质粒转染实验步骤-2

质粒转染大肠杆菌

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），

氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），

无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1. LB培养基的配制：

在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min. 固态培养基

LB固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。 2. 从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3. 加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。

4. 42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 5. 向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

6. 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。 同时做两个对照：

对照组1： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增

1. 从LB平板上挑取新活化的单个菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100-1：50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

2. 取上述培养液置于冰中10min，之后转移到已灭菌的50ml离心管中再于冰上放置5min

3. 于4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌 4. 质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 5. 质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

质粒转染细胞株

材料

细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（Lipofectamine TM2000） 实验步骤 Ⅰ.准备细胞：

贴壁细胞：转染前 24 h，在 500 μL无双抗完全培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为80 - 90% 。 ( 注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。) II ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用50 μL Opti-MEM稀释0.8 μg质粒DNA，轻轻吹吸3 - 5 次混匀，室温下静置5 min。

（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用50 μL Opti-MEM 稀释2.0 μL Lipofectamine TM2000，轻轻吹吸3 - 5 次混匀，室温下静置5 min。

（3）混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。注: 转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染。

（4）转染复合物加入到24孔细胞板中，100 μL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于37℃、5% CO2 培养箱中培养6 h左右，进行换液，换成含10%血清的普通培养基，在37℃，5％CO2孵育箱中继续培养24h左右。

稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）

从37℃，5％CO2孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用PBS冲洗细胞2遍，胰蛋白酶消化，接种1/2的细胞到100 mm培养皿中，加入含500 μg/ml G418的新鲜培养基，每2-3天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后，换用新的不含G418的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到60%汇合率时再用含500 μg/ml G418的培养基筛选一次。当细胞达到90%以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养（转染后10-12天左右）。以后每隔4-5天再用含500 μg/ml G418的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染后15天左右）。以后继续培养时加入的G418浓度降一半。

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