进口农副产品的转基因检测

分类号：TS201.7 密 级：公开

单位代码：085231 学 号：13208523117432

大连工业大 学

专业硕士学位论文

中文题目：进口农副产品转基因筛选与品系检测

英文题目： Genetically modified ingredients and maizes

detection of imported agricultural products

专业领域： 食品工程 隶属学院： 食品学院 研究生： 杨静

指导教师： 张公亮 副教授

董伟峰 高级工程师

2015年 5 月

学位论文独创性声明

本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或其他机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

学生签名： 杨静

关于硕士学位论文使用授权的说明

论文题目： 进口农副产品转基因筛选与品系检测 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。

保密的学位论文在解密后也遵守此规定。

是否保密（ 否 ），保密期至 年 月 日为止。

学生签名： 杨静 导师签名： 张公亮

2015年 5 月 19 日

摘 要

摘 要

随着转基因作物的迅速发展，转基因产品已经迅速进入到人们的生活中。为了维护自己国家的安全，很多国家都对要求转基因食品中转基因成分能够有效地被检测出来。这进一步对检测机构提出了严格的要求，所以完善检验标准十分迫切。

本试验应用两种不同的试剂盒对四种不同加工程度的转基因玉米进行提取，并用实时荧光仪7500和viia 7对玉米品系MON810、Bt11、T25、CBH351、GA21、MON863、NK603、TCl507、59122、MIR604、MIRl62、DP98140、3272、TCl507、BT176、MON88017、Bt176的检出率进行了分析，接着比较实时荧光PCR和基因芯片的检出率。文章最后我们对几种具有代表性的待检样品进行了初筛和品系鉴定，实验结论如下：

（1）对于加工程度比较轻的产品或是未加工产品，采用TAKARA试剂盒提取后，基因芯片法检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11，MIR604、GA21、T25等外源基因，而实时荧光PCR反应并没有检出GA21、T25，基因芯片法的检出率比较高，宜采用基因芯片进行检测；

（2）精加工玉米产品可采用天根实际盒进行提取后，实时荧光仪7500和VIIA 7进行实时荧光PCR反应，和应用基因芯片法都检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604等外源品系，检出率相同；

（3）对于深加工产品玉米酒槽粕，采用天根实际盒在实时荧光仪7500上进行检测，检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604等外源品系，实时荧光PCR仪viia7和基因芯片法检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017等外源品系，实时荧光PCR仪7500的检出率更高； 本实验结合了实时荧光PCR和基因芯片技术对进口农副产品进行了检测分析，两种方法的检测结果准确、检测周期短、特异性强、灵敏度高，能够符合并满足日常检测的需要。可以用于加工食品中转基因玉米成分及品系的定性检测, 也可以作为常规PCR定性方法的确证试验方法。

关键词：转基因；实时荧光PCR；基因芯片；定性检测

I

Abstract

Abstract

With the rapid development of transgenic crops, genetically modified products has rapidly into people's lives.In order to safeguard the security of own country, many countries have requirement for genetically modified genetically modified foods can be effectively detected. This further testing organization made stringent requirements, it is very urgent to improve inspection standards.

In this study , two different kits for four different levels of transgenic corn processing to extract ,and analyzed detection sensitivity with quantitative real-time PCR 7500 and viia 7 though strains of maize MON810、Bt11、T25、CBH351、GA21、MON863、NK603、TCl507、59122、MIR604、MIRl62、DP98140、3272、TCl507、BT176、MON88017、Bt176, and then compare the detection rate between real-time PCR and gene chip . Finally, several representative samples were screened and strain identification, experimental results are as follows:

(1) For the degree of processing relatively light products or unprocessed goods,with TAKARA extraction kit, the chip method detected Tc1507、 NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017、BT11、MIR604、GA21、 T25 substandard genes, and real-time PCR reaction did not detection of GA21、T25, gene chip method detection rate is relatively high, should be detected by gene chip；

(2) For the refined corn products ,with tiangen extraction kit, real-time fluorescence analyzer 7500 and real-time fluorescence viia 7 and gene chip are detected Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017、 BT11、MIR604 substandard source strains, the detection rate is same;

(3) For the corn deep processing corn wine scums ,with tiangen extraction kit ,real-time fluorescence analyzer 7500 detected Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、 MON88017、BT11、MIR604 substandard source strains, real-time fluorescence analyze viia7 and gene chips detected Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 substandard source line,7500 has a higher detection rate.

This experiment was used a combination of real-time PCR and gene chip technology to analyze the import of agricultural products were tested, the two methods has accurately detect short cycle, specificity, high sensitivity, and can meet the needs of daily testing. This method can be used for the qualitative detection of transgenic corn processed food ingredients and strains but can also be used as a confirmatory test methods qualitative conventional PCR methods.

Keywords:GMO；real-time PCR; gene chip; qualitative detection

II

目 录

目 录

第一章 绪 论 ................................................. 1

1.1研究背景 ........................................................... 1

1.1.1转基因发展概况 ............................................... 1 1.1.2玉米、马铃薯转基因品系鉴定现状 ............................... 1

1.1.2.1转基因玉米品系鉴定现状 ..................................... 1 1.1.2.2转基因马铃薯品系鉴定现状 ................................... 2

1.2 转基因植物提取方法概述 ............................................ 2

1.2.1十六烷基三乙基澳化馁(CTAB)法 ................................. 2 1.2.2十二烷基磺酸钠(SDS)法 ........................................ 3 1.2.3离心柱吸附提取DNA ............................................ 3 1.2.4磁珠法提取DNA ................................................ 3 1.2.5全自动核酸提取工作站 ......................................... 4 1.3聚合酶链式反应(PCR)技术 ............................................ 4

1.3.1定性PCR技术优势 ............................................. 4 1.3.2 PCR方法分类 ................................................. 5

1.3.2.1 普通PCR .................................................. 5 1.3.2.2 多重PCR ................................................... 5 1.3.2.3 实时荧光定量PCR技术 ....................................... 5 1.3.2.3.1实时荧光定量PCR技术原理 ................................. 6 1.3.2.3.2实时荧光定量PCR技术应用 ................................. 6 1.3.2.4巢式PCR .................................................... 7 1.3.2.5 其他PCR方法 ............................................... 7

1.4生物芯片技术 ....................................................... 7

1.4.1基因芯片技术 ................................................. 8 1.4.1.1 基因芯片技术原理 ........................................... 8 1.4.1.2基因芯片技术分类 ........................................... 9 1.4.1.3基因芯片技术的发展现状 ..................................... 9 1.4.1.4基因芯片技术的应用 ......................................... 9

III

目 录

1.4.1.4.1在食品微生物检测中的应用 ................................. 9 1.4.1.4.2在转基因食品检测中的应用 ................................ 10 1.4.1.5 基因芯片存在问题与展望 .................................... 10 1.5 本实验研究的主要目的和意义 ....................................... 11

第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系 ........................................................ 12

2.1 实验材料 ......................................................... 12 2.2 实验仪器与试剂 ................................................... 12

2.2.1 实验仪器 .................................................... 12 2.2.2 实验试剂与耗材 .............................................. 13 2.3 两种试剂盒的提取方法以及效率比较 ................................. 13

2.3.1 提取方法 .................................................... 13 2.3.1.1 离心柱法（TIANGEN） ....................................... 13 2.3.1.2 离心柱法（TAKARA） ........................................ 14 2.3.2玉米样品DNA浓度的测定 ...................................... 14 2.4 实时荧光PCR反应 ................................................. 14 2.5结果与讨论 ........................................................ 16

2.5.1不同加工程度玉米DNA浓度测定结果 ............................ 16 2.5.2 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系 .......................... 18 2.5.2.1玉米颗粒6743的扩增效果分析 ............................... 18 2.5.2.2粉碎玉米粒7167的扩增效果分析 ............................. 19 2.5.2.3玉米粉6979扩增效果分析 ................................... 21 2.5.2.4玉米酒槽粕4504扩增效果分析 ............................... 22 2.6 本章小结 ......................................................... 24

第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系 ............... 25

3.1 基因芯片方法 .................................................... 25 3.2 利用基因芯片筛选玉米中转基因品系的结果 .......................... 25

3.2.1玉米颗粒6743的芯片结果 ..................................... 26 3.2.2粉碎玉米粒7167的芯片结果 ................................... 26 3.2.3 玉米粉6979的芯片结果 ....................................... 27 3.2.4 玉米酒槽粕4504的芯片结果 ................................... 28

3.3 基因芯片法和实时荧光PCR反应检测结果对比 ......................... 29

IV

目 录

3.4 本章小结 ......................................................... 30

第四章 薯格、干酵母转基因成分的检测以及品系鉴定 ....... 31

4.1进口薯格中转基因成分的检测 ........................................ 31

4.1.1实验方法 .................................................... 31 4.1.2结果与讨论 .................................................. 31 4.1.2.1 薯格中转基因成分的初筛 .................................... 31 4.1.2.2薯格中转基因品系检测结果 .................................. 32 4.2干酵母中转基因成分的测定以及品系鉴定 .............................. 33

4.2.1实验方法 .................................................... 34 4.2.2结果与讨论 .................................................. 34 4.2.2.1 干酵母中转基因成分的初筛 .................................. 34 4.2.2.2干酵母中转基因品系筛选结果 ................................ 35

参考文献 .............................................. 36 致 谢 ............................................... 39

V

第一章 绪论

第一章 绪 论

1.1研究背景 1.1.1转基因发展概况

转基因产品对我们来说已然不陌生，便是使用分子生物学技术把人们所需要的某些

物种的基因转接到一些物种中去，向着人们所需要的性状发展。近年来转基因技术发展快速，在农作物生产利用方面相当广泛，主要用于防治虫害和提高农作物产量等方面，转基因大豆、棉花、玉米、大米等农作物无论是品质还是产量都得到了较大的改善。一方面，转基因作物的迅速发展也引起人们对转基因作物所带来的食品安全的关注，关于转基因食品是否安全地话题从未终止；另一方面，尽管转基因食品的安全性并没有得到确定性的验证，但是由于转基因食品的巨大利益和前景，全球大多数国家都根据不同的需要进口转基因作物[1]。就标识问题而言，雀巢公司作为世界最大的食品生产公司之一，在1999年到2009年期间，被检出很多食品具有转基因成分，包括婴儿纯米粉、甘脆朱古力、百福豆乳、凤仙雪条、百福豆腐花巢等，对此，中华人民共和国农业部农业回复: ―国家对农业转基因生物实行标识制度‖[2]，也就是说要进入中国国境的转基因食品，必须具有转基因标识; 没有标识或者是标识不符合规定的，禁止进口或销售。

上个世纪80年代，科学家以烟草为材料，成功地研制出了世界上第一个转基因作物，自此以后，转基因技术得到了迅速的发展。如今人们接触到产品很多都含有转基因成分，比如说大豆、水稻、马铃薯和棉花、西红柿等。目前我国转基因作物的进口量十分巨大，尤其是转基因大豆和玉米的进口。 1.1.2玉米、马铃薯转基因品系鉴定现状 1.1.2.1转基因玉米品系鉴定现状

目前，依据我国农业部的最新公告：SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》中规定了对玉米Btl l、T14/T25、DAS．59122、CBH351、MIR604、3272、GA21、 MON88017、Evebtl76、MON89034、MON810、NK603、TCl507、MON87460、

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第一章 绪论

MON863品系中转基因成分的定性检测[3]。伴着转基因的进一步发展，科学家将越来越多的重组DNA导入到农作物中，刘岩等[4]将脱氢酶基因gutD从大肠杆菌分离出来，并将其导入玉米中。Li等[5]从盐芥中获取了TsVP基因，并将其导入玉米基因组中。然而这些导入的片段很多都无法检测。因为转基因片段插入的随机和不可控性, 这就要求检验检疫人员尽最大努力的检测到所有外源基因, 让人们有选择和知情的权利。除了上述我国行业标准中有明确规定的转基因玉米品系, 欧盟标准中还有我国未批准的转基因玉米Btl0、Bt176、98140、LY038等品系，对于这些品系，我国并没有明确的公告及方法，检测的准确性也不高。

1.1.2.2转基因马铃薯品系鉴定现状

马铃薯(Solunum tuberosum)，高淀粉茄科作物，京杭收到害虫的侵袭，出于获得优良的植物品系，人们通过应用转基因技术获得高抗虫、高含量、高蛋白质的马铃薯品种

[6]

。当前，商业化种植的转基因马铃薯分为两类，包括抗病毒和抗马铃薯甲虫两种[7]。

重组马铃薯多选用tbcS座为启动子，NOS为终止子，NPTII作为荧光筛选基因。

1.2 转基因植物提取方法概述

随着植物转基因技术的广泛开展，全世界的学者们建立了多种植物DNA提取方法[8]。总结这些方法，我们发现这些DNA的提取方法原则上基本相同，主要机理都是通过破碎细胞，获得DNA，去除蛋白质、多糖等杂质，最后分离提纯DNA等一系列步骤。在DNA提取过程中，蛋白质、多糖及次生代谢产物，这些植物中固有的成分影响DNA的提取纯度；而且细胞内多酚的存在可能会降解植物DNA，降低限制性内切酶、DNA聚合酶及DNA连接酶等的生物活性，对后续的检测必然造成影响[9.10]。十二烷基磺酸钠(SDS)法和十六烷基三乙基澳化胺(CTAB)法、DNA提取试剂盒法、磁珠吸附法是现前经常使用的提取DNA的方法[11] 。 1.2.1十六烷基三乙基澳化馁(CTAB)法

CTAB，在高盐的情况下与DNA结合形成结合物，该复合物可溶解、存在稳定;低盐溶液中，该复合物形成沉淀。接着加入有机溶剂将蛋白质和核酸进行分离，加入RNA酶去除RNA，用异丙醇沉淀DNA ，最后用适宜浓度的乙醇进行漂洗。目前，在根据传统CTAB方法的原理上，人们为了满足不同的实验需要，大多对传统的CTAB法在

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第一章 绪论

不同程度上进行了改良。李艺等[12] 利用CTAB法提取出玉米基因组DNA，通过电泳显示扩增目标条带分明,基本上可以满足SSR--PCR检测的需求。魏琦超等[13]阴利用改良CTAB法成功的提取小麦干种子总DNA，结果证实该法提取的DNA产率好、质量高，完全满足分子生物学下游实验的要求。李金路等[14]以10种植物为基础，在传统CTAB的方法上进行改良，结果表明改良后的方法得到的DNA纯度高，PCR的效果也比较好。

1.2.2十二烷基磺酸钠(SDS)法

十二烷基磺酸钠((SDS)，在高温的条件下,SDS可以高效破裂细胞膜，和多糖、蛋白质结合，过滤后就能除去这些杂质;接着为了除去RNA，加入RNA酶;再加入中性溶液提高盐浓度，使SDS一蛋白质复合物的溶解度变得更低，使沉淀更加完全，去沉淀，留上清；最后使用有机溶剂抽提DNA，无水乙醇沉淀和漂洗DNA。现在，因为应用传统的SDS法，过程繁琐，且DNA效率低，所以现在大多数实验室并不用传统的SDS方法进行提取。吴则东等[15]采用改良后的SDS法提取甜菜干中的DNA，再采用1%琼脂糖进行电泳，其结果为：SDS法提取的DNA纯度高，电泳后的条带比较清晰，能够满足下游分子生物学技术的要求。 1.2.3离心柱吸附提取DNA

DNA提取试剂盒快速，能够在两个小时内进行快速提取，其原理在高盐溶液中，是因为离心吸附柱能够和植物体内的脱氧核糖核酸特异性结合，加入漂洗液进行漂洗、溶解蛋白质、糖类等物质，离心，去除漂洗液；最后在低离子浓度下，用TE洗脱并保存植物组DNA。目前市场上有很多种针对不同植物材料的DNA提取试剂盒，针对这些试剂盒，鲜有相关报道分析、比较不同试剂盒的DNA提取效率、能否能够满足后续分子生物学实验的需求 。 1.2.4磁珠法提取DNA

磁珠法的提取原理和硅胶膜离心柱法有些相似，它是通过在提取过程中加入纳米级磁珠微珠，其表面含有一种能结合核酸的官能团。目前市场上常用的磁珠微珠分为两类，即硅磁、离心磁珠。其原理是在磁场的作用下，植物组细胞破碎，核酸和磁珠结合，分离出了多糖、蛋白质，然后用TE洗脱核酸，最后在磁场作用下回收磁珠，这种方法

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第一章 绪论

得到的DNA纯度高、得率高。R Caldarelli-Stefano等[16]采用离心磁珠法对石蜡组织中的DNA进行提取，与传统DNA提取方法相比，省时省力。但是磁珠法由于造价昂贵，在某些大型企业或者政府机构的实验室才有能力购买，在日常的检验分析中并不常见。 1.2.5全自动核酸提取工作站

DNA提取自动化工作站分为几个部分，通过将不同模块的功能整合在一起，实现核酸的大同量提取以及高度自动化。与其他方法相比，全自动核酸提取工作站有以下优势:①程序自动化;②操作程序化，功能比较强大;③能够有效地避免各种操作污染;④能在过程中进行实时监控，准确监测污染;⑤枪头定位系统比较准确，液体传输功能强大;⑥整合了各种仪器和试剂，试剂开放[17]。但是目前全自动核酸提取工作站由于价格昂贵及其适合大量提取的特点，在医学提取血液DNA较常见，在日常食品分析检测中并不常用。

1.3聚合酶链式反应(PCR)技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，其原理是模拟生物体内的DNA双链的复制，在一定的条件下进行体外DNA片段扩增的过程，因为人工合成的引物不同而具有特异性。生物的DNA是一个双螺旋结构，它有两条反向平行的多核苷酸链，这两条链有着同样的中心轴，双链上的碱基序列互补。PCR反应原理是半保留机制，主要反应步骤有变性、退火、复性等三个阶段。在体外扩增的过程当中，当体系温度升到一定温度时，DNA双链变性，解旋变为两条单链，接着随着体系温度的下降，反应引物与单链的某一端结合形成DNA单链复合物。在TaqDNA聚合酶的催化作用下，该复合物以DNA双链中的一条单链为模板，以dNTP(脱氧核苷三磷酸)为原料，连续的合成新的DNA单链，这就是PCR的过程。目前―PCR‖技术作为分子生物学中一种成熟的技术，在生物教材中频频出现。 1.3.1定性PCR技术优势

PCR扩增，也就是放大，它可将极少的目的基因迅速复制，可以达到原量的数十万倍甚至数千百万倍，不需要通过琐碎的流程，便可获得大量的精确DNA拷贝[18]。插入到转基因产品中的外源基因可分为三个部分：标记基因、调控基因和目的基因，调控基因又由启动子和终止子组成。

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第一章 绪论

PCR的基本反应体系可以概括为五要素:模板、一对寡核昔酸引物、耐热DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核糖核昔酸、反应缓冲液等。 1.3.2 PCR方法分类 1.3.2.1 普通PCR

普通PCR方法在过去几年里，是常用的转基因检测方法，早在2000年初始，就成为出入境检验检疫系统的常用方法。陈颖等[19]等选用了五种常见大豆制品，用试剂盒(Kit)法和CTAB法对其中的DNA进行了提取，分析不同方法的内源基因Lectin的扩增效果，结果证明了试剂盒提取的效率较好。王小花等[20]建立一种用于检测的转基因成分的普通PCR技术，该方法选用了大豆转基因标准品为材料，设计了针对内标记lectin、35S启动子和CP4-EPSPS的引物。 1.3.2.2 多重PCR

多重PCR(Multiplex PCR，MPCR)是在单一PCR的基础上，加入多个引物到一个反应中就能检测到多个目标基因的一种方法。王媛等[21]以大豆内源基因 Lectin、3 5S启动子、Nos终止子和筛选基因Epsps为检测对象，优化反应体系中各引物的量，并且筛选出PCR扩增过程中的最佳退火温度，提供了一种应用多重PCR检测大豆中转基因成分的方法。邵碧莹等[22]选用CTAB法提取不同大豆制品的总DNA，设计特异性引物进行二重PCR，最终检测到7个样品具有转基因的存在。陈贞等[23] 设计了6对引物检测棉花中的转基因成分，这些引物能扩增适合的基因片段，通过优化PCR扩增体系中不同引物终浓度和退火温度对多重PCR检测的影响，提供了一种应用6重PCR检测棉花中转基因成分的方法，结果表明:该6重PCR方法检测精度极高。 1.3.2.3 实时荧光定量PCR技术

随着转基因作物的大量种植，现在对转基因产品的检测要求越来越高，由于普通PCR只能对转基因成分进行定性分析，并且还需要进行凝胶电泳，不能满足日益发展的对转基因成分含量的测定，因此，根据实际检测的需要，经过一系列实验探讨，定量PCR检测技术应势而出。目前，常用的定量方法可以分为以下几类：竞争性定量PCR、内/外参照定量PCR和实时荧光定量PCR，在几种定量方法中荧光定量PCR是实验检测中最常用的一种方法，实时荧光定量PCR反应步骤简单，能够有效降低PCR实验过程当中的污染问题。

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第一章 绪论

1.3.2.3.1实时荧光定量PCR技术原理

实时荧光定量PCR，是在反应体系中加入荧光物质，通过荧光物质发出的信号进行实时监测，然后通过标准曲线的计算公式，计算出未知植物组DNA的初始浓度，完成了DNA的实时检测。实时荧光定量PCR分为两类：染料类和探针类，染料类是通过和双链DNA空间结构相结合，通过判断发光的特征来估算扩增的模板浓度;探针类的原理是探针能够特异性结合DNA序列，主要有Taqman探针、分子信标探针和杂交探针。当前Taqman探针的使用最为普遍。Taqman探针法是在普通PCR的一对引物外，增添一条两头带有荧光标识的特异的寡核昔酸探针，此探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭荧光基团，最常用的荧光基团有FAM和VIC两种，这些基团结合到5’端，发出的荧光可以被临近的3’端淬灭基团吸收。当探针没有被破坏时，淬灭基团将荧光基团发出的荧光吸收掉，因此荧光信号就不能被检测到。在PCR扩增的过程中，在Taq聚合酶的作用下，DNA单链伴随着模板的延伸而逐渐移动，当移到探针的连接位置，外切酶开始发挥活性，切断标记探针，这样荧光基团发出的信号就不能被淬灭，可以发出荧光信号。

1.3.2.3.2实时荧光定量PCR技术应用

实时荧光定量PCR技术具有普通PCR所没有的优点，目前在基因工程、临床医疗等领域已经被广泛应用[24]。在转基因研究领域，白卫滨等[25]研究了亚洲、欧洲、美洲等三大洲的转基因大豆粉标准品，并根据这些大豆的特性设计了一种引物和探针，成功的建立了一种检测豆粉中转基因成分的方法，灵敏度可以达到0.001%。Yoichiro等[26]提出了一种实时荧光PCR方法，该方法能定量检测农作物中的转基因成分，并证明该方法的重现性和重复性较好，为5.0%和15.9%；转基因玉米品系GA21, Event176和Roundup Readysoy检测限0.10 %。陈颖等[27]采用分子生物学相关技术 ，针对转基因玉米品系Event 176、Mon810以及玉米的内源基因Invertase的序列，设计了能特异性结合这些基因的引物探针 ，建立了一种定量检测转基因玉米品系Mon 810和Event 176的方法，该方法的检测灵敏度小于 0 .0 1%，其反应灵敏度远远高于国际上的要求 。朱文斯等[28]利用实时荧光PCR技术，定性检测了不同农作物的加工产品：玉米、棉花、

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第一章 绪论

大豆、马铃薯、水稻中的转基因成分，认为实时荧光PCR技术快速、灵敏、准确，是一种可以被采用的实用检测并且鉴定植物中转基因成分的方法。 1.3.2.4巢式PCR

巢式PCR (Nested PCR)属于变异的PCR，其原理是在反应体系中加入两对引物，同时进行PCR反应。第一轮扩增在外阴物的引导下进行PCR反应，结束后，其PCR产物将作为第二轮扩增的模板，在另一对引物的存在下进行第二轮的扩增。而半巢式PCR (Semi-nested PCR) 是在巢式PCR的基础上发展起来的，它是利用一对半引物同时进行PCR的反应。深加工产品破坏了植物细胞内的DNA分子，半巢式PCR可以解决被破坏样品难以检测含有转基因成分的问题。闻伟刚等[29]依据转基因大米的Cry1A(b) / Cry1A(c)基因和大米内源基因SPS，总共设计了6对半巢式PCR引物，扩增结果显示，半巢式PCR的检测灵敏度远远大于普通PCR。盛蕾等[30]设计了以CAMV35S启动子、GOX、BARSTAR和BARNASE4的外源基因为检测对象的特异性半巢式PCR引物，在反应中选取油菜籽磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)为内源参照基因，反应灵敏度可以达到0.001%。 1.3.2.5 其他PCR方法

此外，还有热不对称交结PCR、免疫层析法等一系列检测方法[31]。Yang等[32]设计了针对油菜Oxy-235插入片段的特异性引物和探针，采用热不对称交结PCR法进行了扩增，可以定性和定量检测Oxy．235菜籽。张隽等[33]依据玉米品系MON89034中外源基因的插入位置设计不同的引物，并在其中选取出最佳反应引物，优化了反应体系和反应条件，成功的建立了一种特异性检测MON89034转化体的LAMP方法，该方法可以特异性检测出MON89034玉米,其检测限为1 pg。鲍蕾等[34]建立了一种免疫层析法，这种方法可以迅速的检测出植物油中的玉米赤霉烯酮的含量，该反应的灵敏度为10μg/kg。Shiro Fukuta等[35]根据大豆中的外源基因CaMV35S启动子设计了6种引物并进行环介导等温扩增，其检测限为0.5％。

1.4生物芯片技术

近年来即使分子生物检测学技术的发展迅速，但是由于基因序列插入的不确定性，检测不同的的DNA序列难度逐渐加大，应用传统实验方法费时费力，已无法完全的地获得和了解越来越多的碱基对信息，人们需要一种新的技术手段来研究众多基因的多态性变化，从而认识它们的功能，了解它们的相互作用和调控关系。在这样的情况下, 上

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第一章 绪论

个世纪80年代，随着人类对分子生物学方面的不断探索，微流体芯片( gene chip)技术就产生了，在分子生物学研究中，它整合了样品处理、检测和分析过程，这不仅省去了大量的重复操作的费用和时间，也可以用很少的被检样品能得到其包含的很多生物信息，这是传统的其它检测方法(如核酸杂交、抗原抗体免疫反应等)不可比拟的。生物芯片根据碱基对之间相互结合的原理，应用了缩微技术，将分子生物学检测中不连续的分析过程变成连续，将反应物质结合在芯片载体的表面，以实现对生物体内的组分的测定能够快速、准确，更主要的是生物芯片的检测过程是平行的，因此，所得结果可能更加接近生物体内的实际情况。同时也增强了各种信息间的可比性。按照芯片上检测成分的不同，生物芯片被划分成基因芯片、细胞芯片、组织芯片和蛋白质芯片[36]。 1.4.1基因芯片技术

21世纪以来,生物学相关学科发展迅速，越来越多的生物基因组需要测定，基因芯片在这种情况下就应运而生。基因芯片技术应用十分广泛，在确认基因功能、诊断疾病分子水平、检测病原体、发现疾病易感基因等医学与生物学和筛选多靶位同步超高通量药物领域得到广泛应用[37]。基因芯片利用微细加工技术 ，将大量的特定序列的基因探针，按照某种规律固定于面积十分小的载体玻片上，这样就构成了一个二维DNA探针阵列，该阵列可以和待检物质按照碱基互补原则结合。 1.4.1.1 基因芯片技术原理

基因芯片技术是根据碱基互补的原理人为设计一小段基因片段（也就是特异性的探针），在该片段上连接一些可检测的物质，这种物质能与待检样品中的某种特定序列结合。通过平面微细加工技术以及超分子自组装技术把大量的基因探针集成在一个2c㎡的硅片上，从而实现对待检植物组DNA的大规模检测。

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第一章 绪论

基因芯片的测序原理图

1.4.1.2基因芯片技术分类

按照芯片的功能不同可以将芯片分成两种：测序芯片和表达芯片[38]。基因表达芯片可以将数以万计的基因检测探针固定在一块DNA基质膜上，对来源于不同的个体、不同发展周期的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，它能够进行综合不同阶段的分析和判断，加快这些病理基因的确定[39]。

另外基因芯片根据探针的类型不同也可分为两类：cDNA微阵列和寡核苷酸芯片；根据应用范围的不同而分为专用芯片、P53基因检测芯片、病毒检测芯片等[40]。

1.4.1.3基因芯片技术的发展现状

目前，基因芯片技术发展迅速。在20世纪末期，转基因番茄—作为世界上第一个转基因植物产品在进人市场后，转基因农作物以一种迅速的发展模式席卷全球。20世纪末期美国投入了将近20亿美元科研经费用于研究基因芯片这项技术。紧接着，世界各国看到了基因芯片技术的巨大发展前景，也纷纷开始研究基因芯片，将基因芯片列为主要发展的产业正在全球崛起，目前生物芯片的产值十分可观，近几年达到了10亿美元左右，据估计生物芯片的工业产值在五年后将达到200亿美元 [41]。基因芯片技术把百万甚至千万个与生命相关的基因片段通过微加工工艺固定在面积极小的芯片上，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，它的出现将给众多的科学领域带来巨大的变革。

1.4.1.4基因芯片技术的应用 1.4.1.4.1在食品微生物检测中的应用

基因芯片技术在检测微生物方面应用十分强大[42]，它能够一次性的检测出全部存在的病原微生物，并且能够检测特定致病菌株的所有遗传学指标。与传统的检测手段，比如说生化实验、血清实验等相比，基因芯片在微生物领域具有以下优势:①高通量且并行检测②操作时间短，方法简洁，整个过程大概需要4h，大大缩减了检测时间③与传统方

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第一章 绪论

法相比，灵敏度提高[43]。Volokh等[44]应用基因芯片鉴定了6种李斯特菌;Call等[45]通过研究E.coli 0157:H7的志贺样毒素I . II及溶rfn.素A，证实了基因芯片技术在检测这种大肠杆菌分离物方面十分准确; 陈昱等[46]提供了一种基因芯片和多重PCR技术相结合的检测方法，该方法在检验沙门氏菌、志贺氏菌、肠致病性大肠杆菌O157方面十分准确、快速，且灵敏度比较高。 Keraamas等[47]利用基因芯片检测并鉴定了2种十分相近的大肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌（两种菌均来自鸡粪便中），对今后禽流感病毒的防备和治愈方面大为有益。

1.4.1.4.2在转基因食品检测中的应用

因为短期内关于转基因食品是否安全并没有一个明确的结论，并且消费者有权知道

所购食品是否具有转基因成分，各个国家大体上都采取了转基因食品的―说明标签‖制。但是，某些不法商家为了谋取利益，经常违背这项规定。对于这样的情况，政府和企业的各检测部门都十分需要一种能够精确检测食品中转基因成分的手段。但从目前的PCR扩增法，无论是单重还是多重PCR检测只能对其中几种转基因成分进行检测，耗费时间长、效率低，当食品中有大量转基因成分时，不能进行快速检测。而基因芯片将大量的探针固定于其表面，单做1个实验就可以筛选出大量的不同转基因成分，因而基因芯片技术被认为是在检测转基因成分中最具潜力的手段之一。Rudi等[48]制作了一种及基因芯片用来检验玉米中转基因的含量，结果表明在7份待检产品中，主要包含了Bt176. Bt11. Mon 810. T25. GA21. CBH351和DBT418等七种转基因品系，其中1份样品检出含有玉米品系基因GA21。与常规的转基因检测方法相比，其检测限为0.10%-2.0%，因而此系统被认为可适用于将来基因修饰生物genetically modified organisms检测的需要。成小薇等[53]通过PCR对样品核酸进行扩增，将扩增产物与固定于可视芯片的特异性探针进行杂交分析，优化了芯片杂交的温度和时间，结果证明了芯片的特异性和重复性都较好，该芯片可以同时检测大豆、水稻、小麦、玉米、油菜等不同植物的转基因成分，且反应的灵敏度可达0.1％。张广远等[49]根据定性PCR的扩增靶序列设计40bp大小的基因芯片探针，建立了上述MIR162、MON88017、MON89788、18S rRNA和MON88017、MS1、RF1、18S rRNA等7种转基因品系基因芯片检测方法，结果证实了该方法的反应灵敏度较高(0.01%)。

1.4.1.5 基因芯片存在问题与展望

基因芯片技术的应用前景十分光明，但在实际检测中，仍有各种问题函待解决，

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第一章 绪论

包括:①基因芯片技术在设计探针时，需要知道很多的己知道碱基序列的DNA或cDNA片段的序列，而目前来看，由于基因片段插入的不确定性，很难检测出未知的核苷酸片段;②芯片制作的工艺比较复杂，需要高精度的制备和专门的仪器设备来检测信号源，制取费用很高，一般实验室不能承受该费用;③由于芯片的质量控制标准也没有统一的标准，造成芯片的制备也十分复杂。技术本身也存在一些问题，大致可概括为(1基因探针与靶DNA之间的的杂交出现问题：未配或错配;(2)靶DNA会形成复杂的空间结构;(3)计算机对靶DNA的重复序列识别模糊;（5)由于芯片技术的高科技型，在共享数据和资料库等方面还不够完善，基因芯片的种类和数目还比较少。在食品检测中以上这些原因都在不同程度上影响了基因芯片技术的发展。

1.5 本实验研究的主要目的和意义

本论文对不同加工程度的玉米基因组DNA的提取纯度进行了分析，然后针对四种不同加工程度的转基因玉米（未加工产品、粗加工产品、精加工产品以及深加工产品），建立了PCR和基因芯片两种检测方法，为一合理选择快速、简便、高效的基因组DNA提取、浓度测定以及转基因品系检测方法提供参考。主要研究内容包括以下几个方面: (1)以四种转基因玉米种子为材料，比较2种常用的植物基因组DNA提取试剂盒，通过紫外分光光度检测，对提取得到的基因组DNA的纯度及两种试剂盒的提取时间进行分析。

(2)比较ABI公司的两台实时荧光PCR仪（ABI 7500和ABI viia 7）进行分析，结合两种不同试剂盒提取的DNA进行实时荧光PCR反应，分析四种不同加工程度玉米品系的检测情况。

(3) 利用基因芯片技术对四种不同加工程度的玉米产品进行扩增，分析比较和实时荧光PCR反应对玉米品系的检出率。

(4)根据实时荧光PCR及基因芯片技术原理以及检出情况，提出一套完整、检出率更高的、更有效地检测玉米中转基因品系的方法，并对玉米中个别品系进行特异性分析。 (5)特异性产品：干酵母中转基因成分的检测以及按照优化的DNA提取试剂盒进行DNA提取，以及用实时荧光PCR技术和基因芯片技术进行品系鉴定。

(6) 薯格中转基因成分和品系检测。

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第一章 绪论

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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

为了确保植物组DNA的后续检测中实时荧光PCR和基因芯片反应能够进行，我们需要大致的了解DNA的纯度。本研究以玉米标准品为基准，玉米种子为材料，采用2种常用的植物基因组DNA提取试剂盒提取四种转基因玉米产品（深加工玉米产品：玉米酒槽粕，轻度深加工产品：粉碎玉米粉，粗加工产品：粉碎玉米粒；未加工玉米：玉米颗粒）基因组DNA，对比不同方法提取的基因组DNA纯度及提取时间;各基因组DNA经ABI公司的荧光PCR7500和VIIA扩增，通过各样品的扩增曲线以及Ct值分析各样品的品系筛选情况；

2.1 实验材料

样品为送入辽宁省出入境检验检疫局的四种转基因玉米：玉米酒槽粕4504、粉碎玉米粉6979、粉碎玉米粒7167、玉米粒6743；待检薯格1864。

2.2 实验仪器与试剂

2.2.1 实验仪器

表2.1 主要使用仪器

Tab 2.1 The main use of the instrument

型号 名称 2-16P 台式高速离心机

legend micro 172

漩涡振荡器

721

紫外分光光度计

7500

实时荧光PCR仪

VIIA 7

荧光定量PCR仪

TZL-1004

八连管搅拌套

DHZ-3

恒温水浴箱

12

生产厂家 德国Sigma 德国IKA

上海亚津电子衡器有限公司 美国ABI公司 美国ABI公司

苏州珀西瓦尔设备有限公司 上海精宏实验设备有限公司

第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

2.2.2 实验试剂与耗材

表2.2实验室试剂与耗材

Table 2.2 laboratory reagents and consumables

型号

名称 200次 Ex TaqDNA聚合酶

200次

ROX Reference Dye Ⅱ

1ml

离心管

2ml

离心管

0.2 ml

八连管

10μl、100μl、1000μl

微量移液器

型号

名称

200次

Ex TaqDNA聚合酶 生产厂家 TAKARA公司 TAKARA公司 QIAGEN 公司 QIAGEN 公司 ABI公司 德国普兰德 生产厂家 TAKARA公司

外源基因：启动子CaMV35S、Ubi，终止子NOS，筛选基因NPTⅡ（新霉素磷酸转移酶），PAT(修饰的草丁磷乙酰转移酶)，ZEIN（玉米内源基因），玉米品系基因MON810、Bt11、T25、CBH351、GA21、MON863、NK603、TCl507、59122、MIR604、MIRl62、DP98140、3272、TCl507以及转基因植物阳性样品为本实验室保存。

2.3 两种试剂盒的提取方法以及效率比较

2.3.1 提取方法

2.3.1.1 离心柱法（TIANGEN）

1.处理材料：取50mg研磨粉碎的原料放入2ml离心管中，向其中加入320μl缓冲液GA，加入20μl蛋白酶K和340μl缓冲液GB，充分混匀，震荡，65℃孵育30min。 2.12000r/min离心2min，取440μl上清至新管中。 3向上清中加入220μl无水乙醇，充分混匀6-8次。

4.将上一步所得的溶液和絮状沉淀全部加入一个吸附柱CB3中，12000r/min，离心2min,倒掉废液。

5向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

6 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000r/min 离心30sec，倒掉废液，将吸附

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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

柱CB3放入收集管中。

7 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000/min 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8 将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min，离心2min，倒掉废液将吸附柱CB3开盖置于室温放置数分钟，以彻底晒干其中的吸附液。

9 将吸附柱CB3 放回一个干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空滴加60μl洗脱缓冲液TE,室温放置5min，12000rpm离心2min。 2.3.1.2 离心柱法（TAKARA）

1.取50ng 研磨后的样品加入到tube管中，加入500μl的Buffer HS Ⅱ和10μl RNase，于56℃水浴孵育10min。

2 加入62.5μl的Buffer KAC，充分混匀，冰上放置5min，12000rpm 离心5min，取上清，加入与其等体积的GB，充分混匀。

3 将吸附柱安置于收集管中，溶液移于吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。 4 将500μl Buffer WB加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液 5 将700μl Buffer WB加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液 6将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min，离心2min

7将吸附柱CB3 放回一个干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空滴加40μl 洗脱缓冲液TE,室温放置5min，12000rpm离心2min洗脱DNA。 2.3.2玉米样品DNA浓度的测定

用Evolution-3000紫外可见分光光度计，测定玉米样品A260、A280，并平行测量三次，取计算出样品的DNA平均浓度值。

2.4 实时荧光PCR反应

本研究以四种转基因玉米为材料，针对现有的十七种玉米品系，利用ABI公司的实时荧光PCR仪7500和VIIA两种仪器进行PCR扩增，比较其特异性及灵敏度实验，从而建立一套系统、完整的转基因玉米品系的PCR检测方法。相关转基因玉米品系的引物探针序列见表3.1，序列来自参考文献[51]。

表2.3实时荧光PCR检测转基因玉米品系的探针和引物序列

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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

Table 2.3 probe and primer sequences are real-time PCR detection of transgenic maize lines

品系引物和探针引物序列 TC1507

NK603 MON810

MON89034

59122

GA21 MIR604

Btll

3272

Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R

Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F

Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R Primer-R

Probe Primer一F Primer-R

5’-FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCCG-TAMRA-3' 5’-TAGTCTTCGGCCAGAATGG-3' 5’-CTTTGCCAAGATCAAGCG-3'

5’-FAM-CCGCGTTAACAAGCTTACTCGAGGTCATTC-TAMRA-3' 5’-CGGCCAGCAAGCCTTGTA-3' 5’-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'

5’-FAM-ACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCA-TAMRA-3' 5’-CCTTCATAACCTTCGCCCG-3' 5’-AATAAAGTGACAGATAGCTGGGCA-3' 5’-FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB-3' 5’-TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT-3' 5’-CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA-3'

5'-FAM-TTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAA-TAMRA-3' 5’-GGGATAAGCAAGTAAAAGCGCTC-3' 5’-CCTTAATTCTCCGCTCATGATCAG-3'

5’一FAM一CATATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGG-TAMRA-3'

5’一FAM一CTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA一3'

5’一TGGCTCGCGATCCTCCT一3'

5’一FAM一AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG一TAMRA一3' 5’一GCGCACGCAATTCAACAG一3'

5’一GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT一3'

5’一FAM一TATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGA一TAMRA一3'

5’一GCGGAACCCCTATAAAGTTTA一3'

5’一FAM一ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG一TAMRA一3'

5’一TCATCAGACCAGATTCTCTTTTTTATGG一3'

5’一CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA一3'

5’一FAM一AGACTCC'1'1'1'1'CGGGAGCGATTCATC一TAMRA一3'

5’一GCGCGGTGTCATCTATGTTA一3'

5’一ACAACGGGGAGTTGTATGCT一3'

5’一CAAGAAATGGTCTCCACCAAA一3'

5’一FAM一TCTCGGTGACGGGCAGGACC一TAMRA一3'

5’一GACTTCAGCCTGCCGGTACT一3'

5’一GTGCATCAATGGAGGAGAGAAC一3' CBH351

BT176

续表

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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

5’一FAM一CAATGGCGGAACGACTCAAT一TAMRA一3'

5’一GCTACGACATGATACTCCTTCCA一3'

5’一AATTGCCCTTTGGTCTTCTGAGA一3'

5’一FAM一TCACTATGCTCTGCTCTATAGGGAGACCGAATT一TAMRA一3'

5’一GAAATAAATTGTTCTGATTTTGAGTGCAA一3'

5’一ATATGATACAACCATATCTAAATGGAACTTT一3'

5’一FAM一ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG一TAMRA一3'

5’一TCATCAGACCAGATTCTCTTTTTTATGG一3'

5’一CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA一3'

5’一FAM一AGACTCC'1'1'1'1'CGGGAGCGATTCATC一TAMRA一3'

5’一GCGCGGTGTCATCTATGTTA一3'

5’一ACAACGGGGAGTTGTATGCT一3'

T25 MON863

3272

Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R

CBH351

所选用方法在依据我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》，研究了一种新的实验室方法，并通过了认证。

反应体系为：Premix Ex taq（2x） 12.5 ul，Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 ul，上游引物、下游引物各1ul，ddH2O水8ul，模板2 ul，反应体系共25ul。并设计PCR反应试剂空白对照（以水代替DNA）、阴性对照和阳性对照。

实时荧光PCR反应在ABI Prime 7500 定量PCR检测仪上进行，反应参数为95℃预变性1min；95℃变性34sec，60℃退火15sec，40个循环。

2.5结果与讨论

2.5.1不同加工程度玉米DNA浓度测定结果

在提取时间上上来看，使用天根植物组DNA提取试剂盒提取DNA时，大约需要1h30min;使用宝生物植物DNA提取试剂盒提取DNA时需1h；宝生物的试剂盒比较节省时间。使用紫外分光光度计测量基因组DNA在260nm和280nm处的紫外吸收值OD260和OD280，平行测量三次取平均值，计算出的四种不同产品的平均OD260/OD280值，并比较两种试剂盒的提取时间，见表2.4至2.7。

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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

表2.4 未加工玉米6743 DNA的纯度

Table 2.4 unprocessed maize 6743 DNA purity

提取方法 OD 1.77 离心柱法 1.78 （TIANGEN）

1.77 离心柱法

（TAKARA）

1.86 1.85 1.88

平均OD

1.77

1.87

通过表2.4，我们发现TAKARA植物基因组试剂盒提取的6743号玉米DNA的纯度要好TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒。

表2.5粗加工玉米碎颗粒7167

Table 2.5 roughing crushed corn granules 7167

提取方法 OD 1.79 离心柱法 1.78 （TIANGEN）

1.77 离心柱法

（TAKARA）

1.83 1.81 1.82

平均OD

1.78

1.82

通过表2.5，我们发现TAKARA植物基因组试剂盒提取的7167号玉米DNA的纯

度要好于TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒。

表2.6精加工玉米粉6979

Table 2.6 finishing cornmeal 6979

提取方法 OD 1.91 离心柱法 1.92 （TIANGEN）

1.93 离心柱法

（TAKARA）

1.89 1.87 1.88

平均OD

1.92

1.88

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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

图2.9 4504在viia 7上初筛基因的扩增曲线图 图2.10 4504在7500上初筛基因的扩增曲

Figure 2.9 4504 screening gene amplification Figure 2.10 4504 screening gene

plot on viia 7 amplification plot on 7500

基线上方：从①-⑧依次是 TC1507, NK603, MON810, MON89034，59122 ，MON88017，MIR604，BT11的扩增曲线。基线下方：各品系的阴性对照。

表2.11两种试剂盒提取的DNA在viia7和7500上的Ct值比较

Table 2.11 Both kits extracted DNA Ct values on viia 7 and 7500 Comparison Ct TIANGEN viia7 TIANGEN 7500 Tc1507 34.709 27.4487 NK603 33.780 28.7079 Mon810 MON89034 59122 MON88017 MIR604 BT11

32.507 33.319

34.449 36.967 未检出 未检出

32.7639 30.2115 31.9999 32.5996 30.377 36.9126

通过比较用天根试剂盒提取玉米酒槽粕4504的DNA在两台机器上的扩增曲线图和Ct值，结果显示玉米酒槽粕4504含有Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604 等转基因品系。两种实时荧光定量PCR仪全部扩增出Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017等品系，在实时荧光仪7500上的扩增Ct值明显低于实时荧光仪viia 7，且对于特异性品系MIR604 、BT11来说，实时荧光PCR仪viia 7并没有出现扩增，而实时荧光仪7500有扩增曲线，且有Ct值，总结实验结果，我们发现对于深加工产品玉米酒槽粕，宜采用天根实际盒在实时荧光仪7500上进行检测。

23

第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系

2.6 本章小结

经过对以上四种加工产品分析，结果表明对于未加工（玉米颗粒）和粗加工（粉碎玉米粒）的转基因玉米，TAKARA植物组DNA提取试剂盒提取的DNA纯度高于天根植物组DNA提取试剂盒；对于精加工的转基因玉米（玉米粉），两种试剂盒提取的DNA纯度都较高；但是对于深加工转基因玉米（比如玉米酒槽粕），很明显看出天根植物组试剂盒提取的DNA纯度要高于TAKARA植物组提取试剂盒。

接着选取上述玉米的DNA，并用两种实时荧光PCR仪对各DNA进行了品系筛选，结果表明：

对于未加工玉米产品，利用TAKARA植物提取试剂盒在实时荧光PCR仪viia 7上能取得较好的实验结果；

对于粗加工玉米产品，利用TAKARA植物提取试剂盒在实时荧光PCR仪viia 7上能取得较好的实验结果；

对于深加工产品玉米酒槽粕，宜采用天根实际盒在实时荧光仪7500上进行检测；精加工玉米产品宜用天根实际盒进行提取，实时荧光仪7500和viia 7都可进行实时荧光PCR反应；

24

第三章应用基因芯片筛选玉米转基因品系

第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系

基因芯片的出现为分子生物学基础研究提供了一个巨大的技术平台，基因芯片技术发展迅速，在其诞生以来就被广泛应用于各个方面，最早应用在肿瘤研究方面，随着基因工程技术的迅速发展，转基因食品越来越多地展现在人们面前，基因芯片在转基因食品的检测上应用也越来越广泛。由于转基因食品的不可预期性和出于对消费者对所购食品的知情权及选择权的维护，对转基因食品进行严格的―说明标签‖制基本是各个国家通行的办法。因此，这就要求政府或是企业的各检测部门都需要一种准确、高效的转基因食品检测手段。现有的PCR扩增法，无论是单重还是多重PCR检测只能对其中几种转基因成分进行检测，耗费时间长、效率低，不适于对食品中大量不同转基因成分的快速检测。而基因芯片具有快速、高效、高通量检测的优点，仅靠1个实验就能筛选出大量的不同转基因成分，被认为是最具潜力的检测手段之一。本次试验中使用的芯片为ABI公司所生产，包括MON810、Bt1l、Evebtl76、T14/T25、CBH351、GA21、 MIR604、MON88017、MON89034、NK603、TCl507、MON87460、3272、MON863、DAS．59122、DP98140等18个玉米标准体系以及玉米内源基因HMG、adh1和18s在内的真核生物基因。

3.1 基因芯片方法

基因芯片技术反应体系:染料 50 ul，模板30 ul，ddH2O水20ul，反应体系共100 ul。具体步骤如下：

（1）将50 ul染料，30 ul模板，20 ulddH2O充分混匀10sec以上，重复一次。 （2）取100 ul样液加入到芯片内，缓慢加入，避免气泡产生。 （3）芯片离心，1200r/min，1min，离心两次 （4）密封，切掉多余部分 （5）上机

反应参数为95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火1 min。

3.2利用基因芯片筛选玉米中转基因品系的结果

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第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系

3.2.1玉米颗粒6743的芯片结果

利用基因芯片对转基因玉米颗粒进行品系筛选，反应图谱见图3.1。

图 3.1未加工玉米粒应用基因芯片的图谱 Figure 3.1 corn chips using gene mapping

从1-3号依次是18S、HMG、adh1等内源基因的扩增曲线，①-⑩依次是TC1507, NK603, MON810, MON89034，59122 ，MON88017，MIR604，BT11，GA21，T25的扩增曲线。基线下方：未检出基因品系。

表3.1转基因玉米粒应用基因芯片法的Ct值

Table 3.1 transgenic corn gene chip method of Ct values

Ct Ct 筛选品系 筛选品系

Tc1507 28.556 59122 27.102

NK603 26.915 MON88017 28.386

Mon810 28.794 MIR604 31.454

MON89034 25.462 BT11 34.592

GA21 23.194 T25 34.132

应用基因芯片法检测玉米粉的外源品系基因，证实玉米颗粒6743检出Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604、GA21、T25等外源基因品系。

3.2.2粉碎玉米粒7167的芯片结果

利用基因芯片反应粉碎玉米粒进行品系筛选，反应图谱见图3.2。

26

第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系

图 3.2 粉碎玉米粒应用基因芯片的图谱

Figure 3.2 crushed corn chips using gene mapping

从1-3号依次是18S、HMG、adh1等内源基因的扩增曲线，①-⑨依次是TC1507, NK603, MON810, MON89034，59122 ，MON88017，MIR604，BT11，GA21的扩增曲线。基线下方：各品系的阴性对照。

表3.2 粉碎玉米粒应用基因芯片法的Ct值

Table 3.2 Ct value crushed corn gene chip method

筛选品系 Ct 筛选品系 Tc1507 NK603 Mon810 MON89034 MON87460

应用基因芯片法检测玉米粉的外源品系基因，证实玉米粉检出Tc1507、NK603、

28.356

29.770 29.388 29.224 34.707

59122 MON88017 MIR604 BT11

Ct

25.564 29.359 31.831 34.592

MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604、MON87460等外源基

因品系。

3.2.3 玉米粉6979的芯片结果

利用基因芯片反应对玉米粉进行品系筛选，反应图谱见图3.3。

图 3.3 玉米粉应用基因芯片的图谱

Figure 3.3 cornmeal application microarray profiles

从1-3号依次是18S、HMG、adh1等内源基因的扩增曲线，①-⑧依次是TC1507, NK603, MON810, MON89034，59122 ，MON88017，MIR604，BT11的扩增曲线。基线下方：各品系的阴性对照。

27

第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系

表3.3 玉米粉应用基因芯片法的Ct值

Table 3.3 Ct value of corn flour method of gene chips

筛选品系 Ct

Tc1507 29.982 NK603 Mon810 MON89034

35.221 30.557 29.224

筛选品系

59122 MON88017 MIR604 BT11

Ct

31.216 31.563 36.284 34.592

应用基因

芯片法检测玉米粉的外源品系基因，证实玉米粉6979检出Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11、MIR604等外源基因品系。 3.2.4 玉米酒槽粕4504的芯片结果

利用基因芯片反应对玉米酒槽粕进行品系筛选，反应图谱见图3.4。

图3.4玉米酒槽粕的应用芯片法的图谱

Figure 3.4 maps corn meal vinasse application chip law

从1-3号依次是18S、HMG、adh1等内源基因的扩增曲线，①-⑥依次是TC1507, NK603, MON810, MON89034，59122 ，MON88017的扩增曲线。基线下方：各品系的阴性对照。

表3.4玉米酒槽粕应用基因芯片法的Ct值

Table 3.4 Ct value of corn meal wine tank gene chip method

Ct 筛选品系 Ct 筛选品系

Tc1507 32.067 59122 30.752 30.996 MON88017 NK603 30.903 Mon810 MON89034 34.270 MIR604 30.2115 B T11

未检出 未检出

应用基因芯片法检测玉米酒槽粕的外源品系基因，证实玉米酒槽粕4504检出Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 等转基因品系。

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第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系

3.3 基因芯片法和实时荧光PCR反应检测结果对比

为了比较基因芯片法和实时荧光PCR仪的反应检出率，将二者所检出玉米外源基因品系汇成下表，见表3.5。

表3.5两种不同方法的比较

Table 3.5 Comparison of two different methods

品系

TC1507-TC1507_QT-EVE–ZM -010 NK603-NK603_QT-EVE–ZM- 008 MON87460-MON87460_QT- EVE-ZM-005

MON863-MON863_QT-EVE -ZM-009

MON810-MON810_QT-EVE -ZM-020

MIR162-MIR162_QT-EVE- ZM-022

4504 6979 芯片 PCR 芯片 PCR + +

7167 芯片 PCR 6743 芯片 PCR + + + +

+ + +

+ + +

+ + + +

+ + + +

+

+ + +

+ + +

+ + + +

+ +

LY038-LY038_QT-EVE-ZM-017

GA21-GA21_QT-EVE-ZM-007

Bt176-Bt176_QT-EVE-ZM-023

+

+

Bt11-v2-Bt11_QT-EVE-ZM-015 98140-98140_QT-EVE-ZM-021 59122-59122_QT-EVE-ZM-012 3272-3272_QT-EVE-ZM-019

MON89034-v2-MON89034_QT-EVE-ZM-018v3

MIR604_ori-MIR604_ZM -013_ori MON88017_ori-MON88017_ZM-016_ori

59122-59122_QT-EVE-ZM-012

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+ +

+

+ +

+

+

+ +

+

+ +

+ +

+

+

+ +

+

+ +

+

+

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第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系

根据图表所显示的内容，对于深加工产品，用实时荧光PCR方法检测共检出外源基因品系八个，包括Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11，MIR604，而用基因芯片检测时只检出六个品系，BT11，MIR604等并没有检出，说明尽管基因芯片技术一次检测出了大量外源基因，节省了时间、精力，但是对于深加工产品来说，其检测精度还是不如实时荧光PCR反应；对于加工程度比较轻的产品或是未加工产品，例如粉碎玉米粒和玉米颗粒，基因芯片法检出了Tc1507、NK603、MON810、MON89034、59122、MON88017 、BT11，MIR604、GA21、T25等外源基因，而实时荧光PCR反应并没有检出GA21、T25，说明对于加工程度比较轻的产品或是未加工产品，用芯片法的检测结果比较好。

3.4 本章小结

1、对于加工程度比较轻的产品或是未加工产品，基因芯片法的检出率比较高，宜采用基因芯片进行检测。

2、精加工玉米产品可采用天根试剂盒进行提取后，实时荧光仪7500和viia 7都可进行实时荧光PCR反应，或直接用基因芯片法进行检测；

3、对于深加工产品玉米酒槽粕，宜采用天根试剂盒在实时荧光仪7500上进行检测，其检出率更高；

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第四章 薯格、干酵母转基因成分的检测及品系测定

第四章 薯格、干酵母转基因成分的检测以及品系鉴定

第二、三章对四种不同加工程度玉米中转基因成分进行了测定，在这章节里选取了两种具有代表性的样品进行了转基因检测，进口薯格1864，进口干酵母5590，均为在辽宁出入境检验检疫局待检的样品。

4.1进口薯格中转基因成分的检测

近年来随着快餐文化的发展，薯格、薯条等一系列高温油炸食物越来越受到人们的

青睐，如何快速准确地检测其是否含有转基因成分也成为一个热点。在这里我们选择天根植物试剂盒进行DNA的快速提取，用ABI Prime 7500 实时荧光PCR仪进行薯格中转基因成分的初筛和品系的检测。 4.1.1实验方法

取薯格的外裹粉部分进行提取，DNA提取方法同上。

对样品进行CAMV35S、Ubi、NOS、NPTⅡ、PAT、ZEIN等外源基因的初步筛选，荧光PCR方法同上。 4.1.2结果与讨论

4.1.2.1 薯格中转基因成分的初筛

初步筛选基因为: (1)外源基因: 启动子CaMV35S、Ubi, 终止子NOS, 筛选基因NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶), PAT(修饰的草丁磷乙酰转移酶)。(2)ZEIN(玉米内源基因), 初筛结果见表2.13。

表4.1薯格样品初筛结果

Table 4.1 The screening results of potato chips

初筛基因结果初筛基因结果

CaMV35S Ubi NOS

+ + +

NPTⅡ PAT ZEIN

+ + +

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第四章 薯格、干酵母转基因成分的检测及品系测定

样品初筛基因的扩增曲线如图4.1所示, ZEIN、 Ubi、35S、NOS、NPTⅡ、PAT等初筛基因均有良好的扩增。且结合待检样品的的Ct值, Zein(Ct:28.688)、Ubi (Ct:31.695)、 35S(Ct:32.551)、NOS(Ct:33.297)、 NPTⅡ(Ct:34.937)、PAT(Ct:34.878), 根据外源基因的判定结果, 证明待检样品中检出这些外源基因。

图4.1薯格样品中初筛基因的扩增曲线图

Fig.4.1Screening gene amplification plot of potato chips

基线上方: 从1~6依次是ZEIN, 35S, NOS, NPTⅡ, Ubi, PAT等阳性对照基因的扩增曲线图; ①~⑥为待检样品中zein, 35S, NOS, NPTⅡ, Ubi, PAT等基因的扩增曲线图; 基线下方: 基线下方为ZEIN, Ubi, 35S, NOS, NPTⅡ, PAT的阴性对照以及空白对照的扩增曲线图

4.1.2.2薯格中转基因品系检测结果

初筛结果表明，薯格样品的外裹玉米粉中含有转基因成分。利用实时荧光PCR方法进行品系鉴定，在对待检样品进行了18种玉米品系3272、DAS．59122、Bt10、LY038、MIR604、MON863、MON88017、MON89034、NK603、TCl507、 MON810、 MIR162、GA21、Bt176、MON87460、Bt11、T25、DP98140的筛选后，结果表明玉米粉共含有5种转基因品系，即转基因玉米TC1507、NK603、MON810、MON89034、59122等，鉴定结果见表4.2。待检样品中玉米粉中的各品系扩增曲线图见图4.2，TC1507、NK603、MON810、MON89034、59122等5个品系均有很好的扩增，且TC1507 (Ct:28.153)、NK603(Ct:30.335，MON810(Ct:31.292)，MON89034 (Ct: 31.566)，59122(Ct:34.710)证明薯格的外裹粉部分含有玉米品系TC1507、NK603、MON810、MON89034、59122等。

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