酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

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2010No．9SerialNo．222

ChinaBrewing

ResearchReport

酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

包伟霞，王静洁，王晓斐，陈由强，许旭萍*

（农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室福建师范大学生命科学学院，福建福州350108）

摘要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）和马克斯克鲁维酵母菌

（Kluyveromycesmarxianus）原生质体形成与再生的影响。实验结果表明，原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒酵母菌龄9h，采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解70min；马克斯克鲁维酵母菌龄8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min；配制酶液时渗透压稳定剂采用4%氯化钠高渗缓冲液，在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。关键

词：酿酒酵母；马克斯克鲁维酵母；原生质体的形成与再生

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2010）09-0042-03

中图分类号：TS261.1

ProtoplastformationandregenerationofSaccharomycescerevisiaeandKluyveromycesmarxianus

BAOWeixia,WANGJingjie,WANGXiaofei,CHENYouqiang,XUXuping*

(KeyLaboratoryofSugarcaneGeneticImprovement,MinistryofAgriculture;

CollegeofLifeSciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou,350108,China)

Abstract：Effectsofhyphaage,enzymeconcentration,stabilizerforosmoticpressureandenzymeolysistimeontheprotoplastformationandregenera-tionofSaccharomycescerevisiaeandKluyveromycesmarxianuswerestudied.Theoptimumconditionsforprotoplastformationandregenerationwereasfollows:S.cerevisiaeagedat9h,hydrolysiswith1.5%snailaseand0.5%cellulaseunder30℃for70min;K.marxianusagedat8h,hydrol-ysiswith1.0%snailaseand0.5%cellulaseunder30℃for50min;4%NaC1forstabilizationofosmoticpressureinpreparationofenzymolysissolu-tion，and15%canesugarsolutionfordilutionandmediumofregenerationculture.Keywords：Saccharomycescerevisiae;Kluyveromycesmarxianus;protoplastformationandregeneration

原生质体融合技术具有杂交频率高、重组种类多、遗传信息传递量大等优点，目前已广泛应用于微生物菌种的酿酒酵母Y01是一株具有良好发酵性能[1]，能够利改良中。

用甘蔗汁发酵生产酒精的优良菌株，但其最适生长温度为30℃，最适发酵温度为32℃，不能适应高温酒精发酵；而马克斯克鲁维酵母Y05具有较强的耐热性，在40℃时仍能为了得到一株既耐高温又高正常生长，但是产酒率较低。产酒精的新型酵母菌株，拟采用原生质体融合技术对酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母进行杂交。原生质体的制备与再生是融合前提，据文献报道，酵母菌原生质体的再生较为困难，再生率较低[2-3]。为了克服这一问题，本研究对两亲本的原生质体制备和再生条件进行了优化，为后续的原生质体融合育种创造条件。1材料与方法1.1材料1.1.1实验菌种

酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）由本实验室保藏，文中简称酵母菌Y01；马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces

1%，pH值为5.4；②氯化钠高渗培养基：在YPD培养基中调pH值为6.0；③蔗糖高渗培养基：在YPD添加4%氯化钠，

培养基中添加15%蔗糖，调pH值为6.0；④甘露醇高渗培养基：在YPD培养基中添加15%甘露醇，调pH值为6.0。固体115℃灭菌30min。培养基成分同上，另加2%琼脂，1.1.3主要试剂

）PB溶液：pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。（1

（2）高渗缓冲液（PBS）：①蔗糖高渗缓冲液：PB溶液加入15%蔗糖；②甘露醇高渗缓冲液：PB溶液加入15%甘露醇；③NaCl高渗缓冲液：PB溶液加入4%NaCl。以上试剂均115℃灭菌30min。

（3）脱壁酶：蜗牛酶和纤维素酶，使用时按所需浓度用高渗缓冲液配制，0.22μm微孔滤膜过滤除菌（现配现用）。1.2方法1.2.1菌体培养

将酵母菌Y01和Y05分别转接一环入YPD液体培养基中，酵母菌Y01置30℃（Y05置37℃）、200r/min振荡培养24h。取上述培养物按0.3%的接种量接入新鲜的YPD液体培养基中，同上条件培养至一定时间，将细胞浓度调整为3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，用于制备原生质体。1.2.2原生质体的制备与再生

取上述培养的菌液5mL，4000r/min离心5min收集菌

marxianus）1911购自中国工业微生物菌种保藏中心，文中

简称酵母菌Y05。1.1.2培养基

①YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸出汁

收稿日期：2010-02-27

基金项目：国家“948”项目基金（2006-G37）；农业公益性行业科研专项（nyhyzx07-019）；福建省教育厅资助项目（JB09029）作者简介：包伟霞（1986-），女，硕士研究生，主要从事微生物发酵研究工作；许旭萍*，教授，通讯作者。

研究报告

中国酿造

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体，菌体用PB缓冲液洗涤2次，无菌加入酶液，置30℃水浴100r/min振荡处理，每隔20min取样制片镜检，待视野中，

中有90%以上的细胞脱壁成为原生质体时，2500r/min离心10min收集原生质体，用蔗糖高渗缓冲液洗涤3~5次，经高渗缓冲液适当稀释后，涂布于高渗再生培养基平板，酵母菌Y01置30℃（Y05置37℃）恒温培养2d~3d。

原生质体的形成率及再生率的计算采用平板计数法[4-5]。1.2.3原生质体制备与再生条件实验

菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响：按照1.2.1方法将酵母菌Y01分别培养至7h、9h、11h和13h后，将细胞浓度调整为3.5×107个/mL~4.0×107个/mL，取5mL，4000r/min离心5min弃上清液，菌体用PB缓冲液洗涤2次，加入脱壁酶（1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解70min。酵母菌Y05分别培养至6h、8h、10h和12h后，同上步骤加入脱壁酶（1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶）30℃酶解50min。酶液配制原生质体稀释和再生采用15%采用4%NaCl高渗缓冲液，

蔗糖高渗缓冲液。计算原生质体形成率与再生率，以确定用于制备原生质体的最佳菌龄。

稳渗剂对酵母菌原生质体形成与再生的影响：酵母（菌龄9h）和Y05（菌龄8h）采用脱壁酶（1.5%蜗牛菌Y01

酶+0.5%纤维素酶）在30℃进行酶解，酵母菌Y01酶解70min，酵母菌Y05酶解50min。计算原生质体形成率与再生率。分别用NaCl高渗缓冲液、甘露醇高渗缓冲液、蔗糖稀释原生体高渗缓冲液作为渗透压稳定剂配制酶解液、和配制再生培养基。

酶浓度对酵母菌原生质体形成与再生的影响：将酵母分别采用2.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶、菌Y01培养9h后，

1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶和1.0%蜗牛酶+1.0%纤维素酶于30℃酶解70min。将酵母菌Y05培养8h后，分别采用1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶、1.5%蜗牛酶、1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶和1.5%纤维素酶在30℃酶解50min，计算菌株的原生质体形成率和再生率。酶液用4%NaCl高渗缓冲液配制，原生质体稀释和再生采用15%蔗糖高渗缓冲液。

酶解时间对酵母菌原生质体形成与再生的影响：在最佳菌龄、最佳酶浓度、最佳稳渗剂条件下，酵母菌Y01分别酶解50min、70min、90min和110min，酵母菌Y05分别酶解30min、50min、70min和90min，计算菌株的原生质体形成率和再生率。2结果与分析

2.1菌龄对酵母菌原生质体形成与再生的影响

菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形成和再生的影响，结果见图1。

由图1可以看出，菌龄对酵母菌Y01和Y05原生质体形成率与再生率影响显著，以对数生长中期为宜，酵母菌Y01菌龄为9h，酵母菌Y05菌龄为8h时，原生质体的形成率

和再生率最佳。当酵母菌处于对数生长早期时，菌体较稚

嫩，容易被酶破坏而死亡。菌龄到达对数生长晚期至稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著下降，Y05再生率也下降[6]。

2.2渗透压稳定剂种类对酵母菌原生质体形成与再生的

影响

由于原生质体对渗透压非常敏感，在低渗溶液中可立即破裂。因此，在原生质体制备过程的各个环节，均需在高渗环境中进行，以保护原生质体免于膨胀破裂，而且

其最佳稳定剂还有助于酶与底物的结合。由于菌种不同，

也不同。设计了几种不同组合的稳渗剂，比较其对原生质体形成率和再生率的影响，结果（附表）。可以看出，采用NaCl高渗缓冲液配制酶液、稀释原生质体及配制再生培养基，有利于Y01和Y05原生质体的形成，但不利于其再生。就再生率而言，以甘露醇高渗缓冲液和蔗糖高渗缓冲液的效果较好，但其形成率较低，可能是因为糖溶液的黏度大，造成酶与细胞接触不良，降低了酶对细胞的作用。糖是酵母的良好碳源，有利于细胞壁的再生及细胞的正常生命活动。综合考虑原生质体的形成率和再生率，可以采用蔗糖高渗缓冲液确定采用NaCl高渗缓冲液配制酶液，

稀释原生质体和配制再生培养基为最佳组合（组合4）。

附表渗透压稳定剂对Y01和Y05原生质体形成与再生的影响Attachedtable.Effectofstabilizerforosmoticpressureonformation

andregenerationofprotoplastofY01andY05

组合1

项目

配制

酶液稀释原生质体

组合2

组合3

组合4

NaCl高渗甘露醇高渗蔗糖高渗NaCl高渗缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液NaCl高渗甘露醇高渗蔗糖高渗蔗糖高渗缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液

配制再生NaCl高渗甘露醇高渗蔗糖高渗蔗糖高渗

培养基

缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液

Y01原生质

体形成率/%再生率/%Y05原生质体形成率/%再生率/%

94.06.996.08.9

83.521.386.632.1

67.140.071.447.3

92.217.694.839.8

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2.3酶类、酶浓度对酵母菌原生质体形成与再生的影响

由于不同种属酵母菌对酶浓度要求不同，采用不同结果浓度的酶解液对酵母菌Y01和Y05进行酶解处理，见图2。

2株酵母菌原生质体的形成和再生的影响是一致的，随着酶解时间的延长，形成率增加，再生率下降。综合考虑原生质体的形成率与再生率，确定酵母菌Y01酶解时间为70min，酵母菌Y05酶解时间为50min。3讨论

实验研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间）Y01和马等因素对酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）Y05原生质不同菌株的酵体形成与再生的影响，结果表明，不同种属、母菌制备原生质体所需的条件不同，上述4个因素均对原生质体形成率和再生率有显著影响。酵母菌Y01的适宜条件是菌龄为9h，酶浓度为1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，在30℃酶解70min，原生质体的形成率为92.4%，再生率为21.3%。酵母菌Y05菌龄为8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min，原生质体的形成率为95.2%，再生率为35.7%。2菌株脱壁的渗透压稳定剂都是采用4%NaCl高渗缓冲液配制酶液，以15%蔗糖高渗缓冲液稀释原

由图2可知，酵母菌Y01脱壁处理适宜的酶浓度是1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，原生质体形成率为92.3%，再生率为15.2%；酵母菌Y05适宜的酶浓度是1.0%蜗牛酶+原生质体形成率为99.7%，再生率为32.5%。0.5%纤维素酶，

2.4酶解时间对酵母菌原生质体形成与再生的影响

生质体和配制再生培养基。确定的条件与文献报道的有所不同，再生率也较文献中的高。通过对2株酵母菌原生质体制备和再生条件的优化，获得了较高的形成率和再生率，为下阶段的原生质体融合选育利用甘蔗汁高温酒精发酵菌种奠定了基础。参考文献：

[1]许旭萍，王晓斐，陈由强，等.适合能源甘蔗酒精发酵酵母生理及发酵2009，25（1）：96-100.特性的研究[J].福建师范大学学报，

[2]王莹，刘长江，张峰龙，等.南阳酵母原生质体制备与再生条件研究[J].沈阳农业大学学报，2007，38（2）：182-185.[3]高年发，张

颖.酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备与再生的条件

优化[J].中国酿造，2006（12）：13-16.

[4]王明兹，施巧琴，周晓兰，等.提高酵母菌原生质体制备与再生的方法研究[J].微生物学杂志，2005，25（3）：10-13.

[5]BALASUBRAMANIANN,ANNIEJULIETG,SNKALAIVANIP,etal.ReleaseandregenerationofprotoplastsfromthefungusTrichothecium-roseum[J].CanJMicrobiol,2003,49:263-268.

岳田利，袁亚宏.高活力苹果酒酵母原生质体形成与再生条[6]王林松，

2007，35（5）：194-198.件研究[J].西北农林科技大学学报，

[7]李英军，马晓燕，赵红梅，等.马克斯克鲁维酵母原生质体制备和再生2006（7）：51-54.条件的研究[J].酿酒科技，

酶浓度和最佳渗透将酵母菌Y01和Y05在最佳菌龄、

压稳定剂组合的条件下，进行不同时间的酶解处理，计算其原生质体形成率与再生率，结果（图3）可知，酶解时间对

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