生物发光和化学发光在生物技术中的应用

生物发光和化学发光在生物技术中的应用

最近的一些分子生物学进展使得一些生物技术工具极大提高了生物发光和化学发光的检测和快速应用。这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程（如基因表达，蛋白质－蛋白质相互间作用和疾病的进程），可应用于临床、诊断、和药物开发等。而且，结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具，如重组细胞生物传感器，免疫分析和核酸杂交系统。发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置（如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板）以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。

自从20多年前，Marlene DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因（luc基因）的转基因烟草以来，生物发光的应用进入了一个新时代。生物发光和化学发光（BL/CL）的主要特点就在于发光信号的高度可测性，可以用PMT（光电倍增管）和CCD成像系统来检测极少量的光子信号。BL是属于CL范畴之内，CL反应的特点是高光子产生效率，BL为05-0.8 ，CL为0.1-0.001。因此BL/CL的检测极限可以达到10－18到10－21摩尔，这显然要比其它的光学技术强的多。

BL/CL已经发展出了很多具体的分析方法来诊断目前微摩尔或纳摩尔级的生物样本。通过BL/CL结合酶反应，如氧化酶、脱氢酶和激酶等，就可以达到如此的检测灵敏度。然而，以发光技术为基础的分析主要还仅仅停留在作为一个诊断工具。如果BL/CL的潜能能够得到开发，那么许多稀有的微量样品也可以通过一个便宜、可靠甚至是点对点的方式进行测量。

分子生物学和生物技术持续地进展产生了一些新的BL/CL试剂，包括重组和突变酶及相关基因，可以作为报告剂或探针。这些工具的获得，再加上新的CL高效底物，促进了革新性的生物分析技术的出现，用于许多靶标的超敏感检测。

新的BL/CL生物技术工具

新的BL/CL报告基因

报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列，编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。报告基因技术应用到研发BL/CL全细胞生物传感器的原理如图1a。

目前，细菌荧光素酶基因（如陆上的Photorhabdus luminescens和海洋中Vibrio harveyi细菌的lux基因），真核的来自于萤火虫Photinus pyralis和海参Renilla reniformis的luc和ruc基因是广泛应用的BL报告基因。此外，一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。有意思的是一些新的基因，如那些能够发射红光和绿光的Phrixothrix hirtus荧光素酶，各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。不同的荧光素酶的特性如表1。此外最近克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶（HRP）成为一个新的生物技术工具，在不久的将来有较大的期待。实际上，高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。

双报告基因系统

在多重发光测试中，信号是同时产生，测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是，反应也可以按顺序被促发，如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光素酶双报告基因试剂。双报告系统的原理如Figure 1b.

双重分析的BL/CL分析采用连续的闪烁型（Flash）发光形式，如发光蛋白水母蛋白和acridinium-9-carboxamide标记。这种方法可以在一个反应管里定量两个分析物和测试两个发光反应。因为它建立在flash型的发光上，分析测试需要非常短的时间，所以适用于高通量的筛选。

图1. 新的生物技术工具。(a)利用报告基因技术研发的生物发光和化学发光(BL/CL)全细胞生物传感器。一个被分析物质或者刺激会特异性的激活控制基因表达和蛋白合成的调控序列，再利用BL/CL技术进行检测。(b)双报告系统。控制蛋白的信号会组成性的表达，以作为一个内部参照，对以来于被分析物／刺激的信号进行校正以减小实验变异；另一种方式是在同一系统中，使用两个基因同时或先后检测两种分析物。(c)一个报告基因蛋白与一个结合蛋白融合形成BL/CL双功能融合蛋白。(d)包含有相应结合蛋白（如MagA蛋白）的融合蛋白可以被细菌磁性颗粒特异性

捕获。

BL/CL双功能分子

目前已有报道，一个双功能的分子既可以作为萤火虫荧光素酶的底物，又可以作为HRP的底物。通过这种方法，因为不同的发光光谱，就可在同一个反应孔中可以用两个酶标记并独立测试。

通过编码BL酶的基因或发光蛋白基因与第二个基因（编码结合蛋白，如蛋白A，蛋白G，链霉亲和素，或生物素受体肽）形成融合蛋白可以广泛用于免疫分析或免疫印迹，如图1c。

表1. 不同组织中生物发光系统的特性

细菌磁性颗粒（Bacterial Magnetic Particles，BMPs）

一个新的有趣的方法是基于磁性细菌Magnetospirillum magneticum建立的细菌磁性颗粒（BMPs）。通过融合蛋白技术，在细菌表面BMPs展示了其特异的蛋白性能。这个生物技术工具，组合了磁性和生物特异结合特性，可以应用于全自动的CL免疫分析，也可用于核酸的纯化和分析。

生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer）

最近，人们把注意力集中到了活细胞的共振能量转移（RET，resonance energy transfer）技术上。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质－蛋白质之间的相互作用。这些技术是建立在能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白的突变体GFP）之间会发生能量转移。例如，在一些海洋生物（如水母Aequorea victoria和海参R. reniformis）中自然发生一种能量转移现象――生物发光共振能量转移。在这个过程中，Renilla的荧光素酶（Rluc）在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光（480nm），能够转移能量到GFP的突变体上[增强的黄色荧光蛋白(EYFP)], 随之后者发出530nm的绿光。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近（<100 A°）的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。因为BRET信

号是一个比率数，不是一个绝对量，它消除了那些因为由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。

图2. 生物发光共振能量转移(BRET)监测蛋白－蛋白互作。

这个方法已成功地应用于活细胞中受体二聚体形成（如胰岛素受体）和受体间相互作用等研究中。BRET也是一种灵敏地检测方法，可以应用于活细胞内转录激活核蛋白相互作用等研究中。

虽然BRET和FRET特别适合于高通量筛选，被使用于药物开发中，但是此技术目前因为关系到供体和受体间的距离障碍，所以还是有一些缺点。

向微型化分析的方向发展

小型化分析设备，如微矩阵和微流装置，已经得到充分的发展，同时不同的，基于传统的小规模分析的方法也得到进一步发展，如微孔板。

微矩阵

通过荧光检测的核酸微矩阵（基因芯片）是已经成熟建立的分析工具，它革命性地推进了基因分析和医学诊断。因为任何类型配体结合的相互作用（如抗原

BL/CL被作为一个检测系统在生物传感器中使用，严格意义上是指作为生物识别系统中的分析装置并与传导装置接触，相关的酶被固定在各种不同形式的装置上。这些系统主要是基于耦连的酶促反应并引发光子的发射。[45，46]

BL/CL 重组全细胞生物传感器

近来，BL生物传感器的研究急速的发展，主要是应用在遗传工程细胞（细菌，酵母或哺乳动物细胞）中，会针对被分析物质反应产生BL信号。在细胞中引入报告基因融合到一个调控DNA序列后，并在被分析物存在的情况下被激活及紧密调控，如图Figure 1a所示。基于细胞的检测方法的一个重要特性是其可以经得起自动化高通量筛选的检验。

目前已有多种BL全细胞生物传感器用来进行环境监测（如表2）。它们可以检测多种普通的胁迫条件，有毒物质，氧化剂，金属和组织寄生物[47]，和一些可以激活报告基因的分子（例如，内分泌活性物质或者多卤化芳香碳氢化合物）[48] 或其他细胞物质（例如，海藻生体毒素）[48]。全细胞生物传感器可以检测污染物中生物片段（例如，片段可以进入活体细胞并激活特定的反应途径），可以获得以其它分析技术很难获得的环境和毒物学的相关信息。基于BL重组全细胞的检测方法同样可以应用到药物筛选中，可以检测待筛选药物与药物靶点的特异性结合。例如，通过监测报告基因的激活状态可以评估激动剂和对抗剂。这些检测方法为功能性检测，可以在一定的生物学背景中测量待筛选药物在特定胞内途径中的作用，而不是获得简单的结合证据。

同一细胞内可以使用两个报告基因可以单独表达并单独检测。例如，一个生物传感器可以同时检测氧化和基因毒性的损害[49]。我们还研究出一个带有内

部反应校正系统的荧光双报告基因生物传感器[50]。两个荧光报告蛋白使用不同的发射光谱。一个报告基因提供了分析信号，而第二个则被用做内参照物。任何以后表达水平的修饰都可以检测生物传感器反应和分析信号校正的非特异性变化。这与环境样品分析显著相关，而环境样品分析正以其影响细胞活性的复杂和多变的基质组成而著称。虽然可以设想其应用前景，但在同一细胞使用两个报告基因的研究目前还很少被报道。

表2. 几种使用萤火虫或细菌荧光素酶基因作为报告基因的重组细胞的生物检测方法 免疫检测

BL/CL已经广泛的应用到免疫检测中进行标记物的超灵敏检测。CL免疫检测不但可以通过以CL分子直接标记抗原或抗体，也可以以CL底物标记可被检测的酶。现在，80%的常规临床分析的免疫检测都是使用酶标记。相比同位素检测，CL检测以其更加灵敏和可检测性获得越来越多的应用。依赖于碱性磷酸酯酶（AP）的CL检测和依赖于辣根过氧化物酶的增强性CL检测是最常用的形式。BL反应也已经被证明是检测酶标记的极为灵敏的方法，依赖于萤火虫荧光素酶热稳定突变体标记的醋酸激酶BL检测可以得到极低的检测极限(8.5x10-23 mol)

作为一种新的生物技术工具，BL/CL免疫检测具有一个光明的前景。BL免疫检测中利用发光蛋白（例如，重组水母蛋白）[52]或者一个编码萤火虫荧光素酶基因片段作为标记[53]。多种双功能生物发光分子已经被准备应用到免疫检测中。例如：通过BL蛋白与生物素蛋白受体多肽融合获得的热稳定萤火虫荧

光素酶-生物素复合体[11]；化学抗体与一个特异性抗体和BL标记[12]；通过一个BL蛋白或者一个合适进行CL检测的酶与被检测蛋白或多肽的融合，从而获得BL/CL tracer进行竞争性免疫检测[54，55]。随后的方法将比传统的化学结合的方法更为方便。

这些方法中分析物：标记物恒定1：1的摩尔比非常适合与研发超灵敏的检测方法。融合蛋白已经被用于基于BRET的开放式三明治式BL免疫检测（OS-BLIA），此方法以被证明比基于FRET的检测方法更为灵敏[56]。这种方法是依赖于抗原的抗体重链和轻链的重聚，其分别与Rluc或EYFP融合。 CL 和 BL现在已经越来越多的在蛋白分析的western杂交中使用。例如球蛋白（显性）印迹检测[57]和利用免疫印迹检测牙龈缝流体中伴放线放线杆菌的IgG抗体亚型[58]。

其他各种“闪亮”的生物技术应用

生物处理

可以使用BL作为一个内部参照进行在线持续监测发酵过程。先将BL报告基因引入包含有发酵产物基因的质粒中，再将在线发光检测装置整合到自动发酵系统中，从而可以精确的追踪发酵产物的形成过程[59]。而且，通过引入发光报告基因，可以在工业处理中评估细菌的状态，例如在化学制品批量生产和地下水污染退化(生物治疗)应用中。

酶抑制剂筛选

一种BL检测方法可以用来检测蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一个最优的自然蛋白酶酶切位点)被固化在微孔板空内，作为HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解键后从固态上释放出水母蛋白，从而增加了BL信号[61]。这个系统可以通过在BL融合蛋白中引入特定的酶切位点而针对不同蛋白酶进行抑制剂筛选。

核酸检测

基于CL的检测（例如，AP发光底物1，2-二恶二酮和HRP发光增强性CL底物）仍然对各种DNA诊断技术产生重要的影响。通过与地高辛-地高辛抗体或生物素-链酶素标记结合的基因探针杂交检测越来越多的应用到病毒DNA检测中。多重PCR扩增技术已经用来检测沙眼衣原体、Neisseria

gonorrhoeae, Ureaplasmaurealyticumand Mycoplasma genitalium in urine specimens，其检测限度达到1-10 x 10-15 g DNA [62]。PCR与CL检测也被共同用来评估脐带血的母细胞污染[63]。一种核酸测序方法则是基于焦磷酸盐的释放和CL检测[64]。

场流分级法

场流分级法（FFF）作为一种细胞分拣的新技术，可以从复杂的自然基质中分离几少的特异性的活细胞[65]。FFF的诊断应用需要极为灵敏的BL/CL检测[66]。其进一步的应用还包括：同时分离发光细胞或通过遗传工程或使用BL/CL示踪物与细胞膜特异性结合而发光的细胞。

结束语

BL/CL检测已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，适用于多种应用。现在，在很多生物技术领域，BL/CL已经作为一个优秀的基本检测原理得到应用，包括：报告基因技术，基因探针检测。当然，BL/CL技术还可以针对各种医学、制药和环境的目标分析物进行超灵敏检测，正好与目前高通量分析仪器的小型化，生物分析等趋势相吻合。新的BL/CL应用，例如BRET，基因融合，重组全细胞生物传感器和提内全动物成像等等也变得越来越普遍。 伴随着他们这些显著的优点，BL/CL技术同样也有一些缺陷。从实践的观点来看，BL/CL技术与传统的分光光度测定和荧光技术相比，更容易基质的影响。当然，BL/CL检测中的化学反应会被基质中的成分影响（通常是淬灭）。此外，酶或发光蛋白也和CL底物一样，相对荧光分子不稳定。另一个限制因素是，相比分光光度和荧光测量的仪器，BL/CL检测的仪器通常的实验室中此类仪器比较少，特别是需要高灵敏度检测时，所需要的仪器通常非常贵。

随着新的生物技术工具的不断产生，BL/CL将进一步得到发展。其中一部分是对新的BL报告基因的发现、克隆和测序，进而推动多重标记系统的研究。另一部分，分子、突变体或者组织发射红光或近红外光谱，连同具有更高光子效率的CL系统，会成为有力的工具。伴随着小型化、高分辨率、超灵敏度，可同时检测不同发光探针的彩色CCD等技术在检测仪器上的应用，BL/CL应用技术将得到进一步发展。BL/CL结合上其他的发光反应，例如荧光和热发光或photoacustic发光可以进行更为有趣的应用。

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