硕士论文--PNPLA3基因与非酒精性脂肪肝的相关性及其机制研究

谨以此论文献给一直关心支持我的老师、亲人

和朋友们！

-------- 辛永宁

PNPLA3基因与非酒精性脂肪肝的相关性

及其机制研究

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PNPLA3基因与非酒精性脂肪肝的相关性及其机制研究

摘要

遗传因素在非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）的形成中起重要作用。国外新近发现 PNPLA3 基因rs738409 [C/G]多态性（编码I148M）与 NAFLD 显著相关，但其是否能独立导致 NAFLD，以及影响肝脏脂肪代谢的作用机理不明。本研究通过“个体-细胞-分子”三个层面，研究了PNPLA3 I148M多态性位点的作用机制，希望在临床水平验证PNPLA3 基因I148M 多态性与中国汉族人群NAFLD的相关性，揭示此多态性对细胞代谢水平的影响机制，阐明其对酶活性影响的分子机制。

首先，本文研究了青岛地区汉族人群中PNPLA3 基因I148M多态性与NAFLD及慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）的遗传易感性的相关性。采用多聚酶链反应（PCR）对315例NAFLD 患者及336例健康对照和185例CHB 患者及164例健康对照的血液样本进行基因型检测及分析。结果显示：rs738409 G等位基因频率分布在NAFLD（65.40%）与正常对照组（33.18%）、NASH组（71.87%）与SS组（56.47%）、CHB组（31.9%）与对照组（21.9%）中分别比较差异均有统计学意义（P﹤0.05）。非条件Logistic回归模型分析，G等位基因与C等位基因相比较，前者发生NAFLD的比值比（OR）为 3.81（95%CI：3.03~4.79，P﹤0.05），发生NASH的OR为 1.97（95%CI=1.41~2.75，P＜0.05 )，发生CHB的OR为 1.67（95%CI=1.18—2.34 , P =0.003）。调整性别、年龄后，发生CHB的OR为1.63（ 95%CI=1.17—2.68 , P= 0.04）。PNPLA3基因rs738409 [C/G]多态性与血清ALT、γ-GT水平有关（P﹤0.05），对NASH组分层分析，GG基因型BMI、ALT、FINS均高于CC基因型（P﹤0.05），血清HDL 水平低于CC基因型和GC基因型（P﹤0.05）。研究结果提示我们，在中国汉族人群中， PNPLA3 基因I148M 多态性与NAFLD及CHB的遗传易感性相关，是决定NAFLD及CHB个体遗传易感性的重要因素。

其次，本文探讨了PNPLA3基因I148M多态性在体外培养肝细胞中的作用机制。通过对经典的两步灌流法进行简化与改进，我们建立了一种能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法，改进后的分离方法得到了足够数量的肝细胞；台盘蓝染色示细胞活率大于90%；细胞形态与活力可稳定保持1周。我们

成功构建携带PNPLA3基因野生型和I148M突变型完整编码序列的慢病毒载体，两种慢病毒各自感染肝癌细胞系Huh-7和小鼠原代肝细胞，Western blot证实PNPLA3蛋白野生型和突变型成功过表达。油红O染色及生化分析表明：与空病毒组相比，过表达PNPLA3基因的细胞内甘油三酯、总胆固醇、脂蛋白含量明显升高，转氨酶水平也明显升高，过表达PNPLA3基因I148M突变型的细胞内以上指标升高更明显。经过不同时间、不同剂量的辛伐他汀处理后，表达不同基因型的Huh-7细胞内的甘油三酯水平均有不同程度的降低，且其降低呈现出时间和剂量依赖性，与空病毒和PNPLA3野生型组相比，过表达PNPLA3I148M 突变型的细胞内甘油三酯水平降低程度更明显。研究结果提示我们，PNPLA3基因I148M可独立引起体外培养肝细胞脂肪变性，此基因型对辛伐他汀的降脂作用更敏感，在未来的工作中，我们可以根据患者的基因型选择不同的治疗方案，为非酒精性脂肪性肝病的个体化治疗提供了理论指导。

再次，利用转基因技术构建的特定基因在组织中特异表达的小鼠模型，已经成为当今后基因组时代研究基因功能的利器，而制备转基因小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射，这需要我们首先构建PNPLA3I148M肝脏特异表达质粒。我们利用PCR技术成功得到了PNPLA3基因I148M多态性和肝脏特异性启动子ALB的完整编码序列，并将ALB与PNPLA3 I148M成功连接，PCR产物转化GeneHogs化学感受态细菌进行质粒扩增，酶切及测序验证显示成功得到ALB- PNPLA3 I148M质粒，将目的质粒转染肝癌细胞系SMMC-7721，western blot 结果显示，ALB- PNPLA3 I148M在肝癌细胞SMMC-7721中成功过表达。PNPLA3I148M肝脏特异表达质粒构建的成功，为将来转基因小鼠的制备奠定了基础。

最后，为了深入了解其突变对酶活性的影响，我们利用分子动力学模拟和柔性对接进行了深入研究。数据表明突变组允许底物进入催化中心的通道明显减小，从而限制了软脂酸进入催化二联体。另外，酶与底物的结合能也表明了突变组对底物的低亲和力。另外，分子动力学模拟的的动态过程显示软脂酸在野生组和突变组的结合方式有显著不同。由于I148M突变发生位置在闭袢处导致底物识别特异性消失。该研究为I148M影响酶活性的机制提供了有力的证据，并且对酶的催化腔进行干扰可能成为治疗NAFLD的一个潜在途径。

关键词：非酒精性脂肪性肝病；PNPLA3；单核苷酸多态性；分子动力学模拟

The association and mechanism of patatin-like phospholipase domain-containing 3 gene and nonalcoholic fatty liver disease

Abstract

Hereditary factors play an important role in the development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). A single nucleotide polymorphism (SNP) in the PNPLA3 gene (rs738409, representing a substitution from cytosine to guanine, resulting in a switch from isoleucine to methionine at 148 residue, I148M) was reported to be significantly associated with NAFLD. It is unknown if the variant can induce NAFLD independently, it is also unclear by which mechanism the variant affecting the lipid metabolism of liver. In this study, we researched the physiological functions of PNPLA3 I148M variant at the individual, cellular and molecular levels. We hope to verify the correlation between this variant and NAFLD in Chinese Han population, to reveal the mechanism by which this variant affecting hepatocytes' metabolism, and to elucidate the molecular mechanism by which this variant affecting the activity of the enzyme.

Firstly, we explored the relationship between PNPLA3 I148M variant and hereditariness to NAFLD and chronic hepatitis B (CHB) in Chinese Han population of Qingdao. The study included 315 NAFLD patients with 336 healthy controls and 185 CHB patients with 164 healthy controls. Genotypes of blood samples were examined by polymerase chain reaction (PCR) and genotyping method. Allele frequency distribution of rs738409 G were 65.40%, 71.87% and 56.47% in patients with NAFLD, NASH and SS and 33.18% in control , 31.9% in CHB patients and 21.9% in control group（P﹤0.05）, respectively, which had statistical signification(P﹤0.05). Non-conditional Logistic regression showed that, comparing with CC gene carriers, odds ratio of occurrence of NAFLD was 3.81(95% CI: 3.03 to 4.79, P <0.05), and the odds ratio of occurrence of NASH OR was 1.97 (95% CI = 1.41 ~ 2.75, P <0.05) in GG gene carriers. A case-control analysis revealed a 1.67-fold (95%CI =1.18—2.34, P =0.003) excess risk of developing CHB for rs738409 G allele compared with C allele. Unconditional logistic regression model adjusted for age, sex, OR is1.63-fold

(95%CI=1.17—2.68 P =0.04). PNPLA3 I148M variant was associated with the level of serum ALT、γ-GT. Through stratified analysis of NASH group, the BMI, ALT, and FINS of GG genotype were all higher than that of the CC genotype (P <0.05), while the serum HDL level of GG genotype was lower than that of both CC genotype and GC genotype (P <0.05). The results suggested that, PNPLA3 I148M variant was associated with NAFLD and CHB hereditary susceptibilities; the variant was a significant factor which could determine NAFLD and CHB hereditary susceptibilities in Chinese Han population.

Secondly, we explored the mechanism of PNPLA3 I148M variant in the cultured hepatocytes. We have improved the classic two-step perfusion technique and constructed a simple method to isolate and culture primary mouse hepatocytes with high purity and high viability. Adequate hepatocytes were isolated by this method; the motility rate of the hepatocytes was higher than 90%, the viability of the primary hepatocyts lasted stably for 7 days. We constructed the recombinant lentiviruses containing PNPLA3 gene or PNPLA3 gene I148M variant successfully. Huh-7 cells were infected by the recombinant lentiviruses containing PNPLA3 or PNPLA3 I148M. Western blot showed that PNPLA3 protein was overexpressed in Huh-7 cells. PNPLA3 gene improved the level of triglyceride, total cholesterol, lipoproteins, as well as the aminotransferance in the cells; the I148M variant possessed a more enormous enhancing effect. Simvastatin depressed the triglyceride level in the cells, and the effect showed a time and dose dependent tendency, the cells expressing I148M variant were more sensitive to the simvastatin. The results suggested that, PNPLA3 gene I148M variant can induce the liver steatosis independently, and the I148M variant was more sensitive to the simvastatin. In the future work, we can make individual therapeutics to NAFLD according to the patients' genotypes.

Thirdly, transgenic mouse expressing definite gene in definite tissue has become a powerful tool to study gene function. DNA pronucleus microinjection is the mostly used technique to construct transgenic mouse, and this need us to construct liver specific expression plasmid of PNPLA3 I148M variant. We got the complete coding sequences of PNPLA3 I148M variant and the liver specific promoter ALB by PCR.

The PNPLA3 I148M and the ALB were connected by PCR. GeneHogs were transformed by the PCR products and the plasmids were harvested and then verified by electrophoresis and sequencing. SMMC-7721 cells were infected by the ALB- PNPLA3 I148M plasmids, western blot showed that ALB- PNPLA3 I148M was overexpressed in SMMC-7721 cells. The liver specific expression plasmid of PNPLA3 I148M will lay a foundation for the construction of transgenic mouse.

Lastly, to glean insights into the variant’s effect on enzymatic activity, we performed molecular dynamics simulation and flexible docking studies. Our data showed that the size of the substrate-access entry site was significantly reduced in mutants, which limited the access of palmitic acid to the catalytic dyad. Besides, the binding free energy calculations suggested low affinity for substrate to mutant enzyme. The substrate-bound system simulations revealed that the spatial arrangement of palmitic acid was distinct in wild-type from that in mutant. The substrate recognition specificity was lost due to the loop where the I148M mutation was located. Our results provided strong evidence for the mechanism by which I148M affected the enzyme activity and suggested that mediating the dynamics might offer a potential avenue for NAFLD. Key words：NAFLD；PNPLA3；SNP； molecular dynamics simulation

目 录

第一章文献综述 (1)

1 PNPLA3简介 (1)

1.1 patatin，PNPLA3家族的前身 (1)

1.2 PNPLA3的发现与功能鉴定 (2)

1.3 PNPLA3基因与NAFLD (6)

1.4新视野 (12)

1.5总结 (13)

2非酒精性脂肪肝动物实验模型研究进展 (13)

2.1基因改良型实验动物模型 (14)

2.2饮食诱发型实验动物模型 (17)

2.3混合型实验动物模型 (19)

2.4总结 (20)

第二章 PNPLA3I148M多态性与非酒精性脂肪性肝病及慢性乙肝遗传易感性的相关性研究 (21)

引言 (21)

第1节实验资料和方法 (22)

1.1受试者 (22)

1.2设备和仪器 (26)

1.3分子生物学相关试剂 (27)

1.4实验步骤 (27)

1.5统计学分析 (31)

1.6实验的路线图 (31)

第2节结果 (32)

2.1一般特征比较 (32)

2.2各项生化指标的比较 (33)

2.3 NAFLD及CHB与PNPLA3基因I148M多态性（rs738409[G]）的相关性35 第3节讨论 (40)

3.1全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study GWAS）与NAFLD

的发病机制 (40)

3.2 NAFLD与代谢综合征关系探讨 (42)

3.3 NAFLD及代谢综合征与PNPLA3基因多态性（rs738409[G]）的关系 (43)

3.4 CHB与PNPLA3基因多态性（rs738409[G]）的关系 (44)

3.5目前问题与未来展望 (45)

第4节结论 (46)

第三章 PNPLA3基因I148M多态性在体外培养肝细胞中的作用研究 (48)

引言 (48)

第1节实验资料 (49)

1.1质粒、菌株、细胞和主要试剂 (49)

1.2实验仪器与设备 (50)

1.3试剂的配制 (51)

第2节方法 (52)

2.1人肝癌细胞株Huh-7的培养 (52)

2.2小鼠原代肝细胞的分离与培养 (53)

2.3慢病毒载体构建 (54)

2.4慢病毒包装 (58)

2.5慢病毒感染Huh-7细胞 (59)

2.6慢病毒感染小鼠原代肝细胞 (59)

2.7 Western blot检测PNPLA3蛋白过表达 (59)

2.8油红O染色 (61)

2.9细胞内脂质代谢相关产物的检测 (61)

2.10过表达不同目的基因的细胞对降脂药辛伐他汀的敏感性检测 (62)

第3节结果 (62)

第4节讨论 (73)

第5节结论 (76)

第四章 PNPLA3 I148M肝脏特异表达质粒构建 (77)

引言 (77)

第1节实验资料 (78)

1.1耗材 (78)

1.2主要试剂及主要配方 (78)

1.3主要仪器设备 (78)

第2节实验方法 (79)

2.1引物设计 (79)

2.2构建PNPLA3 I148M质粒 (80)

2.3扩增肝脏特异表达启动子ALB (83)

2.4连接肝脏特异性启动子ALB和PNPLA3 I148M (84)

2.5PNPLA3 I148M质粒western blot过表达验证 (87)

第3节结果 (88)

3.1PNPLA3 I148M质粒的构建 (88)

3.2肝脏特异性表达启动子ALB的获取 (90)

3.3将ABL连接至PNPLA3 I148M上游 (91)

3.4 PNPLA3 I148M肝脏特异表达质粒表达验证 (93)

3.5载体线性化 (94)

第4节小结 (95)

第五章PNPLA3基因I148M单核苷酸多态性的分子动力学模拟揭示了受限的底物进入酶催化腔过程 (96)

引言 (96)

第1节材料和方法 (97)

1.1 PNPLA3基因的同源模建 (97)

1.2软脂酸模拟系统及参数生成 (97)

第2节分子动力学模拟 (98)

第3节柔性对接及酶与底物结合自由能的计算 (98)

第4节结果 (98)

4.1 PNPLA3的构像模型及通过分子动力学的精确模拟 (98)

4.2野生型及突变型酶系的动力学特性 (100)

4.3底物结合系统的动力学特性 (103)

第5节讨论 (106)

结论与创新 (107)

参考文献 (108)

缩略语 (132)

133 致谢··················································································································

个人简历 (134)

发表的学术论文 (134)

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第一章文献综述

1 PNPLA3简介

无论是在发达国家[1,2]还是在发展中国家[3]，非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）正在逐渐成为一个公共健康问题。在不久的将来，NAFLD将成为全球一个重要的致死性疾病。尽管NAFLD的发病率很高，但目前对其病理机制知之甚少。NAFLD的发病是遗传[4]、环境[5]、心理[6]等因素共同作用的结果。2008年，Romeo等首次利用全基因组关联分析探索NAFLD的易感基因。他们发现，脂肪滋养蛋白（patatin-like phospholipase domain-containing 3，PNPLA3）基因I148M多态性与肝脏脂肪含量升高密切相关[7]。此后，PNPLA3在NAFLD发病机制的研究中成为热点。

PNPLA3基因位于人类第22号染色体的长臂上，包含9个外显子，转录产物有2805个碱基，可翻译出一条包含481个氨基酸的跨膜多肽链。PNPLA3属于PNPLA家族，PNPLA家族是一类不同于传统的激素敏感性脂肪酶的新型脂肪酶，目前对其功能尚缺乏足够认识。PNPLA3蛋白N末端含有一个patatin结构域，使其在体内外都具有脂肪水解和合成功能。PNPLA3在脂肪和肝脏中高表达，这是两个脂肪合成和分解的主要器官。PNPLA3的表达受营养状态影响。因为参与了能量代谢，PNPLA3与葡萄糖和胰岛素相互调节。基因的多态性影响了PNPLA3的表型，从而影响了蛋白的功能，进而导致了能量代谢的紊乱，进而引起疾病。在此，我们对PNPLA3进行简要综述，期望总结前人的研究结果，以期为未来的工作提供有益的指导。

1.1 patatin，PNPLA3家族的前身

PNPLA3家族的每一位成员的N端都包含一个patatin结构域，决定了它们的酶学功能。1980年，Racusen等首次纯化了一种糖蛋白，这种糖蛋白占成熟土豆块茎中可溶性蛋白含量的40%[8]。基于土豆在古西班牙语中为“patata”，他

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们将这一种新蛋白命名为“patatin”。此后，“patatin”这一名称被广泛接受。

Patatin是土豆块茎可溶性蛋白中占优势含量的糖蛋白，它广泛地分布在从原核生物到真核生物的所有生命形式中[9]。起初，patatin只是被当做一种储备蛋白，后续的研究发现，它也具有酶活性[10,11]，并且参与了植物信号传导[12]，还具有体外抗氧化作用[13]。在植物中，patatin的酶学功能参与了对昆虫和病原微生物的防御[14,15]。

早在1970年，Galliard等部分纯化了一种同时具有酰基水解和酰基转移活性的酶[11,16]。这种酶可以介导甘油一酯和甘油二酯的脱酰基反应。这种酶后来被证实为patatin[17]。受实验方法的限制，前期的研究都没有得到纯化的patatin，使其功能的鉴定变得困难。为了确定patatin作为一种单体的酶学功能，Andrews等用腺病毒表达patatin的cDNA，他们的研究表明，patatin具有酰基水解和酰基转移功能[18]。

传统的脂肪水解酶具有被广泛认可的Ser-His-Asp三联体活性中心[19]，但研究发现，patatin的活性中心是一个二联体结构[20]。人cPLA2早前被证实有一个新异的Ser-Asp活性二联体[21]。考虑到它与cPLA2有部分序列一致，patatin也被推测包含一个相似的活性中心。Hirschberg等修饰patatin中保守的Ser、Asp 和His残端来确定它的活性位点[19]。最终，Ser54和Asp192被确定为活性位点。直接抑制serine导致patatin迅速、完全的失活，但直接抑制histidine没有引起patatin酶活性的任何下降[19]。以上假说被patatin的X线晶体结构证实，晶体结构显示patatin包含一个Ser-Asp二联体活性中心[22]。特殊的拓扑结构导致了patatin的双向酶学表现，这解释了PNPLA家族成员的合成代谢与分解代谢的双重活性。

1.2 PNPLA3的发现与功能鉴定

在早期的研究中，PNPLA3被不同的研究者命名了不同的名字。2001年，Sylvain等在3T3-L1向脂肪细胞分化的过程中发现了一种新的mRNA的表达，因为它的脂肪特异性以及营养调节特性，它被命名为“adiponutrin” [23]。对

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GenBank的扫描发现在人类22号染色体长臂的13区有一个未确定的基因，与adiponutrin cDNA序列高度一致，提示其人类同源体的存在。2004年，Jenkins 等克隆出了人类iPLA2亚家族的三位成员：iPLA2ε、iPLA2ζ和iPLA2η，其中iPLA2ε被认为是adiponutrin的人类同源体[24]。2006年，Paul等发表了人类PNPLA家族的鉴定[25]。利用多种生物信息学方法，他们鉴定出了人类基因编码的PNPLA家族的10个成员，每一位成员都包含1个patatin结构域。他们将这10个成员命名为PNPLA1到PNPLA10。此后，PNPLA3被广泛认可。

1.2.1 PNPLA3功能的体外研究

对PNPLA3的酶学功能的研究提示它具有显著的分解甘油三酯的活性。尽管western检测显示大部分PNPLA3分布在细胞的生物膜上，但是细胞质中的PNPLA3具有更强的分解甘油三酯的能力[24]。这可能源于其与底物微弱的相互作用，或者翻译后调节的不同。在酰基转移作用方面，将PNPLA3与C14标记的甘油一酯共同孵育引起了放射物标记的甘油二酯和甘油三酯的合成，提示PNPLA3参与了甘油三酯合成的系列过程(MOG＋MOG→DOG＋glycerol and MOG＋DOG→TOG＋glycerol) [24]。当时，人们对PNPLA3蛋白的结构和功能了解甚少，在分子水平和细胞水平进一步研究PNPLA3的表达、调节和功能充满挑战。

免疫印迹证实PNPLA3存在于细胞的膜成分中，而不存在于细胞浆中。在3T3-L1向脂肪细胞转化的过程中，PNPLA3mRNA的水平从第二天起迅速升高，到第八天时达到高峰[23]。这提示其在成熟脂肪细胞中是一种不可或缺的mRNA。当将细胞培养于无血清和无糖的培养液中时，PNPLA3mRNA的水平显著下降，将葡糖糖加入培养液中后，PNPLA3mRNA的表达升高了7倍，胰岛素也有轻微但是独立的促进其表达的作用[23]。

在小鼠原代肝细胞中，过表达鼠PNPLA3增加了细胞内甘油三酯的含量。敲除PNPLA3基因后，小鼠肝细胞内脂质聚积减少[26]。另一研究显示，在HEK293细胞中过表达PNPLA3没有降低细胞内甘油三酯的含量，而是引起了

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甘油三酯含量的升高[27]。

研究发现，在人肝癌细胞系中，SREBP-1c可以引起PNPLA3的表达[28]。在稳定表达重组PNPLA3的人肝癌细胞系中，脂肪酸（SREBP-1c途径的主要产物）可以引起PNPLA3蛋白表达的升高，却没有改变PNPLA3mRNA的水平[29]。PNPLA3的水平随油酸的增加呈剂量依赖性，油酸处理使PNPLA3的半衰期延长了2倍[29]。这些发现提示PNPLA3可能在转录后水平上受脂肪酸调控，调控通过前馈调节实现。SREBP-1c可能通过直接增加其转录或间接抑制其灭活而升高PNPLA3的水平。

上述发现提示PNPLA3参与了细胞内的能量生成和脂质代谢，其具体机制的揭示需要在整体水平的研究。

1.2.2 PNPLA3的功能在实验动物水平的研究

动物实验提示，PNPLA3mRNA在小鼠白色脂肪和棕色脂肪中高表达，19个小时的禁食使其降到了几乎检测不到的水平，但是8小时的复饲使其恢复到初始水平[23]。食物中不同组分也影响PNPLA3的表达。进食高糖饲料后，PNPLA3mRNA水平显著升高[30,31]，高蛋白饮食也有同样作用[31]，出乎意料的是，高脂饮食却没有引起PNPLA3mRNA水平的升高[31]。有报道指出，长期进食高脂饮食可以增加某些脂肪因子的表达[32]。前述研究中，实验小鼠只接受了5天的高脂饮食[31]。有必要进行一项长期研究来揭示脂肪饮食与PNPLA3表达的关系。另一项动物实验表明，高糖饮食使肝脏PNPLA3mRNA水平升高了90倍[29]。饮食成分对PNPLA3表达的调节是很快的，提示其调节方式可能是多种多样的。不同饮食成分对PNPLA3表达的调节是通过直接作用还是通过激素或神经信号等间接作用仍需进一步阐明。胰岛素介导的转录调节网络的激活参与了调节，SREBP-1c 和肝X受体参与了这一网络[29]。明确引起PNPLA3mRNA 表达升高的因子十分必要。

有趣的是，遗传性肥胖的fa/fa大鼠体内脂肪组织的PNPLA3mRNA的水平被观察到升高了30到50倍[23]。相反的，在瘦素缺乏的肥胖ob/ob小鼠体内的

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脂肪组织中，PNPLA3mRNA的表达下调了大约2倍[27]。值得注意的是，ob/ob 小鼠的组织是在进食后取的，fa/fa大鼠的组织是在空腹时取的。此外，品种的不同、饮食的不同以及生理学的不同都可能引起上述差异。

除了脂肪组织外，肝脏也是一个进行脂肪合成与分解的主要器官。在ob/ob 小鼠的肝脏内，PNPLA3高表达[27]。在小鼠肝脏内过表达PNPLA3可引起血清甘油三酯含量升高[26]。这提示PNPLA3在肝脏脂肪合成中起重要作用。另有研究表明，过表达PNPLA3扰乱了糖耐量，但是在db/db小鼠肝脏内敲除PNPLA3提高了糖耐量[26]。敲除小鼠的PNPLA3基因并没有引起能量、葡萄糖、脂质代谢的紊乱，也没有引起肝脏脂肪变性或损伤。增加PNPLA3表达的措施并没有改变上述代谢表型[33]。小鼠肝脏PNPLA3基因的表达直接受控于ChREBP和SREBP1c，调控位于转录水平，其调控作用受葡萄糖和胰岛素调节[28]。

所以，PNPLA3可能参与了营养代谢。实验动物方面的研究停留在初级水平，有必要扩展研究范围。未来的研究中，转基因小鼠的应用将会有巨大帮助。

1.2.3 PNPLA3的功能在人体的研究

在人类，PNPLA3在肝脏中表达量最高[25]。PNPLA3在小鼠和人体内的不同表达应该是物种差异的表现。

2004年，Liu等首次探索了在肥胖患者中PNPLA3基因表达的调控。他们的研究发现，PNPLA3mRNA水平在肥胖和非肥胖女性患者中并没有差异。短期或长期极低卡路里饮食（VLCD）显著降低了PNPLA3mRNA的表达，重新进食使PNPLA3mRNA恢复到了正常水平。同一研究证实，PNPLA3mRNA水平与空腹血糖水平呈反比，与胰岛素敏感性呈正比[34]。因为葡萄糖和胰岛素是调节对进食反应的两个重要因子，探索PNPLA3、葡萄糖、胰岛素之间的调节关系十分有意义。

在一项研究中，注射胰岛素和葡萄糖都引起了脂肪组织中PNPLA3基因表

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/l2ee.html