基因工程原理

基因工程原理

内容提要

1. 基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括

“切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

2. 基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。 3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为

三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。

4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中

使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。

5. 载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，

在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。

6. DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。粘性末端

连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列), 加到载体或外源DNA的分子上, 然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。

7. 基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆

片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息。

8. DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变

其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-20），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。 9. 重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。

10. 基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大

批生物技术产业。

基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。 基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。 基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。

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第一节 基因工程技术的诞生

基因工程又称基因操作(gene manipulation), 重组DNA(recombinant DNA)技术, 是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。

一、基因工程技术的诞生 1972年，P.. Berg等在PNAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法: 含有λ噬菌体基因和 E.coli 半乳糖操纵子的环状 SV40DNA”，标志着基因工程技术的诞生。 SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450的球形病毒，分子量为28×106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对，编码三个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和一个T抗原。SV40DNA上有一个限制性内切酶E.coRⅠ的切点。 Berg等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA(图3-1)。

图3-1 重组的SV40二聚体的构建(引自 Berg et. al,1972)

当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小。 当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从 λdvgal DNA中制备含有 E.coli 的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。 Berg等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来，为此他获得了1980年诺贝尔化学奖。

二、基因操作的基本过程 和特点 基因工程的操作可用图3-2表示∶

图3-2 基因工程的基本过程(引自Old & Primrose,1980)

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它所涉及的过程可用“分(合成)、 切、连、转、选、鉴”六个字表示。

分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。 切∶即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。

连∶即在体外将不同来源的DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。

转∶即将重组连接的DNA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达。 选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；

鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定，因为有些重组体并非是所需要的，必需通过分析鉴定。

基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，构建在生物体内难以进行的重组，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。

第二节 限制性内切核酸酶

外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给DNA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。 一、限制性内切核酸酶的发现

1952年Luria、Human在T偶数噬菌体、1953年weigle、Bertani在 λ 噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。

噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。 例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴 定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用(host—Controlled restriction)。

用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此，乃是通过稍 为宿主控制的修饰作用(host-controlled modification)。

因此，限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制。修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如甲基化)，经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。 到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restriction—modification system． R-M system)。该系统中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。

1968年，Meselson从E．coli K株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从 E．coli B株中分离到限制酶EcoB。遗憾的是，由于EcoK和EcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割 DNA，这个酶后来命名为HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DNA片段就具有特别的意义。 二、限制性内切核酸酶的命名和分类 （一）限制性内切核酸酶的命名

按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith 和Nathans对内切酶的命名提出建议，1980年，Roberts对限制性酶的命名进行分类和系统化。

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限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名 + 株名的个一个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命名要点列于表3-1。

表3-1 限制性内切核酸酶的命名要点 条目 要点 基本原则 3-4个字母组成, 方式是:属名+种名+株名+序号 首字母 取属名的第一个字母, 且大写 第二字母 取种名的第一个字母, 小写 第三字母 ①取种名的第二个字母, 小写; ②若种名有词头, 且已命名过内切酶, 则取词头后的第一字母代替 第四字母 若有株名, 株名则作为第四字母, 是否大小写, 根据原来的情况而定

顺序号 若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶, 则按先后顺序冠以I、II、III,.....等 如: EcoK: Escherichia coli K (大肠杆菌K株)

（二） 限制性内切核酸酶的分类

限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。 1. I类限制性内切核酸酶

I类限制性内切核酸酶的分子量较大, 一般在30万道尔顿以上, 通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD)，M(62kD)和S(55kD)三种亚基组成的复合酶，这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为449kD,共5个亚基，其中R亚基和M亚基各两分子。 Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶, 同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPase的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要Mg++作辅助因子外, 还要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列，大约15个碱基对。

Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别DNA分子, 并能同DNA分子作用, 因其识别DNA后, 要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA(图3-3), 所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。

图3-3 I类酶的作用方式 (引自Lewin,1997)

2. Ⅲ类限制性内切核酸酶

Ⅲ类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于Ⅰ类酶, 作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoP1是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰。另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。

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图3-4 Ⅲ类限制性内切核酸酶(引自Lewin,1997) 3. Ⅱ类限制性内切核酸酶

这类酶的分子量较小. 一般在2-4万道尔顿, 通常由2-4个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求, 而且对更远的碱基也有要求, 因此, Ⅱ类酶既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割。切割的方式有平切和交错切, 产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系, 第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。

三. Ⅱ类限制性内切核酸酶的性质

1. 识别序列的特异性

在3类限制性内切核酸酶中，Ⅱ类限制性内切核酸酶的特异性最强。

大多数Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的序列是回文序列。如BamHI和BglI都是识别六个碱基的DNA序列(图3-5)，都是完全的回文序列。这段序列有两个基本的特征，第一是能够中在间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5’到3’的序列组成相同，即将一条链旋转1800，则两条链重叠。

图3-5 Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的回文序列（引自D.Voet & Vote J.G.1995） 2. 限制性内切核酸酶的切割频率与速度

切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率，理论上应为1/4n，n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点(1/44=1/256)，识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。

实际上因DNA的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有GC倾向,所以实际的频率偏低。如同是识别6个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大∶EcoRI 4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:200。 根据限制性内切酶切割DNA所产生的产物末端，发现限制性内切酶对DNA的切割有两种方式，即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样产生的末端就是平末端。交错切就是限制性内切酶在DNA双链的不同位置切割DNA，产生的DNA片段的末端不是平齐的(图3-6)。

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图3-6 平末端与黏性末端(Hartl,1991)

Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。粘性末端是指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生的三种不同类型的末端(表3-3)。 表 3-3 某些限制性内切酶及产生的末端 5'-粘性末端 酶 Taq I

T/CGA

3'粘性末端 Pst I CTGCA/G

平末端

识别序列 AG/CT CG/CG GA/TC GG/CC CAG/CTG CCC/GGC GCC/GGC GTT/AAC TCG/CGA TGG/CCA TGC/GCA TTT/AAA GAT/ATC

识别序列 酶

识别序列 酶

Alu I FnuDⅡ Dpn I Hae Ⅲ Pvu Ⅱ Sma I Nae I Hpa I Nru I Bal I Mst I Mha Ⅲ EcoRⅤ

Cla I AT/CGAT Mbo I /GATC BglⅡ A/GATCT BamHI G/GATCC Bcl I T/GATCA HindⅢ A/AGCTT Nco I C/CATGG Xma I C/CCGGG Xho I C/TCGAG EcoR I G/AATTC Sal I G/TCGAC Xba I T/CTAGA

Sac I GAGCT/C Sph I GCATG/C Bde I GGCGC/C Apa I GGGCC/C Kpn I GGTAC/C

基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其他一些工具酶包括连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。其中最重要的是连接酶。

第三节 基因工程载体

载体(vector, vehicle) 的本意就是媒介体，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，称为克隆载体。基因工程中有三种主要类型的载体∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，其中质粒DNA是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体DNA的结合体，运载能力最高(图3-7)。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。

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图3-7 三种类型的载体(引自Greene,1998 )

一、质粒载体

质粒(plasmid)是染色体以外的遗传物质，它是双链闭合环状DNA分子，其大小可从1kb到200kb左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制。质粒是基因工程的主要载体。 (一)质粒概念

1946—1947年间，Lederberg和Tatum发现了细菌的接合现象，这是细菌的有性繁殖方式。 此后不久，便弄清了这种接合是两种不同的交配型(接合型)，遗传信息总是从供体(雄性)转移到 受体(雌性)。当两种不同的交配型的细菌相互识别和接合以后，雄性细胞的致育因子，通过细胞的表面结构传递到雌性细胞，这种致育因子后来称为F因子。 1952年，Lederberg指出，细菌的F因子与高等生物细胞质中染色体外的遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体的遗传单元。

一般来讲，质粒是细胞中能够独立复制的复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒对细胞的生存没有影响，但质粒DNA上也有一些编码基因，赋予宿主细胞一些特性。 自发现能赋予细菌性别特征的F因子以后，又在大肠杆菌中发现了一种能够编码抗菌物质——大肠杆菌素的Col质粒，包括ColB，ColV，ColE等。由这些因子产生的抗菌物质称细菌素(bacleriocin)，是细菌所合成的一种蛋白质，对于同种或近缘种具有毒性。合成细菌素的能力和对于细菌素的抗性，都由染色体外的遗传因子所控制。

在1959一1960年间，日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时，发现病原菌志贺氏 菌含有使其同时能抗几种抗生素的基因，而且，这种抗药性基因能以和F因子非常相似的方式 转移给其他肠道细菌，这就是抗药因子(R因子)。抗药因子(resistance factor)实际上是控制细菌抗药性的一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两部分组成。每个抗药因子上常具有几个抗药性基因。

（二）质粒DNA的基本性质

大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子。如果两条链都是完整的环，这种质粒DNA分子称为共价闭合环状

DNA(covalently closed circular, CCC DNA)。CCC DNA有两种构型，超螺旋DNA( supercolied DNA，SC DNA)和

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松弛的DNA(Relaxed DNA),分别是由DNA促旋酶(DNA gyrase) 和拓朴异构酶(topoisomerase)作用的结果。如果质粒DNA中有一条链是不完整的，那么这种DNA分子就称为开环的(open circles,OC DNA)，开环的DNA通常是由内切酶或机械剪切造成的图3-8)。从细胞中分离质粒DNA时，质粒DNA常常会转变成超螺旋的构型。

图3-8 质粒DNA的三种构型(引自Old & Primrose,1980) 溴化乙啶(ethidium bromide，EtBr)是一种扁平的分子，能够插入到DNA分子的碱基对之间，引起双螺旋的部分解旋，从而改变了DNA的体积和密度。

图3-9 相对分子质量相同构型 不同的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 （引自 Old & Primrose, 1980）

由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，CCC DNA的泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中(图3-9)，所以很容易通过凝胶电泳和EB染色的方法将不同构型的DNA分别开来。

（三） 质粒分类

根据质粒的拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同,

松弛型质粒(relaxed plasmid)的复制只受本身的遗传结构的控制，

而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数。通常可达10—15个/每染色体。并且可以在氯霉素作用下进行扩增，有的质粒扩增后，可达到3000/每染色体(ColE1, 可由24个达到1000至3000个)。这类质粒多半是分子量较小, 不具传递能力的质粒。基因工程中使用的多是松弛型质粒。

严紧型质粒(stringent plasmid)在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有1—2个/每染色体。这种质粒一般不能用氯霉素进行扩增。 严紧型质粒多数是具有自我传递能力的大质粒。质粒的复制特性是受复制子控制的。 基因工程中使用的质粒多数是松弛性质粒载体。 （四）载体的条件

就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分(图3-10)∶复制区，含有复制起点；选择标记，主要是抗性基因；克隆位点，便于外源DNA的插入。

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就复制特性来讲，要求载体必需有独立的复制起点, 最好是松弛型复制，这样便于得到大量的拷贝。有时需要有多个复制起点，能够在不同的宿主细胞中复制，扩大宿主范围。

具有合适的克隆位点, 便于外源DNA的插入。克隆位点实际上限制性酶切位点，最好是具有多种限制性内切酶的单切点，这样适应性强，克隆方便，如果一种酶在载体上有多个切点，就会限制该切点的使用。

具有可检测的选择标记, 也是一个重要的基本条件，这种选择标记最好是能够赋予宿主易于检测的表型。选择标记就是常说的报告基因(report genes)，包括抗生素抗性标记，以及一些生化表型的标记。

另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量，因为小分子的质粒DNA易于操作，不容易被损伤，也容易被分离纯化。一般说小分子量的质粒分子的拷贝数比较高，酶切位点也少。

图3-10 质粒载体的基本结构 二、杂合载体

除了质粒载体外，噬菌体的DNA也可作为载体，不过都是改造过的，自然病毒的DNA不能作为载体。目前在基因工程中使用的载体大多是质粒和噬菌体的杂合载体。 （一）柯斯质粒(cosmid)载体

cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的缩写, 本意是带有粘性末端位点的质粒, 因此, 柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记, 加上λ的cos位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆(图3-11)。

图3-11 柯斯质粒载体克隆(引自Lodish et al,1986)

早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，后来进行了一些改进，克服了这些不足。

柯斯质粒具有如下特点:

1. 具有质粒复制子。目前构建的柯斯

质粒大多具有pMB1复制子或ColE1复制子, 所以进入寄主细胞后能够象质粒一样进行复制, 并且能够被氯霉素扩增。

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2. 具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。如果在这些标记中有克隆位点的话可用插入失活法进行筛选。

例如上面构建的MuA-3就具有四环素抗性基因。 3. 具有λ噬菌体的包装和转导特性。由于柯斯质粒具有λDNA的cos位点和相应的包装序列, 因此在克隆了

适当大小的外源DNA以后可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒, 并能进行转染。转导的能力比纯的质粒大3个数量级。进入寄主细胞后, 又可以自我环化。但它不能同寄主的染色体DNA整合, 也不会产生子代噬菌体裂解寄主。

4. 溶载能力大。这是柯斯质粒的最大优点。被克隆的DNA大小具有上限和下限, 这是因为柯斯质粒最后是被

包装到噬菌体颗粒, 它的最后大小应在噬菌体基因组的75%-105%之间。由于载体分子一般在5kb左右, 所以克隆的最大片段在45kb;如果载体的分子量为15kb的话, 克隆的最小片段为19kb。因此柯斯质粒适合构建真核生物的基因库, 而不适合克隆原核生物的基因。

（二）pUC载体系列的构建

美国加州大学的Vieira和Messing利用pBR322和M13载体的优点，构建了一个更小的载体，称为 pUC7（图3-12），并在此基础上发展了pUC载体系列。

图3-12 pUC载体的构建(引自Winnacker,1987)

pUC载体具有很多优点∶①多克隆位点；②松弛复制；③有氨苄青酶素抗性；④可通过化学显色筛选。

现在最常用的pUC载体是pUC18(图3-13),它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增。

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图3-13 pUC18质粒载体图谱 二、基因文库技术 基因文库(Gene Library)是指在一种载体群体中, 随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段, 理想地包含着该物种的全部遗传信息(图3-18)。因此, 基因文库是人工构建的某一生物基因的“活期储蓄所”, 根据构建方法的不同,分为基因组文库、cDNA文库等。根据基因库的含量,又分为全库和特异性的库,全库含有某一生物的全部遗传信息,而特异性的库是不完整的,如差示库。早期将通过构建基因文库来筛选所需克隆的方法称为鸟枪法。

图3-18 基因文库技术（J.J.Greene & Rao V.B.,1998）

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第三节 体外重组

一、体外重组的方法

DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。 1. 粘性末端连接法

粘性末端连接(Cohesive end ligation)是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA(图3-14)。粘性末端可由识别回文序列的内切酶所产生, 或是用末端转移酶来制备。 凡是识别回文序列的内切酶切割DNA产生的末端都是粘性末端, 只有用同一种酶切割产生的相同粘性末端才能通过末端单链的碱基配对并在DNA连接酶的作用下进行连接。

图3-14 黏性末端连接法（引自 Snyder & Champness , 1977）

粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法, 酶切片段基本不需作什么处理就可以用于连接, 既经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端, 操作方便。另外,通过粘性末端连接的重组体, 其外源片段很容易回收, 只要用原来的酶切割重组体就可以了。

另外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3-15）。

图3-15 双酶切进行定向重组连接（引自 Snyder & Champness , 1977）

平末端连接(blunt end ligation)是指在T4 DNA连接酶的作用下(可加入适量的RNA连接酶), 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。

平末端连接的效率比粘性末端连接的效率低得多,所以通常在连接反应体系中要适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂,以提高平末端DNA连接的效率。常用的是PEG8000, 加入后, 可以起到两个作用: 一是可将平末端连接的效率提高

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1-3个数量级; 二是改变连接产物的分布, 抑制分子内的连接, 促进分子间的连接, 得到的连接产物主要是重组体。

平末端连接的不利之处是连接效率低, 需要大量的连接酶, 有时为了提高连接效率, 通常要补加RNA连接酶。连接后, 缘由的限制性内切酶内切酶的切点要消失, 所以不易回收插入的外源DNA片段。 3. 同聚物加尾法

所谓同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16）。

同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法, 具有很多优点:①首先不易自身环化,这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的, 所以不存在自身环化。②因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端, 所以连接效率较高。③用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 所以是一种通用的体外重组的方法。

图3-16 同聚物尾连接法(引自Old & Primrose,1980) 1. 基因组DNA文库

所谓基因组文库(genomic DNA Library), 就是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或柯斯质粒作为载体, 包括下列过程(图3-19): ①高分子量染色体DNA的制备, ② 体外重组连接, ③ 包装蛋白的制备, ④重组体的体外包装, ⑤将重组DNA导入寄主细胞, ⑥筛选。建造基因组文库不仅可以大量扩增含量极少的单拷贝的结构基因, 也可以克隆调控基因, 有利于研究基因的结构、功能和调控机理。

基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在行有性生殖的某一群体中, 能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中, 由于使用的载体不同, 分为噬菌体载体和柯斯质粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库。

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图3-19 基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996) 2. cDNA文库

同mRNA互补的DNA称为cDNA。mRNA为模板合成的cDNA可以用于基因的克隆化, 也可用这种方法制备特异性的杂交探针。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板, 在无细胞系统中, 在反向转录酶的作用下, 首先合成一互补的DNA, 即第一链, 破坏RMA模板后, 再以第一链为模板合成第二链, 得到的双链DNA称为cDNA基因。选用适合的载体, 将合成的cDNA基因重组导入寄主细胞, 经筛选得到的cDNA基因的克隆群称为cDNA文库( completement DNA Library) (图3-20)。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因, 因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。

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图3-20 cDNA文库构建(引自Old & Primrose,1980)

由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的,具有发育的阶段性和时间性,有些则需要特殊的环境条件。所以,cDNA文库是不可能构建得十分全,也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。所以在构建cDNA文库时应根据研究目的的不同而选用不同的生物材料作为RNA分离的出发材料,有些甚至要经过特殊的诱导处理以提高所需DNA的丰度。

第五节 重组DNA的转移、筛选与鉴定

转化是基因工程操作中一项十分重要的工作。DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化(transformation)。

重组体的筛选有两层涵义,一是将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来,二是将将携带有特定外源插入片段的重组体挑选出来。鉴定则是对筛选的重组体进行最后的鉴别。 一、重组DNA的转化

能够接受转化作用的细菌的生理状态叫感受态。细菌的感受态是在适当的生长条件下获得的一种生理特征。要强调的是: 感受态是有关转化因子被吸收的生理状态, 而不是有关转化因子进入细胞后能否被接受的生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。 在自然条件下, 大多数类型的细菌不出现感受态，也不发生转化。然而可以通过某些化学诱导的方法来制备感受态，用这种方法得到的感受态就称为人工诱导的感受态细胞。目前常用的诱导感受态转化的方法是CaCl2 法（图3-21），此外也可以用基因枪等方法转化外源DNA。

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图3-21 钙诱导的转化

二、重组体的遗传学筛选法

所谓遗传学方法(genetic selection)主要是根据受体细胞接受了重组DNA分子后所发生的遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬菌斑的变化等。这些表型的变化, 有些是载体提供的表型特征, 有些则是插入序列提供的表型特征。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化, 用于选择的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等, 由于这些方法都是直接从平板上筛选,所以又称为平板筛选法。

（一） 插入失活筛选法

从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation) 。

图3-22 插入失活的原理

图3-23 聚合酶链反应

（引自 Watson et al, 1992） 1.抗性基因插入失活筛选法

根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长(图3-22)。

2. 蓝白斑筛选法

根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增

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加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。 这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体); 非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。

显色反应筛选方法比较简单, 但是β-半乳糖苷酶的合成需要诱导。实验中起诱导作用的是安慰诱导物--IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷), 作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。通常是将X-gal和IPTG混合后, 涂布在固体平板的表面。 (二) PCR法

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增特定DNA序列 的新技术，这种DNA的体外扩增是通过同 DNA双链互补的两个引物在DNA聚合酶 的作用下，进行引物延伸来完成的。在反应系统中，需要有：①模板(含有特定序列的 DNA分子)。②两个寡聚核苷酸引物，这 两个引物可同双链DNA分子的互补链杂交，并且位于靶DNA欲扩增区的两侧。 ③耐热DNA聚合酶。④4种脱氧核糖单核苷酸。然后经过不同温度的循环进行DNA扩增(图3—23)。这一技术是Kary Mullis在1985年发明的，并于1993年获得诺贝尔化学奖。 PCR应用十分广泛，并且可通过菌液PcR进行重组克隆的快速筛选。基本方法是从抗性平板上挑取单菌落接种至250 μL的LB培养基中，200r/min 振荡培养8h 以后，取1μL菌液进行裂解制备模板进行PCR筛选。

（三）核酸杂交筛选法

核酸杂交又叫分子杂交(molecular hybridization), 是鉴定和筛选重组体的一种方法。原理是: 两条具有碱基互补序列的DNA分子变性后, 在溶液中一起进行复性时, 可以形成杂种双链DNA分子。同样, 一条DNA链与之具有互补碱基序列的RNA链在一起复性时, 也能形成双链结构(DNA-RNA杂交体)。杂交包括下列过程: ①DNA的“熔解”, 即变性, 目的是使双螺旋解开成为单链, 这可将DNA溶液的温度升高超过Tm值(解链温度)即可; ②退火, 即DNA的复性, 将加热过的DNA溶液缓慢冷却即可发生。 杂交的双方是待测的核苷酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段, 也可以是未经克隆的基因组DNA或是细胞总RNA。 核酸杂交方法的两个特点是高度特异性及高度灵敏性。 1. 菌落杂交

在大量筛选重组的细菌细胞时, 需要从中寻找出为数极少的含有目的序列的细胞。另外. 在利用插入失活、显色反应等手段得到含重组质粒的细菌细胞后, 还需要证明这些重组质粒是否含所需要的目的序列。若将所得菌落逐个扩大培养, 提取质粒DNA, 然后用Southern杂交法固然可以鉴定重组质粒, 不仅工作量大, 又耗费财力, 用菌落杂交(colony hybridization) (图3-24), 就方便得多。

首先要将转化的受体菌在合适的琼脂平板上制成单菌落,然后将菌落复制到硝酸纤维素滤膜上, 保留主平板,将硝酸纤维素滤膜上的菌落进行原位溶菌、原位释放DNA、原位进行DNA变性、中和洗涤后进行原位固定。然后同特异的探针进行杂交,通过放射自显影后,有杂交信号的即为重组体,对照主平板则可将重组体选择出来。

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图3-24 菌落杂交的基本过程(引自Old & Primrose,1980) 2. Southern 杂交

Southern 杂交(Southern hybridization)是1975年Southern建立起来的一种杂交方法, 属固相-液相杂交。该法的主要特点是利用可毛细现象将DNA转移到固体支持物上,称为Southern转移或Southern 印迹(Southern

blotting)。它首先用合适的限制性内切酶将DNA切割后, 进行电泳分离后, 利用干燥的吸水纸产生毛细作用, 使液体经过凝胶, 从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面，然后进行杂交( 图3-25)。

图3-25 Southern 杂交中的DNA转移(引自Alberts et al.2002) 3. Northern 杂交

Northern 杂交(Northern Hybridization)是分析RNA的一种方法,它的基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到尼龙膜等固相膜载体上,用放射性同位素标记的DNA或RNA特异探针对固定于膜上的mRNA进行杂交,洗膜去除非特异性杂交信号,经放射自显影,对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中的迁移位

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置与标准分子量分子进行比较,即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小,对杂交信号的强弱比较, 可以知道该基因表达mRNA的强弱。这一技术应用十分广泛,常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。主要用来检测外源基因在受体细胞中是否转录成RNA。

Northern 印迹的原理同Southern 印迹。但有两点不同: 其一是转移的对象不同, Northern 印迹是将RNA变性及电泳分离后, 将其转移到固相支持物上的过程。其二, 虽然RNA电泳前不需向DNA那样进行酶切, 但也需要变性。不过变性方法是不同的, 它不能用碱变性, 因为碱变性会导致RNA的水解。

Northern杂交与Southern杂交的主要区别是在变性剂存在下, 用琼脂糖进行电泳分离RNA。变性剂的作用是防止RNA的二级结构发夹环的形成, 保持其单链线性状态。

第六节 生物技术及应用

基因工程技术的发展推动了生物技术(biotec}lnokogy)的发展，现代生物技术作为一门综合性的学科，与现代微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学和化学工程等多学科密切相关。生物技术产业从20世纪80年代开始起步，经过20年的发展，目前在农牧业、食品、医药等领域得到广泛的应用。生物技术产业市场逐渐形成，其前景广阔，将成为21世纪经济的支柱产业。

(一) 细胞工程

细胞工程(cell engineering)是利用细胞的全能性，在细胞或细胞器水平上改变细胞的某些遗传特性，以改良其性状、获得有用基因产物或加速细胞及生物体繁殖的综合技术，可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，是以细胞培养技术为基础，通过细胞融合、细胞核移植、动物克隆、染色体工程和生物反应器来实现。 1．细胞融合

细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交(somatic hybridization)，是指两个不同来源的细胞， 彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，打破远缘生物不能杂交的屏障，形成新物种或新品种的技术。1975年，英国剑桥大学的科学家科莱尔(G．Kohler)和米尔斯坦(C．Milstein)用细胞融合技术将能分泌抗体的B淋巴细胞(绵羊红细胞、免疫小鼠脾细胞)与具有无限生长能力的肿瘤细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合，得到了既能持续产生单一抗体又能在体 外无限繁殖的杂合细胞(杂交瘤细胞，hybridoma cell)(图3—26)，通过细胞培养将杂合细胞克隆为单纯的细胞系(单克隆系)，由此类细胞系可获得结构和特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。这一技术的创立在生物医学领域取得重大突破，两位科学家因而荣获1984年诺贝尔生理医学奖。

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图3—26 利用细胞融合技术制备单克隆抗体 (引自Kuby，1994)

如今这种细胞融合技术已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。虽然目前动物的杂交细胞还只停留在分裂传代的水平，不能分化 发育成完整的个体，但在理论研究和基因定位上都有重大意义。而植物间的细胞融合所得到的杂交细胞，获得了新的杂交植物，如西红柿与马铃薯细胞融合获得“西红柿马铃薯”，羽衣甘蓝与白菜型油菜细胞融合得到“甘蓝型油菜”等。 2．细胞核移植

细胞核移植是将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的显微操作技术。由于主要遗传物质存在于细胞核内，因而此技术可获得遗传上具同质性状的动物，对动物优良杂交种的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种具有重大意义。1952年，美国科学家布里格斯(R．Briggs)首次利用豹纹蛙卵细胞建立了细胞核移植技术。1981年，瑞士科学家 K．111menses率先对哺乳动物小鼠卵细胞进行核移植获得成功。他将灰鼠的细胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵内，然后再将这一f'Fh黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵细胞体外培养，得到的仔鼠是灰色的，说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。

在细胞核移植技术上发展起来的动物体细胞克隆技术在1997年因克隆羊“多莉”(Dolly)的 诞生而取得了重大突破。英国科学家维尔穆特(I．wilmut)等1997年2月27日在《自然》描述了 “多莉”的克隆过程(图3—27)。他们取出六龄的芬兰多塞特白绵羊母羊的乳腺细胞核，将此核导入苏格兰黑绵羊去核的卵细胞内，待手术完成之后，以相同频率的电脉冲刺激换核卵，让苏格兰 黑绵羊的卵细胞质与芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在体外发育成早期胚胎，然后将胚胎植入另一只母羊的子宫内，产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是体细胞核加去核的卵细胞质，不经两性结合诱导出来的胚胎产生的。“克隆羊”的诞生表明：动物体中执行特殊功能、具有特定形态的所谓高度分化的细胞与受精卵一样具有发育成完整个体的潜在能力。

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图3—27克隆羊“多莉”诞生的过程 (引自Glick & Pasternak，1998)

1998年，日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生；同年，美国科学家用成年鼠的体细胞成功地培育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大学的科学家利用成年鼠体细胞克隆出第一只雄性老鼠；2000年1月，美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名为 “泰特拉”；同年3月，曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。2002年，我国科学家成功克隆出牛和山羊，使我国成为少数掌握体细胞克隆哺乳动物关键技术的国家之一。2003年，美国、意大利等国科学家分别培育出世界上第一匹克隆骡子和克隆马。中国和法国科学家合作首次克隆出大鼠。 (二) 蛋白质工程

蛋白质工程是根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要特性的特殊蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，能更快、更有效地为人类服务。

重组人p干扰素(IFN p)的人工改造是蛋白质工程的一个成功范例。干扰素(interferon)是人体细胞分泌的一种蛋白质，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是人体防御系统的重要组成部分。重组人IFNβ是采用重组DNA技术，克隆人β干扰素基因，构建合成干扰素的基因工程菌，经发酵、提纯、纯化制备而成。其基因工程产物活性为10万U/mg，仅是天然IFN口产物活性的10%。蛋白质结构分析发现，人IFNβ由154个氨基酸组成，在17、41、141位有3个半胱氨酸(Cys)，人体天然产物在41、141间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差，17位 Cys 的巯基参与二硫键，形成无活性的二聚体或寡聚体。由于丝氨酸(Ser)与半胱氨酸在结构上除羟基(-OH)与巯基(-SH)外完全一样，因此将17位Cys点突变为Ser，结果证明人工改造的IFN口产物活性提高100倍，稳定性好于天然产物。 (三) 酶工程 酶工程(enzyme engineering)就是通过对酶的修饰改造，提高酶的催化效率并在某一生物反应器中大规模生产的技术过程，主要包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固 定化、酶反应动力学与反应器、酶的应用等。

酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中(表3—4)。例如，固定化青霉素 酰化酶用于连续裂解青霉素生产；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶连续作用于淀粉，就 可以生产出各类糖浆；利用葡萄糖苷酶可生产出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中的特定蛋白， 软化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生产的嫩肉粉等，都是酶工程的产物。此外，酶工程还用于 农副产品的加工利用。美国利用大豆生产出200余种产品，包括营养食品、药品、食品添加剂等， 例如高纯度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。目前工业生产的酶有60余种，其中规模化生产仅20 余种。

表3—4酶工程的主要应用领域 应用领域 酶 类

主要用途

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淀粉酶类 蛋白酶类 糖化酶 葡萄糖苷酶 凝乳酶 果胶酶 淀粉酶类

纺织工业 纤维素酶

蛋白酶类 蛋白酶类

葡萄糖、麦芽糖生产，啤酒酿造，面包、饼干等, 烘烤食品制作等 嫩肉粉、饼干、蛋白胨、乳酪生产，啤酒澄清，肉类加工(如香肠熟化等) 淀粉液化，糊精降解 低糖啤酒生产 乳酪生产 果酒、果汁去浊 纺织品褪浆

处理纤维制品，提高棉毛纺织品质量 丝制品脱胶处理

加酶洗涤剂、加酶护肤品与化妆品生产

食品工业 葡萄糖异构酶 高果糖浆生产

淀粉酶类 加酶洗涤剂生产 日化工业

超氧化物歧化酶 化妆品生产

糖酐酶

制革工业 蛋白酶类

羟化酶 酪氨酸酶 蛋白酶类

医药工业 天冬酰胺酶

溶菌酶 尿激酶 链激酶 其他多种酶 淀粉酶类 溶菌酶

牙膏添加剂 皮革去毛、软化 氢化可的松生产 多巴(主治帕金森病)生产

氨基酸、蛋白水解液生产，治疗消化不良，消肿，降压等 治疗白血病 消炎，镇痛，止血等 治疗心肌梗死、结膜出血等 治疗血栓性静脉炎、血肿等

多种疾病诊断(如葡萄糖氧化酶诊断糖尿病，胆碱酯酶诊断肝 炎等) 处理造纸工业废水 处理高有机物含量废水

环境监测试剂(如胆碱酯酶监测有机磷农药，硫氰酸酶监测氰

化物等)

青霉素酰化酶 青霉素、头孢霉素生产

葡萄糖脑苷酯酶 治疗高雪病(葡萄糖脑苷酯酶缺乏症)

超氧化物歧化酶 治疗红斑狼疮、皮肌炎、辐射损伤等

环保工业 丁酸梭菌酶系 处理酿酒工业废水

其他多种酶

(四) 发酵工程

发酵工程(fermentation engineering)是利用微生物的特性，通过现代化工程技术，在反应器中生产目的产物或提供所需服务的技术过程。“发酵”一词来源于拉丁语动词 fervere(发泡)，意指利用酵母以果汁或麦芽汁为原料生产酒精饮料时出现的现象。传统的发酵技术有悠久的历史，早在几千年前人类就利用有益的微生物生产食品和药物，如酒、醋、酱、奶酪等。现代发酵工程是在传统发酵工艺基础上结合基因工程、细胞工程、酶工程等现代高新技术发展而成，由于其主要以微生物培养为主，因而也称微生物工程。

发酵工程由3部分组成(图3—28)：上游工程、发酵过程和下游工程。其中上游工程包括优良菌株的选育、最适发酵条件(pH、温度、溶氧和营养组成)的确定、营养物的准备等。发酵过程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。这里要有严格的无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术，在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术，在发酵过程中根据 细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术，还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。

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图3—28发酵工程的基本流程

微生物发酵产品可分为以下几大类：

1. 微生物细胞(生物量)作为产品，如单细胞(酵母)蛋白作为食品或饲料。

2. 微生物代谢物产品，目前医用抗生素、农用抗生素等已有近200个品种，绝大部分都是发酵产品。此外，

发酵产品还包括酒精、氨基酸、柠檬酸和工业用酶等。味精、多种维生素等也是发酵工程的产品。 3. 基因工程产品。微生物(如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和酵母等)是最常用的重组基因的表达系统。主要

产品包括干扰素、胰岛素、牛凝乳酶、G—CSF(粒细胞集落刺激因子)、EPO(红细胞生成素)和 tPA ( 重组组织型纤溶酶原激活剂)等。

(五) 生物医学工程

生物医学工程(biomedical engineering)是综合生物学、医学和工程学的理论和方法而发居 起来的新兴综合学科。生物医学工程开始以仿生学原理制造人工器官，如心脏起搏器、人造心脏、假肢等，以及用于诊疗手段的医学仪器。后来人体器官移植成为医疗中可以选择的手段，但常常要克服异体器官的排斥反应，在用药物能够解决排斥反应之前，人体器官移植成功的例子很少。由于生物技术迅猛发展，在DNA双螺旋结构发现50年后，人类基因组计划已经完成，对人 类基因全面了解后，人们已经将眼光投到干细胞克隆和治疗性克隆(非生殖性克隆)，一些国家如美国建立了胚胎的干细胞系，用于包括治疗性克隆等方面的研究。国外已经成功地从自体鼻窿腔内取出干细胞，导人心脏，去除心脏因炎症等留下的疤痕，恢复了心脏的正常功能，以及用血液中的干细胞修复因车祸等造成四肢瘫痪患者的脊髓神经，使他们重新站立起来。这是因为即便是成人，一些在胚胎时期存在的干细胞仍可以留存在身体的各部分，或者作为专能干细胞，也在人体的器官中，这些干细胞能够在特定的情况下进一步分化为组织。利用自体的干细胞也免除 了异体器官移植糟糕的排斥反应。这种利用人体自身干细胞修复人体受损部分已经成功的例子 以及治疗性克隆的前景，为解除人类的病痛带来了福音。 (六) 生物信息工程

生物信息工程(biological information engineering)可以简单地定义为计算机与信息技术在生命科学中的应用，它是一个年轻和快速发展的领域。生物信息工程运用数学、计算机科学和生 物学来阐明和理解大量生物学研究的实验数据中所包含的生物学意义，包括此类数据的采集、贮存、整理、归档、分析与可视化等。

以人类基因组计划(human genome project，HGP ) 为序幕的生物信息学研究，是全面认识生命及其过程的重要手段，由此引发的生物信息革命，将从根本上改变生命科学和生物产业的思维方式和研究体系。人类基因图谱绘制既是生物学的突破也是计算科学的壮举。在生物学家看来，存在于基因组中的碱基对序列是宝贵的生物信息资源，是未来生物工程产业的支柱。人类 3万～4万个基因的信息以及相应的染色体位置被阐明后，将成为医学和生物医药产业知识和技 术创新的源泉。一些困扰人类健康的主要疾病，例如心脑血管疾病、糖尿病、肝病、癌症、老年痴 呆症等都与基因有关，可以依据已知的基因序列和功能，找出这些基因并针对相应的靶位进行药 物筛选，并设计新药。到2002年底，已有1 500多种致病基因被标记。信息技术有史以来首次 成为推动实验生物学和医学发展的主要动力。这一趋势明显地表现在所有与了解疾病起因、新药开发相关的关键领域中——基因组学、蛋白质组学以及代谢途径的研究等，这些专业的研究需要依靠强大的计算机系统、数据和存储管理系统来完成大量的数据处理工作。而这些对生命的 研究数据将帮助人类解开人体内数以万计蛋白质种类的基因编码秘密。此外，利用生物信息工 程技术建立动、植物良种及相关有用基因数据库将有助于各种家畜、作物的基因改良。

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四、转基因动物

图3—30转基因鼠 (引自Griffiths et al，1999)

传统的家畜改良主要是通过多代选择性交配改良饲养动物的遗传性状，如产奶、羊毛品质、 生长速度和产蛋率等。在每一轮连续世代中，那些具有优越性状的动物可作为选育良种。这种 交配、选育的方式虽然费时、费力，但却很成功，现今几乎所有的家畜都经过这种改良。但是这种 方法不能将单一的功能基因或基因簇引入高等动物的染色体DNA上。

经过20世纪80年代不懈的努力，借助于受精卵原核显微注射和早期胚胎细胞的反转录病 毒感染等手段，将基因导入受精卵产生新

品种的设想已成为现实。动物转基因技术迅速成为研 究哺乳动物基因表达和发育的有效手段，在建立研究人类疾病的动物模式系统中发挥着作用，还 可以使动物的乳腺分泌含有药用蛋白的乳汁，因而出现了“乳腺生物反应器”。

转基因技术在小鼠的研究中发展得较为成熟(图3—30)。20世纪80年代以来，已经将几百种基因导入不同的品系中。这些研究使人们对基因调控、肿瘤发生、免疫专一性、发育的分子遗 传学及其他一些基本的生物活动过程有了更多的了解。转基因小鼠还可作为人类治疗药物的检测动物，不同的转基因品系可作为研究人类遗传疾病的生物医学模型。

(一) 基因导入动物的方法

在转基因中，DNA可通过3种方式导入：①反转录病毒介导感染早期胚胎细胞，然后植入 雌性动物体内。②显微注射到受精卵内膨大的精核(雄性原核)中。③基因工程处理胚胎干细胞，导入一个早期发育胚胎后再植入雌性动物体内。

1．反转录病毒载体法

图3—31显微注射法进行动物转基因的基本过程 (引自Glick & Pasternak，1998) 在各种基因转移方法中，反转录病毒作为载体能够有效地使转移基因整合到受体细胞基因组中。但是，这类载体只能携带小片段(约8 kb)DNA，因为长度的限制，这些转移基因可能缺少关键的相邻调控序列。

使用病毒载体有一个最主要的缺陷， 虽然这些载体被设计为复制缺陷型，但是用于制备大量载体DNA的病毒株的基因 组可同样进入细胞核。除非采取特殊的预防措施，这些辅助病毒会在转基因个体中复制、产生。无论是直接将转基因个体作 为食品，还是利用其产物，都应绝对避免病毒的污染，所以，反转录病毒介导法很少用于生产经济用途的转基因动物。 2．DNA显微注射法

由于反转录病毒介导法的不足，显微注射DNA成为产生转基因小鼠的首选方法。 整个过程包括3个主要步骤(图3—31)： ①刺激供体雌性鼠超量排卵，以产生足够的受精卵用于注射。首先注射孕马血 清，约48 h后再注射人绒毛膜促性腺激素，一只超量排卵的小鼠可产生大约35颗 卵，而不是通常的5～10颗卵。 ②雌鼠经过交配，受精卵从输卵管中洗出。

③立即对采集的受精卵进行显微注 射。注射的转移基因通常是线性结构，不采用原核生物的载体序列。

整个过程看似简单，但需要一系列实 验步骤的配合，并且成功率最高也只有 5%左右，所以必须对大量的卵进行注射。 例如，

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经注射的卵有66%的成活率，成活的受精卵25%可正常发育，25%的后代携带转移基因，那么，注射1 000个受精卵，才能获得 30～50个转基因后代。并且，DNA在染色体上随机整合，在某些个体中，转移基因由于整合位点 不当而不能表达，在某些个体中因拷贝数高而过度表达，这会干扰动物的正常生理活动。 3．胚胎干细胞法

小鼠胚胎发育卵泡阶段的细胞在培养基中依然保持分化能力。当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞(包括生殖细胞)的能力，这类细胞称多能性胚胎干细胞(ES cell)。 ES细胞在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化的多能性。外源基因通过同源重组可 特异性整合在ES基因组内的一个非必需位点上，构成工程化胚胎干细胞。经体外筛选鉴定、扩大培养后再输回小鼠胚胎胚泡中，最终形成转基因动物(图3—32)。这种方法避免了前两种方法带来的整合随机性。

图3—32胚胎干细胞基因转化法 (引自G1ick & Pasternak，1998) (二) 转基因动物的应用

转基因动物具有广阔的应用前景，目前主要应用于以下几个方面：①利用动物转基因技术 研究基因的表达与功能。②利用转基因动物或细胞生产生物大分子。③ 利用转基因技术进行 动物遗传性状改良的研究。④基因治疗。 1．乳腺生物反应器

由于基因工程技术的出现，人类已可以大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治疗疾病。可以完成这件工作的系统有细菌发酵、真核细胞培养和乳腺生物反应器等3种主要生产方式。在这3种生产方式中，乳腺生物反应器有特殊优点。乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机制，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物(图3—33)。

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图3—33 用转基因绵羊生产重要的医用蛋白质 (引自Waston et al，l 994) 乳腺生物反应器是一项综合技术，发展乳腺生物反应器不仅需要基因工程技术，还需要动物胚胎技术、转基因技术、蛋白质提纯技术和常规畜牧技术。到目前为止，世界各国科学家已经制造出乳腺分泌各种医用蛋白质的牛、山羊、绵羊、猪和家兔，乳腺分泌的蛋白质达到可商业开发水平的转基因动物达十多种。 2．转基因鼠在揭示人类分子病病理中的应用

转基因小鼠可作为研究人类疾病的模式系统，或对某种可能的药物进行检测。完整的动物模式应模拟人类疾病的发生和发展过程，但是，小鼠毕竟不是人类，所以，从转基因模型得到的信息在医学上并不总具有相关性，不过，在研究复杂疾病时，可对致病原因的发现带来突破性进展。现已发展了多种转基因小鼠模型用来研究人类遗传疾病，例如阿尔茨海默病(Alzhaeirner disease)、关节炎(arthritis)、肌肉萎缩症(muscular ddystrophy)、肿瘤发生(tumorigenesis)、高血 压(hypertension)、神经退行性病变失调(neurodegenerative disorder)、内分泌功能异常(endocrinological dysfunction)和冠心病(coronary disease)等。

Alzheimer 病是一种大脑机能退行性失调，表现为精确思维能力和记忆力的持续丧失，伴随性格改变、语言紊乱和身体机能的迟钝。虽然1%的60～65岁人群和30%的80岁以上人群可 能患此病，但该病的临床诊断仍很不足。在患者脑部的新皮质和海马部位，神经元胞体内出现神 经元纤维的缠结，在轴突终端生成密集的胞外聚集物“衰老斑”，脑细胞(神经元)逐渐死亡。在患者脑血管中也发现这种称为“淀粉样小体”的聚集物。

衰老斑与淀粉样小体的基本组分是一种相对分子质量4×103的蛋白Aβ(amyloid β,β-蛋白、β-淀粉样蛋白、β-A4)。组成各种Aβ蛋白的氨基酸残基数目不同，如Aβ40、Aβ42。所有的 Aβ蛋白都是β-淀粉样前体蛋白(APP)自身水解生成的。目前还不知道Aβ积累的原因。在一 些Alzheimer 病高危家族中发现了APP基因的突变，显示APP基因与Alzheimer病有关。因为几乎不可能用人来研究发病机制，所以模拟Alzheimer‘病的动物模型具有不可替代的作用。

人们发现小鼠的某些种系能形成老化斑，而另一些种系则天生不会产生。以后一种系的小鼠为受体，将人APP基因转人其体内，构建相应的转基因鼠模型，以此研究Alzheimer病的分子机制。人缺陷基因在转基因鼠的脑神经元中获得表达，并产生相应的症候群，该病的发病机制遂 得以确立。上述转基因结构包括一个来自脑特异性病毒的启动子以及编码β-淀粉前体蛋白C末端100个氨基酸残基的人基因部分序列。 3．基因治疗

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图3-34 生活在保护罩中的SCID患病儿童 (引自Griffiths et al，1999)

基因治疗(gene therapy) 的基本定义是指将正常基因转入患者特定的靶细胞，取代患者细胞中的缺陷基因，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。 1990年9月14日，美国政府批准了世界上第一项人类基因治疗临床研究方案，对一名患有重度联合免疫缺损症(severe

combined immunodeficiency disease，SCID)的儿童 进行基因治疗并获得成功(图3-34)，从而 开创了医学的新纪元。 产生基因缺陷的原因除了进化障碍因素外，主要包括点突变、缺失、插入和重排等DNA分子畸变事件的发生。如重度

联合免疫缺损症就是因编码腺苷脱氨酶 (adenosine deaminase，ADA)基因发生了突变，导致免疫功能缺陷。SCID患者由于丧失了抗感染能力，只能生活在完全无菌的环境，即保护罩中。这种病目前没有其他办法进行治疗，只能通过基因治疗。

基因治疗包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移4项基本内容。 基因诊断(gene-diagnosis)主要是确定病变基因及其定位。目前已建立起多种病变基因的 诊断和定位方法，如PcR扩增靶序列法、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)、单链构型多态 性分析法(SSCP)等。 基因治疗是用正常的基因取代病变的基因，因此分离获得用于治疗的正常基因十分重要。 这主要借助基因工程的方法进行基因克隆、鉴定，然后再装载到合适的载体上。

要借助基因工程的方法进行基因克隆、鉴定，然后再装载到合适的载体上。 如何将装载的正常基因转移到病变的细胞并能正确地取代病变基因是基因治疗成败的关键。根据治疗基因导入病变细胞的类型不同，基因治疗可分为生殖细胞治疗和体细胞治疗两种方法(图3—35)。将正常基因转入生殖细胞或胚胎细胞，有可能彻底阻断缺陷基因的纵向遗传，但这一方法涉及许多伦理学和法学方面的问题，世界各国都禁止使用。体细胞治疗又分为体内疗法和体外疗法，前者是将正常基因通过载体直接导人患者的病变组织器官中，这种方法比较适合于脏器性分子病的治疗；后者则首先从机体内分离出病变细胞，体外导入正常基因，经鉴定和增殖后再将这种转基因细胞系输回患者体内，这种方法对于流动系统病变(如血液和骨髓等)较为适宜。

图3-35 基因治疗的两种策略 (引自Griffiths et all，1999)

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