现象

[72]

。此外，在展开剂中加几滴甲酸或冰醋酸，展开时以氨水饱合，减少点样量等方法

均可减小拖尾现象。

在用高效液相色谱鉴定时，为改善拖尾峰，本试验采用甲醇-磷酸-水溶液（0.4%磷酸溶液）作为流动相。但磷酸对柱子的填料损害较大，为保持柱子的稳定性，延长使用寿命，应尽量降低磷酸溶液的浓度。因此流动相条件还有待进一步改进。

第六章 几种黄酮类化合物和桑枝总黄酮体外抗氧化活性的

研究

自由基是指一类可以独立存在的含有未配对电子的物质，包括分子、原子、原子团或离子。人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。自由基过量产生可引起不同程度的细胞毒性及瞬时的不可逆损伤过程中，机体自身的抗氧化防御体系能够维持体内氧自由基平衡

[74]

[73]

。在正常生理

，一旦机体发生病变或者

受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用）进而引发机体自由基稳衡态紊乱,产生多余自由基,从而导致细胞损伤，引起心脏病、动脉粥样硬化、肝病、糖尿病、机体老化、癌症等疾病。

目前由于合成的一些抗氧化剂如叔丁基对甲酚（BHT）、叔丁基羟基回香醚（BHA）、叔丁基氢醌（TBHQ）没食子酸丙酯（PG）等存在毒服和致癌作用等安全问题

[75]

，以及人们

越来越追求绿色环保消费，因而寻求一些天然的抗氧化剂成为国内外研究的热点，而黄酮类化合物多具有广泛的抗氧化活性，主要表现在减少自由基的产生和清除自由基两个方面

[76]

。

本实验以ve做对照，从清除自由基能力和还原能力两方面评价了几种黄酮类化合物芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝总黄酮提取物的抗氧化能力，为桑树中黄酮类化合物的开发利用奠定理论基础。

6.1材料和方法 6.1.1材料 6.1.1.1供试材料

桑树品种为嘉陵20号的新鲜桑枝，采自西南大学生物技术学院桑树种质资源圃。将新鲜桑枝皮在80℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎待用。

6.1.1.2主要仪器

全自动酶标仪（imark， 日本）

玻璃层析柱（上海信谊仪器厂）

电子天平（FA2104，上海精天电子仪器有限公司）

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9071A，上海一恒科技有限公司） 数显恒温水浴锅（HH-2 ，国华电气有限公司） 旋转蒸发仪（BUCHI R-210，瑞士BUCHI公司）

6.1.1.3主要试剂

芦丁、桑色素、槲皮素(分析标准品,上海晶纯试剂有限公司） DPPH、Ve、ABTS、

高硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸二氢钾、氢氧化钾、 (AR，成都市科龙化工试剂产)

聚酰胺（80-100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

6. 2 方法

6.2.1桑枝总黄酮提取液的制备

按照“第三章”所确定的最佳提取桑枝总黄酮的参数条件制备提取液，将提取液浓缩至干，用一定浓度的乙醇溶液稀释成已知浓度的总黄酮提取液，备用。

6.2.2 清除（DPPH·）能力的测定

参照Mohammad

[77]

的方法并略作修改。分别将Ve、芦丁、槲皮素、桑色素、桑枝皮总

黄酮配制成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml的样品液，配制800mM DPPH（95%乙醇溶解）溶液，在96微孔板中按表一加样，摇匀，37℃下放置30min后于490nm处测定吸光值。以VE做阳性对照，通过公式：清除率%=[1-(A1-A2)/ B1-B2）]×100计算清除率

表一DPPH自由基清除实验加样表(体积单位ul) 95%乙醇 样品液 DPPH溶液

A1 - 100 100 A2 100 100 - B1 100 - 100 B2 200 - - 6.2.3 清除（ABTS+·）能力的测定

采用Roberta

[78]

的方法加以修改。ABTS液的配制

[79]

：用蒸馏水配制7mmol／L的ABTS溶液

和140mmol／L的高硫酸钾溶液，分别取20ml ABTS溶液和352ul高硫酸钾溶液混合过夜，用时用乙醇将混合液稀释至吸光值OD750为0．700± 0.005。在96微孔板中按表二加样，室温静置10min后于750nm处测定吸光值。通过公式：清除率%=[1-(A1-A2)/ B1-B2）]×100计算清除率，根据清除率采用originPro8软件计算IC50（清除率为50%时所需要的抗氧化剂浓度）值。

表二ABTS+自由基清除实验加样表(体积单位ul)

95%乙醇 样品液 ABTS+溶液 A1 - 100 100 A2 100 100 - B1 100 - 100 B2 200 - - 6.2.4 还原能力的测定

采用Oyaizu

[80]

的方法略加修改，取450ul的样品液于5ml的试管中，依次加入450ul磷酸

盐缓冲液(0.2mol/L，pH=6.6)和450ul，1%铁氰化钾溶液，混匀，50℃水浴20min后快速冷却，加入450ul 10%三氯乙酸（TCA）终止反应10min，再加1.8ml蒸馏水和100ul，0.1%三氯化铁（Fecl3）反应10min后于700nm 处测其吸光度(用蒸馏水代替样品液作试剂空白对照)。

6.3 结果与分析

6.3.1 芦丁、槲皮素、桑色素、桑枝总黄酮对（DPPH·）的清除效果

807060 00.02Ve芦丁槲皮素桑色素桑枝皮总黄酮清除率（%） 50403020100 0.040.060.080.10.12浓度（mg/ml） 图一 清除DPPH·作用 由图一可知，芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝皮总黄酮对DPPH·都有较强清除能力，并在试验浓度范围内具有明显剂量效应关系。槲皮素的清除能力在0.02-0.05mg/ml左右比Ve稍强，随浓度的增高清除能力弱于ve；桑色素和桑枝皮总黄酮清除能力相当，但明显比槲皮素弱，比芦丁强；当浓度大于0.06mg/ml时，ve和槲皮素的清除率均趋于一条直线，说明在此浓度下ve和槲皮素的清除能力达到最大值，清除率70%以上。随浓度的增加，桑色素和桑枝皮总黄酮的清除率还具有增高的趋势。

6.3.2 芦丁、槲皮素、桑色素、桑枝总黄酮对（ABTS+·）清除效果

120100 Ve芦丁槲皮素桑色素清除率（%）

8060402000 0.02桑枝皮总黄酮

0.040.060.080.10.12浓度（mg/ml）

图二 清除ABTS+·作用

ABTS+·与DPPH·相同，都是合成的有机自由基，本身也都带有颜色，且颜色的深浅与吸光度呈正比。由图二可知，芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝皮总黄酮都能较好地清除ABTS+自由基，在一定的浓度范围内，清除率与浓度均有良好的线性关系。在0.02-0.08mg/ml范围内，桑枝皮总黄酮清除ABTS+·的能力明显高于其它三种黄酮类化合物，当浓度为0.1mg/ml

时，桑枝皮总黄酮的清除率接近95%，略低于VE（此浓度下Ve的清除率达到100%），芦丁在实验浓度范围内，清除ABTS+·能力最弱。

6.3.3 芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝皮总黄酮清除DPPH·、ABTS+·的IC50值的比较

0.10.090.080.070.060.050.040.030.020.010DPPH· ABTS+·Ve芦丁槲皮素桑色素桑枝皮总黄酮IC50值 图三 清除DPPH·、ABTS+·的IC50值的比较

IC50是指自由基清除剂对自由基的清除率达到50％时的自由基清除剂的浓度，IC50值越小，表明对自由基的清除能力越强；反之，越弱。由图三可知,对DPPH·清除的能力：槲皮素 >Ve>（桑色素=桑枝皮总黄酮）>芦丁,槲皮素清除DPPH·能力约是Ve、桑色素、桑枝皮总黄酮和芦丁1.4、2、2、3.3倍。但对ABTS+·的清除能力则是桑枝皮总黄酮>槲皮素>Ve桑色素>芦丁，桑枝皮总黄酮对ABTS+·的清除能力约是槲皮素、ve、桑色素和芦丁的2、2.3、2.6、3倍。

6.3.4 芦丁、槲皮素、桑色素、桑枝皮总黄酮还原能力的测定

0.80.70.60.5 00.020.04Ve芦丁槲皮素桑色素桑枝皮总黄酮吸光度 0.40.30.20.10 0.060.080.10.12浓度（mg/ml）

图四 还原能力的测定

样品的还原能力越强，普鲁士蓝[Fe(Fe(CN)6)3]在 700nm 下吸光值就越高，因此由图

三可知，各样品液都具有一定的还原能力，且浓度越高，所表现出的还原能力越强。 在

0.02-0.08mg/ml范围内，同等浓度下槲皮素的还原能力最强，桑色素和桑枝皮总黄酮与ve

的还原能力相近，芦丁的还原能力最弱。还原能力的高低可间接反映抗氧化能力的强弱，因此该实验与清除（DPPH·）的实验结果相近。

6.3.5 小结

本实验从清除DPPH·ABTS+·以及还原能力的测定三个方面对三种黄酮类化合物（芦丁、槲皮素、桑色素）和从桑枝皮提取分离到的总黄酮的抗氧化能力进行了研究，以Ve作对照，利用分光光度法分别测定了对DPPH·ABTS+·的清除能力和还原力能力。结果显示，三种黄酮类化合物和从桑枝皮提取分离到的总黄酮都有较强的清除能力。其中槲皮素对DPPH·的清除能力是ve的1.4倍，清除能力最强，桑色素次之，芦丁最弱。而桑枝皮总黄酮和槲皮素对ABTS+·清除能力都比ve强，其中桑枝皮总黄酮的清除能力最强，大约是Ve的2.3倍，桑色素次之，芦丁最弱。在一定范围内，同等浓度下槲皮素的还原能力最强，桑色素和桑枝皮总黄酮次之，芦丁的还原能力也最弱。但芦丁在较高浓度下也具有较强的清除DPPH·ABTS+·的能力和还原力。

6.4 讨论

DPPH·(1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，2，2一diphenyl一1一picry—hydrazyl radica1)是一类较为稳定的自由基，是评价抗氧化物清除自由基活性的常用自由基

[81]

，它是一种稳定的

以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517nm处有强烈吸收，在有自由基清除剂存在时， 自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小

[82]

。ABTS+·也是一种稳定的

自由基，呈蓝绿色，是由ABTS-(NH4)2[2,2’-连氮基-双（3-乙基并二氢噻唑-6-磺酸）二铵盐]经强氧化剂氧化而来,在734nm附近有强吸收峰，当有自由基清除剂存在时，ABTS+·的单电子被配对而使颜色变浅，在734nm波长处的吸光度将会变小，吸光度变小程度与自由基被清除的程度呈定量关系，因而可用来测定自由基清除剂的抗氧化能力。

样品中具有还原力的成分可以将铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还原为亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6）,亚铁氰化钾再与三价铁离子作用形成普鲁士蓝[Fe(Fe(CN)6)3], 普鲁士蓝在 700nm 下吸光值越高，表示样品还原能力越强。一般情况下,样品的还原能力与其抗氧化活性之间有显著的相关性，还原能力的高低可以间接反映抗氧化能力的强弱

[83]

。

评价一种物质的抗氧化活性通常是看它对自由基的清除能力，多以抑制率或半抑制浓度（IC50）作为衡量标准。但大多数是针对物质清除某一种自由基而言，并不能反映出其总的抗氧化能力，因为物质总的抗氧化能力是物质清除不同的自由基或者是物质的不同活性成分清除不同的自由基的有效和

[84]

。

第七章不同桑树品种资源总黄酮含量的测定

我国桑属植物资源十分丰富、品种繁多、生物学性状各异。桑树作为药食两用食品，不同品种，不同产地，不同季节的桑树主要活性成分都存在差异性，黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位,目前，对桑树不同品种、不同部位和不同季节所含黄酮类物质有较广泛的研究， 但目前对不同品种及不同季节采集的桑枝黄酮含量及药理作用等还少有报道。为此，本实验比较分析了几种常见栽培品种桑枝总黄酮的含量的差异，为进一步开展中药桑枝药理学研究及药材质量标准化应用提供依据。

7.1材料和方法 7.1.1材料 7.1.1.1供试材料

桑树品种采自西南大学生物技术学院桑树种质资源圃。品种为7920、桑1号、湖桑32、嘉陵16号、桂优62、西农6071和嘉陵20号，将新鲜桑枝皮在80℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎待用。

7.1.1.2主要仪器

电子天平（FA2104，上海精天电子仪器有限公司）

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9071A，上海一恒科技有限公司） 数显恒温水浴锅（HH-2 ，国华电气有限公司）

T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。 旋转蒸发仪（BUCHI R-210，瑞士BUCHI公司）

7.1.1.3主要试剂

芦丁标准品（上海生工生物工程技术服务有限公司）

乙醇、Al(NO3) 3、NaOH、NaNO2（分析纯，成都科龙化工试剂厂） 7.2 方法

7.1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

按照“第三章”，“3.1.2.1”的方法绘制芦丁标准曲线 7.1.2.2 桑枝总黄酮的提取及含量的测定

分别取1g的7920、桑1号、湖桑32、嘉陵16号、桂优62、西农6071和嘉陵20号桑枝粉末，按照“第三章”所确定的最佳工艺条件提取桑枝总黄酮，将不同的提取液用70%乙醇定容至100ml，再分别准确量取2.0ml，按照“第三章”，“3.1.2.1”的方法测定吸光值后，根据回归方程计算提取液中总黄酮的质量浓度。每个品种设置三个重复,计算桑枝黄酮含量的平均值。

7.1.2.3 桑枝总黄酮的含量的计算

桑枝总黄酮含量（mg/g）（%）= [c×10×100/m]；式中：c为总黄酮浓度（mg/mL），m2为桑枝皮质量（g）。

7.2 结果与分析

结果如表一所示, 不同品种之间桑枝总黄酮含量的差异较大,变幅在7.699-11.676mg/g之间，品种7920含量最低，仅为7.699mg/g，云桑1号、湖桑32和嘉陵16号含量均在10mg/g左右，此三者最高含量与最低含量相差0.3mg/g以上，三者约为品种7920黄酮含量的1.3倍。桂优62和西农6071和嘉陵20号黄酮含量均在11mg/g以上，其中桂优62和西农6071含量相差不大，嘉陵20号含量最高，高达11.676mg/g。此三者黄酮含量约为品种7920的1.5倍左右。

表一 不同品种桑枝总黄酮含量 品种名称 7920 云桑1号 湖桑32 嘉陵16号 桂优62 西农6071 嘉陵20号 黄酮含量mg/g 7.699 10.246 10.495 10.557 11.303 11.365 11.676 7.2.3 小结

不同品种之间桑枝总黄酮含量的差异较大,7920黄酮含量最低，仅7.699mg/g；嘉陵20号含量最高，高达11.676mg/g。各品种桑枝黄酮含量大小为：嘉陵20号>西农6071>桂优62>嘉陵16号>湖桑32>云桑1号>7920。

7.3讨论

不同季节

[85]

，不同生长时期

[86]

，不同品种

[87]

桑树黄酮含量是不同的。由于不同品种、不

同生长时期对体内各种活性成分积累的影响不同, 植物活性成分的含量也随生长发育时期而改变。并且，在外界环境的影响下植物会产生种内次生长代谢产物的多型性

[88]

。

本试验测定不同品种桑枝总黄酮含量的差异较大, 可能与不同品种的生物学特性及生理生化代谢差异有关。

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