激光扫描共聚焦显微镜技术

激光扫描共聚焦显微镜技术

Laser Scanning Confocal Microscope

——基础篇 李治国

细胞的内在生活 显微镜的发展史

没有显微镜就不可能有细胞学诞生。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜。

1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓)，命名为cella。

1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。

Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723). Magnification ranges at 50-275x. 显微镜的最重要参数 ——分辨力

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 各种显微镜的分辨能力

光学显微镜（light microscopy）0.2μm

电子显微镜 (Electro microscopy) 0.2nm

扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。 1981年，瑞士人G.Binnig和H.RoherI在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。

常用的光学显微镜（light microscopy) ?普通光学显微镜 ?暗视野显微镜 ?相差显微镜

?偏光显微镜

?微分干涉显微镜 ?荧光显微镜

?激光共焦扫描显微镜 普通光学显微镜原理 普通光学显微镜原理图 1. 构成：

①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置

2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 暗视野显微镜

根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜

观察到明场看不到的极其微小的物体 最高分辨率可达0.004微米 1 原理

丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒的散射光。

暗视野显微镜就是利用微粒的散射光原理设计的。 2 结构特点

使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。 暗场显微镜原理 3成像特点

在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力

为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。 5 暗场显微镜的要求

要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘 物镜前透镜必须清洁无尘

载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求 6暗场观察方式调节

(1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。 (2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。

(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。

人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色的透明物体。

光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜色的变化，而只产生所谓的相位差。可是这种相位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。

相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。 相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。

用于观察组织培养中活细胞形态结构。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。

偏光显微镜

依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜分辨率可达0.04微米将普通光改变为偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性)偏振光与自然光 1. 横波的偏振性

光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内, 可有不同的振动方向。

2.线偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振动。 二、起偏和检偏

起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。 检偏：检查入射光的偏振性的过程。

双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。尼科耳棱镜。

在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。 寻常光线(o光):遵守折射定律。对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。

非常光线(e光):不遵守折射定律。它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播 。

o光和e光都是线偏振光,且振动方向相互垂直

二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。

旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度? 的现象，称为旋光现象。这种介质称为旋光物质。如石英、糖、酒石酸钾钠等。 微分干涉显微镜

无色透明活体标本的细微结构 图象呈浮雕状的立体感 观察效果更加逼真 1 原理

通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，

光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。 2 特点

可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观

无须特殊物镜，与荧光观察配合更好

可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。 荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光，信噪比高 荧光显微镜 一、原理

荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光，信噪比高

荧光光源 一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 荧光显微镜用途

1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构 2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜

色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。

3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。

4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。

用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。缺点分辨力不高 激光共焦扫描显微镜

（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM） LSCM的基本结构、工作原理 荧光探针的选择原则

LSCM在生物医学领域中的应用 激光共聚焦扫描显微镜简介 80年代研发的新型显微镜 以荧光显微镜成象原理为基础

采用激光扫描装置，利用计算机生成图象

得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察细胞，还能显示诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。 发展史

1、20世纪50年代中期提出。

Marvin Minsky在哈佛大学博士后工作期间，提出了共聚焦显微镜的基本概念，并于1957年申请了技术专利。Minsky的发明并没有马上引起人们的注意，主要原因是没有足够强度的光源，并且当时计算机的能力还不足以处理大量的数据。 2、90年代发展成熟。

随着光学和电子技术的发展产生了更稳定和更强的激光、更高效的扫描镜片组、高效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪音的检测器。更多适合激光激发的荧光染料不断被合成。相应的计算机处理器速度快速发展，图像显示技术增强和大容量的存储设备的产生，推动了激光扫描共聚焦显微镜迅速普及。

2006年购入OLYMPUSFV1000，耗资18.7万美元。

激光扫描共聚焦显微镜 结构和工作原理 目标要求

1.掌握激光扫描共聚焦显微镜技术的工作原理。 2.熟悉激光扫描共聚焦显微镜的结构。 3.了解激光产生的原理。

4.了解激光扫描共聚焦显微镜的功能。 一、基本组成

（一）激光器:多线氩离子(458 nm, 488 nm, 514 nm) 、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633 nm) （二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)、荧光显微镜(装有微量步进马达)系统，实现点光源在样品上逐点逐层扫描成像

（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。

（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。

二、激光器激光产生的原理 （1） 受激吸收 激光器的结构 激光工作介质

在这种介质中可以实现粒子数反转，以制造获得激光的必要条件。 激励源

通过一定的方式使处于高能级的粒子数增加。包括电激励，光激励，热激励、化学激励等方法 。 谐振腔

光在谐振腔中来回振荡，造成连锁反应，雪崩似的获得放大，产生强烈的激光，从部分反射镜子一端输出。 三、扫描器 四维扫描模式

激光扫描共焦显微镜的发展趋势

多光子激光扫描显微镜— Multiphoton Laser Scanning Microscopy

在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景. 多光子激光扫描显微镜简介

1. 多光子激光器波长从700-1000nm连续可调 双光子波长：350-500nm 连续 三光子波长：230-330nm 连续

应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌 (5-HT) 或 NADPH的分布

多光子激光扫描显微镜优点与局限: 优点:

1 对生物样品的光损伤小 2 有效观测时间长 3 穿透深度深 4 荧光收集率高

5 对探测光路的要求低 6 适合多标记复合测量 局限:

1 只能对荧光成像

2 样品可能受到热损伤.(若样品含吸收激发光的色团,如黑色素) 3 超快激光器较为昂贵

四、激光共聚焦扫描显微镜技术特点 激光光源

逐点、逐行、逐面快速扫描被激发荧光成像

共聚焦 ：扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点 五、激光共聚焦扫描显微镜技术优点

用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。

采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,

将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差 采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图

在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术。可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。 五、激光共聚焦扫描显微镜应用优势 半定量分析方便。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。

分辨率高。由于激光束的波长较短，光束很细，排除焦平面以外光的干扰，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

可重构样品的三维结构。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。 可连续摄像

六、LSCM的功能

1.获取透射光、反射光及荧光图像，能进行定性及定位分析及图像处理

2.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 及三维重组

3.连续摄像 4.光谱扫描

激光扫描共聚焦显微镜 荧光探针的选择 学习目标

1.了解荧光产生的原理。

2.掌握荧光淬灭的概念及影响荧光淬灭的因素。 3.熟悉常用的荧光探针。

4.了解荧光样品的制备过程。 （一）荧光

一些物质原子受光照射时，能吸收入射光子的能量，使其电子从低能级向较高能级跃迁，处于这种激发态的分子不稳定，电子可通过跃迁的形式发射可见光子，放出多余的能量而返回基态，这种放出先前所吸收能量的可见光，即荧光。荧光在停止激发的时候发光在10-7-10-8s内停止。

可见：荧光是发射光。

即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 荧光的种类：

自发荧光（固有荧光） 二次荧光

3.荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针

4.细胞活性探针 5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它 二、荧光样品的制备过程

（一）荧光标记前样品的准备

组织标本：活的组织切片、冰冻切片和固定切片 细胞标本：爬片、穿刺液涂片、液体沉淀涂片

在保证形态完整、达到试验目的的情况下，切片厚度越薄越好，一般为4-35μm

（二）用荧光探针标记样品 1.荧光探针的储存和配制

一般按产品说明书要求，避免反复冻融。工作液现用现配。 2.正确溶解荧光探针

荧光探针的充分溶解是很重要的。常用溶剂甲醇、乙醇、DMSO、水（生理盐水）缓冲液等。储存液中荧光探针的浓度一般为10-1000μm。 注意：

a.甲醇、乙醇低沸点、易挥发，使用时防止其挥发造成探针浓度浓缩和干燥。

b.DMSO易凝固，要在25℃以上待其充分融化以后再用于溶解荧光探针。

c.对于难溶解的荧光探针，可考虑用超声溶解。 3. 确定荧光探针标记待测样品的条件

影响胞内荧光探针浓度及分布的因素可分为两类： a.由细胞本身决定的因素，如细胞种类、活性、膜表面积结构和大小、细胞内成分和结构等。

b.染色条件，如初始的细胞外染料浓度及细胞浓度、荧光探针与细胞孵育时的时间、PH、温度、接触面积、溶剂的极性、共存物质的种类等。

4.荧光染色方法：

(1)生物样品与荧光探针（或其衍生物）直接结合，使样品具有荧光。 许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞。可以用乙酰羟甲基酯(AM)作为载体，将探针运送入细胞。荧光探针与AM结合后变成不带电荷的亲脂性化合物，易于通过质膜进入细胞。之后细胞内的AM被非特异性酯酶水解释放出荧光探针，由于探针的疏水性使其不易透出质膜。荧光探针与细胞内的靶结构或靶分子结合，从而能有效的发挥作用。例如：Fluo-3就需要AM的辅助

(2) 显微注射法：该法复杂精细，而且得到荧光的细胞少。 例如：膜片钳导入法、微量电泳注射法、压力注射法

(3) 膜通透法增强探针跨膜能力 例如：透膜剂、低渗培养液或低pH培养液短期刺激。

(4)首先用荧光探针将某些特定的分子标记，这些特定分子再与样品作用，通过检测细胞内荧光强度和位点，达到测定细胞内靶分子的含量及其定位的目的。

例如：免疫荧光法、荧光标记的药物及蛋白的跨膜研究，尤其是间接免疫荧光法更为常用。 二、荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。 荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性

光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。 重点内容回顾 荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针

4.细胞活性探针 5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它 荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。 荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性

光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。

荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针

4.细胞活性探针 5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它 www.Probes.com

荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性

光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。

激光扫描共聚焦显微镜的应用

（一）细胞或组织内核酸的定位、定性

荧光探针分子与核酸的结合基本上有三种方式:嵌入式结合方式、结构亲和方式、以共价键方式结合

1.常用核酸染料包括花青类和经典核酸染料两大类。

1) 花青染料包括: 核酸超敏定量和凝胶染色的染料，细胞非通透性的TOTO、TO-PRO、SYTOX染料家族，细胞通透性的SYTO 染料家族，能用来形成生物交联物的化学反应性SYBR染料。

2) 经典核酸染料包括：插层染料, 如溴化乙锭和碘化丙啶(propidium iodide)PI；小沟结合剂, 如DAPI和Hoechst染料；不同性质的核酸染料，包括吖啶橙(AO)、7-AAD、LDS 751和羟基芪脒(hydroxystilbamidine), 各具有特殊性质。

图示活的牛肺动脉内皮细胞与细胞通透性的淡兰色荧光二氢乙锭和绿色荧光线粒体染料

图示DAPI与DNA结合的X-线晶体结构。X-线晶体学显示DAPI与DNA在小沟结合。

DAPI是出色的核复染剂，可显示出清楚的染色体显带图案 （二）蛋白质的定位、定性 ? 免疫荧光 直接免疫荧光 间接免疫荧光

? 绿色荧光蛋白

免疫学中抗原抗体知识回顾

常见的以免疫学为基础的分析方法 一、免疫组化 二、pull down 三、免疫共沉淀

四、酶联免疫吸附（ELISA） 五、western blot 六、激光共聚焦

七、流式细胞仪分析 等等。。。。

抗体的常见标记

单克隆抗体和多克隆抗体 单抗与多抗的区别

单抗 多抗

抗体组成 单一 复杂 抗体性质 个体的属性 群体综合的性质 纯化标记 容易，效果好 难度高一些

种属来源 绝大多数是小鼠 兔子、羊、豚鼠等 制备周期 长 (最短4个月） 短（2个月） 制备技术 复杂 简单 经费 多 少 抗原决定簇

1、概念 抗原决定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。

2、种类和数量 一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD ，一种AD决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性

3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。 顺序决定簇和构象决定簇 顺序决定簇（线性决定簇）：

一段序列相连的氨基酸片段形成

多在抗原分子内

主要由T识别，B也可识别 构象决定簇：

序列上不相连，由天然构象形成 位于分子内部 由B识别

功能决定簇和隐蔽决定簇

功能性抗原决定簇：位于表面的、易被抗体及淋巴细胞识别的、可启动免疫应答的决定簇的免疫优势集团

隐蔽性抗原决定簇：为于分子内部的，不能引起免疫应答的决定簇 功能决定簇和隐蔽决定簇

氨基酸残基在侧链的位置不同，其免疫原性不同。 抗原抗体反应的原理

抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 物质基础:

抗原表位与抗体高变区间的互补结合

抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合 抗原抗体之间的结合力 电荷引力（静电引力） 范登华引力 氢键结合力 疏水作用力

1. 电荷引力（库伦引力或静电引力）:

抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力.

例如，一方在赖氨酸离解层带有阳离子化的氨基残基（-NH3 + ），另一方在天门冬氨酸电离后带有阴离子化的羧基（-COO- ）时，即可产生静电引力，两者相互吸引，可促进结合。这种引力和两个电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便很微弱。 2.范登华引力:

原子与原子、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引起的引力。

由于抗原与抗体两个不同的大分子外层轨道上电子之间相互作

用，使得两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。这种引力的能量小于静电引力。 3.氢键结合力:

氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当具有亲水基团（例如-OH,-NH2 及 -COOH）的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢键桥梁，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强，并更具有特异性，因它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合。 4.疏水作用:

抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸（如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由于静电引力形成的亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，从而促进抗原与抗体间的相互吸引而结合。这种疏水结合力对于抗原抗体的结合是很重要的，提供的作用力最大。 抗原抗体反应的特点 特异性 可逆性 特异性

抗原抗体的特异性 是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。 不同的抗体超变区氨基酸残基的变异性使曹沟形状千变万化，只有与其结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。 可逆性

抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为： [Ab-Ag]／[Ab]·[Ag]=k1/k2=k

式中各反应项的单位以mol表示，k1表示反应速度常数，k2为逆反应速度常数，K是反应平衡时的速度常数。由上式可知，K值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗体亲和力通常以K值表示。 抗原与抗体结合形成复合物后，在一定条件下，又可以解离为游离的抗原与抗体，这种特性称为抗原抗体反应的可逆性。 抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，形成的复合物是不牢固的，在一定条件下可以解离因此抗原抗体反应形成复合物的过程是一

个动态平衡。

影响抗原抗体反应的因素 抗原抗体本身的因素： 抗原：

抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。 抗体：

? 来源 不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。尤其是其Fc段不同，需用不同的二抗。 ? 浓度 抗体的浓度过低，抗原抗体不能结合，过高抗原抗体会发生非特异性结合，一般选取尽可能低的浓度保证抗原抗体结合的特异性。

? 特异性与亲和力 抗体应尽可能选择高特异性、高亲和力的抗体，以保证试验的可靠性。

反应环境因素： 电解质 酸碱度 反应时间 振荡和搅拌 温度

一般以15～40℃为宜，最佳反应温度为37℃，在此范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；温度越低，结合速度越慢，但结合牢固。 共同抗原和交叉反应 两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原。

一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。 对照的设置 阳性对照 阴性对照 空白对照

指不做任何实验处理的对照组。空白对照能明白地对比和衬托出实验组的变化和结果,增加说服力。 间接免疫荧光法基本原理 Western blot 原理 观察物质的转位

亚细胞结构中不同物质的共存 蛋白表达共定位 荧光蛋白：

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）:分子量27kD，其融合蛋白不影响结合蛋白的生物学功能，转染的细胞继续传代也能观测；吸收光的波长最高峰在395nm处，在479nm处也有吸收峰，发射的绿光波长最高峰在509nm。

2008年诺贝尔化学 奖授予日本化学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁?沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）三人，以表彰他们“发现和发展了绿色荧光蛋白质”技术 绿色荧光蛋白标记的猪 GFP主要应用:

对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。

GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察 该分泌蛋白分泌到细胞外的过程

GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程 可用于观察分子的运动（FRAP） 蛋白之间的相互作用（FRET） 细胞内游离Ca2+测量

检测游离Ca2+ 变化荧光探针的原理：

探针多为Ca2+ 螯合剂，不与Ca2+ 结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。 常用Ca2+测定的荧光探针

Cl–荧光探针

细胞内 Cl–浓度的测定和Cl– 通道的研究目前很活跃。

例如囊性纤维化是由于编码Cl– 转运通道的基因突变引起。通过Cl–

通透性分析可用来检测其转运通道CFTR和其他阴离子转运蛋白的活性。

大多数荧光Cl–探针是6-甲氧基喹啉衍生物。

常用的探针有6-甲氧基-N-(3-硫丙基) 喹啉(SPQ)；N-(乙氧羰甲基)-6-甲氧基喹啉溴化物[N-(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxy quinolinium bromide，MQAE]；6-甲氧基-N-乙基喹啉碘化物[ 6-Methoxy-N-ethylquinolinium iodide，MEQ]；光泽精(Lucigenin) （四）膜电位

以往测定膜电位多用微电极直接插入法测量，不仅操作麻烦，需要专门仪器，费用昂贵，而且对细胞也是一种损伤。激光扫描共聚焦显微镜则可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于连续监测膜电位的迅速变化。膜电位荧光探针根据其对膜电位变化反应速度的快慢分为快、慢两类探针，各类均有10多种。

快反应染料对膜电位的变化可在数毫秒内作出反应，适用于测量膜电位快速变化的细胞，如神经细胞、心肌细胞等。

而慢反应染料的反应速度则相对较慢(几秒或几分钟)。

DiSBAC2(3)为常用的膜电位荧光探针，为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。 Rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量。Rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与DiBAC4(3)的表示形式相反。

JC-1 (5,5‘,6,6’-tetrachloro-1,1‘,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)是检测活细胞线粒体膜电位最合适的探针。

JC-1 在低浓度或低膜电位情况下，以单体形式存在，发绿色荧光。 较高浓度(0.1 μM以上的水溶液) 或较高电位条件下，JC-1 形成红

色荧光的J聚体(J-aggregates)，最大激发和发射光谱波长约为590 nm 。

JC-1测定线粒体膜电位 五、细胞内活性氧

活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。

根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。常用荧光探针有 (2，7-二氯二氢荧光黄乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为二绿荧光黄 (DCF)而产生荧光，其反应灵敏到10-12 mol水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。 H2DCFDA应用示例 （六）细胞间通讯 一、荧光漂白恢复

(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching） 定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的 激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度 下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢 复,荧光强度恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散 的速率,或分子运动速度。 R=(I2-I1 /I0-I2)′100%

R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度

应用：细胞间通讯，细胞膜流动性，蛋白分子的运动 （七）光活化技术

定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰生物活性分子的化合物，一旦被光照射，两者间的共价键解离而释放出活性分子，这一光活化技术称为解笼锁。 笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质、笼锁钙等 共聚焦可控制使笼锁探针分解，从而有效地控制多种生物活性产物及其它化合物发挥作用的时间和空间 光活化技术

通过光活性物质控制神经活动只需要特定光束扫描预选的

活化位点，实验操作非常简单．结合荧光标记及成像技术，可以同时

记录所调控神经细胞的形态、位置信息以及功能信号，易于同时确定该细胞在神经网络中的结构定位和功能，因此具有广阔的应用前景．斯坦福大学的Zhang 和Wang 等2007 年发表在《自然》(Nature)上关于光控制神经回路的文章，被该杂志评为该年度最受欢迎的论文之一，并被麻省理工学院技术综述评为该年度十大最有影响的技术之一．

（九）细胞、亚细胞结构 标记细胞器荧光探针 1)线粒体(Mitochondria)

a. Rodamin 123 505/534，可染活细胞，阳离子性,可 检测线粒体膜电位,且在多数细胞中停留时间短

B. JC1线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光

标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针

c. Mitotracker Green FM 490/516,染活细胞或固定细胞,稳定不漏出

d. Mitoracker Orange CMTMRos 551/576,(氧化型) Mitoracker Orange 还原型,只能染活细胞 2)溶酶体 (Lysosome)

a. 中性红 541/640 微偏碱性,可标记溶酶体等酸性器官，为非特异性

b. AO :

LysoTracker Green DND-26 504/511,染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red

3)内质网 (Endoplasmic Reticulum)

DiOC6 484/500: 非特异性,较高浓度标记内质网, 较低浓度标记线粒体

4)高尔基体 (Golgi apparatus)

NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 适用于线粒体的荧光探针较多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、Rhodamine 123等。

高尔基复合体常用的荧光探针有NBD ceramide、BODIPY ceramide。 内质网主要用DiI、DiOC6(3)。

溶酶体的荧光探针有LysoTracker类、DAMP、neutral red。 通过选择不同标记物，同时显示细胞的三部分结构。 Spectral imaging

检测细胞凋亡（apoptosis） what’s apoptosis?

原文是希腊文，apo的意思是从?，ptosis的意思是落下。apoptosis原意表示树叶从树木上落下。希腊语中正是花儿凋谢，树叶落下的景色。

凋亡与坏死不同，是指由基因调控的细胞主动性死亡过程，是多细胞体保持细胞平衡的重要生理机制。表现为细胞内特殊的“死亡基因”被激活，表达并激活依赖钙和镁的某些核酸内切酶，将细胞染色质以核小体为单位切断， DNA电泳时能形成特征性的200bp阶梯。

细胞凋亡的生物学特征 形态学变化

表面微绒毛消失，脱离周围细胞 胞浆脱水、体积缩小、固缩

内质网扩张与胞膜融合形成膜表面芽状突起（出芽）

核固缩成团、染色质集中分布在核膜的边缘呈新月性、马蹄形。称染色质边集

胞膜内陷分割包裹胞浆形成泡状小体。称凋亡小体（细胞凋亡的特征之一）

凋亡小体形成后迅速被吞噬细胞清除，没有细胞内容物外漏、不伴有炎症反应。 生物化学变化 DNA片段化

核酸内切酶的激活

脂质和凋亡相关蛋白改变 细胞凋亡的过程及机理 接受凋亡信号

凋亡调控分子间的相互作用

蛋白水解酶（caspases）的活化 凋亡的级联反应

细胞凋亡的信号转导通路

死亡受体信号通路 线粒体信号通路 内质网信号通路

细胞凋亡的信号转导通路 ? 细胞凋亡的生理意义 ? 确保正常发育、生长 ? 维持内环境稳定 ? 发挥积极的防御功能

所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，是医学界的关注热点。

生理性细胞凋亡的作用 1. 确保正常发育、生长

在器官、组织的形成、成熟中发挥作用

(细胞团 具备复杂结构的组织器官)

激光扫描共聚焦显微镜主要用于观察荧光标记的凋亡细胞形态、检测凋亡的进程及测定活细胞凋亡过程中钙的变化等。

具体方法有：观察细胞膜、核形态、凋亡小体、检测DNA断端的TUNEL及凋亡早期细胞膜损伤的Annexin-V法等 1.细胞核形态观察

常用标记DNA的荧光探针：

Hoechst33342, Hoechst33258, DAPI; 标记DNA RNA的AO和PI：

观察结果：可见凋亡细胞的细胞核区染色质浓缩，DNA凝结而成的凋亡小体等。未经RNA酶消化的细胞，用AO和PI标记后，还可以显现出细胞的整体轮廓，可以看到凋亡细胞的出芽，变形等现象。 2.脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法

（terminal-deoxynucleotide transferase mediated d-UTP nick end labeling,TUNEL）:

用于观察DNA的断裂，适于检测固定细胞，组织切片等样品。在细胞凋亡过程中，染色体DNA的断裂是个渐进的过程。DNA双链或只要一条链上出现缺口，即可产生一系列DNA的3’－OH末端，在DNA末

端转移酶或聚合酶的作用下，将荧光标记的脱氧核苷酸掺入到双链或单链DNA的3’－OH末端。因此，FITC的绿色荧光就可以显示出断裂位置，细胞上绿色斑点越大，说明其断裂的3’－OH末端越多； 凋亡时染色体断裂的原理

3.Annexin －V法检测凋亡：

原理：在凋亡的早期阶段，变化主要发生在细胞的表面。此时,虽然细胞膜的完整性尚还维持，但膜磷脂已失去平衡。位于细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）会从细胞膜的内侧翻转到外侧。而Annexin-V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂具有高度亲和力，可与PS结合，从而在早期凋亡细胞还未出现形态学改变及DNA降解以前，即可与通过Annexin-V荧光染料检测到。所以，在凋亡早期，仅可见到细胞膜上被染成绿色；凋亡中期，Annexin-V进一步与胞浆内的PS结合，可见细胞膜和胞浆均被然成绿色。一般与PI结合使用，PI是不能透过细胞膜的核酸染料，但对于凋亡晚期的细胞和死细胞，能透膜而使其染红。因而，Annexin-V与PI配合使用，能将凋亡细胞与死细胞鉴别开来，并且可以初步确定细胞凋亡进程。

优点：能定性、定量、原位检测活细胞的凋亡进程，并区分出正常细胞和死亡细胞。节省细胞和试剂。操作简单，省时省力。 重点内容回顾

荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针 2.细胞器探针 3.核酸探针

4.细胞活性探针 5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针 7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它

荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能

标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。 荧光强度适宜、具有可重复性。 注意荧光稳定性

光敏效应弱：主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。例如：强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等） 样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。 激光共聚焦显微镜的用途

（一）细胞或组织内核酸的定位、定性 （二）蛋白质的定位、定性 （三）细胞内离子的测定

（四）膜电位五、细胞内活性氧 （六）细胞间通讯 （七）解笼锁

（八） 荧光能量共振转移 （九）细胞、亚细胞结构 间接免疫荧光法基本原理 影响抗原抗体反应的因素 抗原抗体本身的因素： 抗原：

抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。 抗体：

? 来源 不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。尤其是其Fc段不同，需用不同的二抗。

? 浓度 抗体的浓度过低，抗原抗体不能结合，过高抗原抗体会发生非特异性结合，一般选取尽可能低的浓度保证抗原抗体结合的特异性。

? 特异性与亲和力 抗体应尽可能选择高特异性、高亲和力的抗体，以保证试验的可靠性。

反应环境因素： 电解质 酸碱度 反应时间 振荡和搅拌 温度

一般以15～40℃为宜，最佳反应温度为37℃，在此范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；温度越低，结合速度越慢，但结合牢固。 凋亡的共聚焦检测方法 观察细胞膜、核形态 凋亡小体

检测DNA断端的TUNEL法

凋亡早期细胞膜损伤的Annexin-V法

CFP(蓝色)位于内质网、CGFP（绿色）位于细胞核、GFP（黄色）位于质膜、YFP（红色）位于线粒体

三重荧光图像与透射光图像共定位意示图

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/l01g.html