用AFLP技术分析四川核桃资源的遗传多样性_陈良华

植物生态学报 2008, 32 (6) 1362~1372 Journal of Plant Ecology (Chinese Version)

用AFLP技术分析四川核桃资源的遗传多样性

陈良华 胡庭兴* 张 帆 李国和

(四川农业大学林学园艺学院, 四川雅安 625014)

摘 要 利用AFLP分子标记技术, 运用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切组合, 选用多态性高、分辨力强的4对选择性扩增引物组合E32/M48、E33/M61、E35/M61、E33/M62分别对四川省3个野生核桃(Juglans regia)种群和1个野生铁核桃(J. sigillata)种群共46个样品进行遗传多样性分析、居群遗传结构分析及种属关系探讨。结果表明: 1)共扩增出244个遗传位点, 其中146个多态位点, 多态率为59.84%; 核桃群体组和铁核桃群体的多态性百分率分别为55.33%和52.05%, 两个物种遗传多态性水平相当; 核桃群体组所检出的位点平均有效等位基因数Ae、Nei’s基因多样度H、平均Shannon信息指数I分别为1.322 9、0.190 8和0.286 3, 而铁核桃群体分别为1.339 9、0.196 1和0.289 8, 铁核桃群体遗传多样性水平略高于核桃群体。2)群体间特异带及群体间共有带占总扩增带数的15.16%, 其中铁核桃群体特异谱带最多, 群体特异谱带揭示了群体间的遗传差异及相似性。3) Shannon信息指数(I)、Nei’s基因多样性指数(H)和分子方差分析(AMOVA)表明核桃遗传多样性在群体间和群体内的分布分别为14.36%和85.64%、12.6%和87.4%、11.07%和88.93%, 表明群体内的遗传多样性大于群体间的遗传多样性; 核桃群体组与铁核桃群体的变异主要存在于群体组内, 组间的遗传变异仅占总变异的9.35%, 两者间的遗传分化系数Gst为0.093 5, 与AMOVA分析结4) 4个群体的Nei’s遗传距离在0.038 2～0.069 2之间, 遗传一致度在0.933 2～0.962 5之间, 表现出较高的遗果一致。

传相似性; 运用Nei’s遗传一致度对供试种群进行了UPGMA聚类, 结果表明核桃的3个群体优先聚类, 大渡河流域AFLP所检测出的结果既是核桃与铁核桃生物学特性的反映, 又是其各自生态学特群体与甘南地区群体聚类最近。

性的反映, 该研究结果对核桃种质资源的保护和育种提供一定的理论依据。 关键词 核桃 铁核桃 AFLP 遗传多样性 种群 遗传结构

GENETIC DIVERSITIES OF FOUR JUGLANS POPULATIONS REVEALED BY AFLP IN SICHUAN PROVINCE, CHINA

CHEN Liang-Hua, HU Ting-Xing*, ZHANG Fan, and LI Guo-He

Forestry and Horticulture College of Sichuan Agricultural University, Yaan, Sichuan 625014, China

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收稿日期: 2007-02-08 接受日期: 2007-06-09

基金项目: 四川省作物育种攻关重点项目林竹新品种选育课题(2006YZGG-10)和四川省林业厅科技先导计划(2005-5) 在实验过程中得到了万雪琴博士的支持, 吴元奇老师对数据分析给予了帮助,在此表示感谢 * 通讯作者 Author for correspondence E-mail: hutx001@ E-mail of the first author: chlhua2001@

Abstract Aims Juglans regia and J. sigillata are important economic nut trees and are widespread in Sichuan Province. Accurate evaluation of genetic persity and relationships between species is essen-tial for effective preservation of germplasm resources and breeding. Traditional methods for assessment of genetic persity in walnut, based on morphological, physiological and biochemical studies such as isozyme analysis or RAPD makers, are sensitive to environment so results are not reliable. AFLP has been applied extensively and effectively in population molecular ecology research and population ge-netic studies. Our aims were to identify genetic structure among populations and to examine genetic re-lationships between the two species.

Methods We compared three wild J. regia populations occurring at Qingba Mountain, Daduhe Valley, and southern Ganzhi District in Sichuan Province, and one wild J. sigillata population at Panzhihua District in southeastern Sichuan Province. We selected 46 samples to analyze by AFLP molecular maker technology using 4 pairs of primer combinations screened.

Important findings We obtained 244 bands including 146 polymorphic bands. The percentage of polymorphic bands (P) was 59.84%. For the J. sigillata population, percentage of polymorphic bands

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lymorphic bands (P) was 59.84%. For the J. sigillata population, percentage of polymorphic bands (P)

was 52.05%, effective number of alleles per locus (Ae) was 1.339 9, and Nei’s gene persity index (H) was 0.196 1, Shannon’s information index (I) was 0.289 8. For J. regia populations at species level, es-timates were P=55.33%, Ae=1.322 9, H=0.190 8, and I=0.286 3. Although these findings showed that genetic persity of J. sigillata was slightly higher than the other species, genetic persity level was generally equivalent. Shannon information index, Nei’s genetic persity coefficient and analysis of molecular variance showed that 85.64%, 87.4%, 88.93% genetic persities, respectively, distributed within populations at the species level. Most variation (80.65%) consistently originated from the interior of groups. The population of J. sigillata possessed the greatest amount of unique bands, accounting for 4.5% of the total amplified bands, which indicated genetic variation between two species. The genetic differentiation coefficient (Gst=0.093 5) between two species is very low. Juglans regia showed high genetic affinity to J. sigillata. Nei’s Genetic distances between populations varied from 0.038 2 to 0.069 2 and genetic similarities ranged from 0.933 2 to 0.962 5, which indicated there were high simi-larities among populations. UPGMA analysis revealed that three J. regia populations clustered first, and genetic distance was closest between the Daduhe Valley and southern Ganzhi District populations.

Juglans regia, Juglans sigillata, AFLP, genetic persity, population, genetic structure Key words walnut,

DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.06.017

核桃(Juglans regia)和铁核桃(J. sigillata)均属于胡桃科核桃属(郗荣庭和张毅萍, 1992), 是我国栽培历史悠久、分布广泛的重要干果和经济树种, 其种仁除含脂肪、蛋白质、碳水化合物外, 还含钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、核黄素和尼克酸等多种成分(高焕章等, 2000), 具有很高的营养价值、药用价值和经济价值。核桃在四川自然分布极为广泛, 遍及全省各地, 同时也是该省的主要经济树种之一; 而四川省地形复杂、气候条件多样, 在生态环境多样性条件下, 核桃经长期的异花授粉和自然选择, 其遗传背景比较复杂。核桃遗传多样性研究是核桃种质资源保护及开发利用的基础, 对当前核桃种质资源的遗传多样性进行准确的评价可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供预见性的指导, 这是关系到育种目标能否成功实现的关键(高翔等, 2002)。准确认识四川省核桃种质资源的遗传多样性及亲缘关系, 对该地区种质资源的分类、人工选育优良品种及杂交育种, 改造核桃低产区具有重要意义。

目前, 分子标记技术在我国核桃遗传多样性及品种鉴定研究中的应用, 主要是运用同功酶(杨自湘和奚声珂, 1989)和RAPD技术来对核桃种群进行地理生态型评价(吴燕民, 2000a)、遗传结构评价(张日清等, 2001; 郭传友等, 2006; 王正加等, 2006)、种属鉴定(吴燕民等, 2000b; 黄坚钦等, 2003; 郝艳宾等, 2006)以及寻找与核桃目标性状

连锁的遗传基因(杨克强等, 2002; 王国安等, 国外分子标记在核桃上的应用主要有品种2004)。

(基因型)鉴定、系谱分析、遗传结构和遗传多样性评价、分子标记辅助育种等方面, 主要包括同功酶(Ninot & Aleta, 2003), RFLPs (Fjellstrom et al., 2002), RAPDs (Nicese et al., 1998; Conner & wood, 2001), ISSRs (Potter et al., 2002), SSRs (Woeste et al., 2002; Dangl et al., 2005; Foroni et al., 2007)和AFLP (Kafkas et al., 2005; Bayazit et al., 2007)等。

由于RAPD分子标记的稳定性差, 且对核桃与铁核桃的种属关系存在着较大的争议, 对于核桃种群和铁核桃种群的研究更是少见, 基于AFLP分子标记技术实验结果稳定可靠, 重复性强, 目前国内并没有应用该分子标记技术研究核桃和铁核桃的遗传多样性, 所以本研究尝试用该技术对四川省野生的核桃种群和铁核桃种群进行种群遗传结构的研究及种属鉴定, 为核桃种质资源的保护和利用及生物分子进化提供理论基础和实验依据。AFLP是一种新近运用于群体分子生态、群体遗传研究的有效方法, 特别是近几年在种群生态、作物品系鉴别、基因定位作图、遗传多样性研究等方面表现出广泛的应用价值(李文英等, 2003)。AFLP是显性和共显性共存的一种标记(彭建营等, 2001), 且按典型的孟德尔方式遗传(孙庆磊等, 2004), 该技术不但具备了其它DNA分子标记, 如RFLP、SSR、RAPD等所具有的优

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点, 而且还具有带纹丰富、DNA用量少、灵敏度高、快速高效、不受环境影响等特点, 一次分析可获得基因组大量的遗传信息, 并表现大量的多态性条带, 特别是对亲缘关系及遗传上区别不大的种类来说是比较合适的分子标记方法。

及大小凉山地区等4个天然种群内的46株优良母树, 母树树龄40～80年。秦巴山与龙门山区采自广元市朝天区、市中区、青川县、平武县、南江县、通江县; 邛崃山系及大渡河流域采自汶川县、茂县、泸定县、小金县、石棉县、汉源县、宝兴县; 甘南地区采自巴塘县、乡城县、九龙县、得荣县; 攀枝花及大小凉山地区采自盐边县、米易县、仁和县、冕宁县、德昌县、盐源县(采样地基本状况见表1)。每个县采收两棵母树的种子各50颗, 母树间的距离在150 m以上, 带回实验室, 于当年10月经沙藏出芽后移入大棚栽植, 以来年核桃实生苗的幼叶作为供试材料。

1 材料与方法

1.1 材料

根据赵安玖等(2004)研究的四川核桃主产区的生态区划, 于2005年9月选取四川核桃主产区秦巴山与龙门山区、邛崃山系及大渡河流域、甘孜州南部地区(甘南地区), 铁核桃主产区攀枝花

表1 供试材料来源及基本气候物征

Table 1 Origin and basic climatic characteristics of the materials in the study

群体名称及编号 Name of the population

and the code 经纬度范围

The range of longitude and lati-tude

海拔高度范围

The range of altitude (m) 采样地及编号

Site of the material and the code 年平均气温

Annual average temperature (℃) 1月平均气温

The average temperature in Janu-ary (℃)

7月平均气温

The average temperature in July (℃) 无霜期

The frost-free period (d) 大于10 ℃积温

Accumulative temperature over 10 ℃degree (℃) 年降水量

Annual precipitation (mm) 日照时数

Annual sunshine time (h) 日照百分率

Annual sunshine percentage (%) 年平均相对湿度

Average annual relative humidity (%)

秦巴山与龙门山区

(核桃群体) Qingba Moutain

(POP1) 108°24′～102°25′ E32°59′～29°92′ N

邛崃山系及大渡河

流域 (核桃群体)

Daduhe vally (POP2) 102°25′～103°89′ E 29°04′～31°67′ N

甘南地区 (核桃群体) Gannan district

(POP3) 99°00′～101°53′ E 28°71′～30°00′ N 2 100～2 869 巴塘县(36, 38)、乡城县(39, 40)、九龙县(41, 42)、得荣县(43, 44)

攀枝花及大小凉山地区

(铁核桃群体) Panzhihua district

(POP4) 101°52′～102°68′ E 26°30′～28°72′ N

976～1 944 盐边县(9, 10), 米易县(11, 12), 仁和区(13, 14), 冕宁县(15, 16), 德昌县(17, 18), 盐源县(19, 20)

507～970 1 440～2 463 朝天区(1, 2), 市中区(3, 4), 青川县(5, 6) 平武县(7, 8), 南江县(45, 46), 通江县(47, 48)

汶川县(21, 22), 茂县(23, 24), 泸定(25, 26), 小金县(27, 28), 石棉县(29, 30, 汉源县(31, 32), 宝兴县(33, 34)

15.7 14.4 11.5 15.9 4.4 4.8 2.9 8.1 25.4 23.1 18.6 22.03 254

268.4 201.2 260.5

4 949.1 4 471.3 3 230.9 5 137.03 1 086.9 683.9 559.4 1 015.3 1 399.8 1 445.4 2 073.6 2 271.6 31.7 32.9 46.8 51.5 73.2 65.1 51.8 64.3

1.2 DNA的提取

采用核沉淀法(总DNA制备法), 方法如下: 采摘10～15株同一母树实生苗幼叶混合样5 g, 放入研钵中, 加入3%的PVP40, 加入液氮, 迅速研

磨成细粉状; 并迅速将粉末转移至10 ml离心管中, 加入30 µl β-巯基乙醇, 混合均匀后于4 ℃冰箱中放置10～30 min。然后4 , ℃5 000 r·min–1离心12 min后, 弃上清液。以后步骤及质量检测参照

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陈静和王文江(2004)的方法进行。将纯度符合要求的DNA样品稀释成250 ng·µl–1, 备用。

AFLP分析反应体系参照李文英等(2003)的方法进行, 从56对AFLP引物中筛选出能获得清晰条带、多态性高、反应稳定的4对引物组合(E32/M48、E33/M61、E35/M61、E33/M62)进行AFLP选择性扩增。扩增产物采用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染法检测, 银染参照Bassam等(1991)方法进行。 1.3 数据分析

AFLP扩增产物以0、1统计, 建立由“0、1”组成的原始数据矩阵。对非常清晰, 在相同迁移位置上有带的记为1, 无带的记为0, 形成二元数据。用POPGENE version 1.32 软件计算以下遗传多样性参数: 1)多态带数AP (Number of polymorphic loci)和多态带百分率P(Percentage of polymorphic loci); 2)等位基因平均数A (Average number of alleles per loci); 3)有效等位基因数Ae (Effective number of alleles per loci); 4) Nei’s基因多样性指数H (Gene persity), Shannon信息指数I (Shan-non’s information index); 5) Nei’s遗传距离D (Ge-netic distances)和遗传一致度IN (Genetic identity), 并采用Nei’s遗传一致度IN进行非加权算术平均聚

类分析(Unweighted pair group with arithmetic av-erage, UPGMA); 6)应用Nei’s (1973)基因多度法计算遗传分化度Gst (The coefficient of gene differen-tiation among populations within species), 其关系式为Gst=Dst/HT, 其中HT =Hs+ Dst, HT为总遗传多样性, Hs为群体内的遗传多样性, Dst为群体间遗传多样性; 7)按照Wright(1951)的方法计算反映基因流强度的群体每代迁移数(Nm), 其关系式为: Fst=1/(1+4 Nm), Nm =(1– Fst)/4 Fst, 在此, Fst值等同于Gst。参照张富民和葛颂(2002)的方法, 利用ＤＣＦＡ1.1软件和AMOVA version 1.55软件进行分子方差分析(AMOVA), 计算反映群体结构及变化的平方和、均方、方差分量以及遗传距离Фst。

2 结果与分析

2.1 供试材料的AFLP扩增结果

本试验采用分辨能力强的4对选择性扩增引物, 分别对供试材料的基因组DNA进行扩增, 共扩增出244条带, 其中多态性条带146条。平均每对引物扩增的总带数为61条, 多态性位点百分率为59.84%(表2)。图1为引物E35/M61对46个样品的扩增结果。

表2 AFLP选择性扩增引物产生的条带多态性

Table 2 Polymorphism of AFLP bands obtained by selective amplification based on the four primer-combinations

引物组合 Primer pairs E32/M48 E33/M61 E35/M61 E33/M62 合计 Total 平均 Average

总条带数

Total number of AFLP bands

74 48 57 65 244 61

带长范围 Range of band (bp)

1 700~80 1 650~75 1 850~60 1 700~60

多态性带

No. of polymorphic bands

42 28 37 39 146 36.5

多态百分率

Percentage of polymorphic

bands (%)

56.75 58.33 64.91 60 59.84

AFLP扩增片段在不同群体中出现的频率有差异, 如位点E32/M48-780在POP1中基因频率为1, 而在POP2、POP3、POP4中的基因频率分别为0.537 1、0.5和0.354 5; E33/M62-1010在POP4的基因频率为1, 而其余均为0; 又如E33/M62-240在POP1, POP4的基因频率为1, 而其余两个群体均为0。根据不同群体在同一位点频率的差异, 统计

了4个群体的特有带数及群体间共有带数。由表3可以看出4个群体所具有的特有扩增带(37条)占总带数的15.16%, 4个群体的共有带为207, 占总带数的84.84%, 群体特异带及群体间共有带的不同提示了各群体间的遗传差异及遗传相似性(李文英等, 2003), 可以为核桃种质资源的种属鉴定及利用提供依据。

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图1 利用E35/M61引物组合对野生核桃与铁核桃的AFLP扩增图谱

Fig. 1 AFLP fingerprinting patterns of Juglans regia and J. sigillata using the primer combination E35/M61

样品9~20为铁核桃样品, 其余为核桃样品 No. 9-20 are inpiduals of J. sigillata; Rest are J. regia detected by AFLP

2.2 遗传多样性参数

多态位点百分率(P)是分子标记中应用较为广泛的多样性指标。4个群体的多样性指标及大小关系为POP3 (P = 44.21%) < POP2 (P = 44.26%) < POP1 (P = 47.13%)<POP4 (P = 52.05%), 由此可见, 攀枝花地区(POP4)的多态位点百分率最高, 甘南地区(POP3)最低(表4)。

Shannon信息指数(I)分析结果显示, 甘南地区(POP3)群体最低, 攀枝花地区(POP4)群体最高, 4个群体的排序为甘南地区群体(POP3 I=0.230 6)﹤秦巴地区群体(POP1 I=0.249 2)﹤大渡河流域群体(POP2 I=0.255 9)﹤攀枝花地区群体(POP4 I=0.289 8)。核桃种级水平上的I为0.286 3, 核桃群体内平均I为0.245 2, 群体间的遗传多样性和群体内遗传多样性分别占总遗传多样性的14.36%和85.64%, 群体内遗传多样性大于群体间遗传多样性。从总体上来看,核桃群体组和铁核桃群体I为0.311 8, 4个群体平均I为0.256 4, 组内遗传多

样性和组间遗传多样性分别占82.23%和17.77%, 核桃与铁核桃遗传多样性主要存在于群体组内。

Nei’s基因多样性指数(H)既是衡量种群遗传多样性的重要参数, 又可以通过关系式Gst=Dst/HT间接估算种群遗传分化系数Gst, Gst是衡量种群遗传变异最常用的指标, 表示在总的遗传变异中群体间变异所占的比例。本研究结果显示, 甘南地区(POP3)群体H最低, 攀枝花地区(POP4)群体H最高, 4个群体的排序为甘南地区群体(POP3, H=0.154 7)<秦巴地区群体(POP1, H= 0.167 2)<大渡河流域群体(POP2, H=0.175 2)<攀枝花地区群体(POP4, H=0.196 1)。核桃在种级水平上的HT为0.189 6, 群体内的HS为0.165 7, 群体间的遗传分化系数Gst为0.126, 基因流Nm为3.468 1, 即群体间的遗传变异占总变异的12.6%。由此可见, 经AFLP统计结果分析而得出的Shannon信息指数和Nei’s基因多样性指数, 均表明核桃遗传多样性主要存在于群体内。从总体上来看, 核桃

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群体组与铁核桃HT为0.218, 群体组内的HS为0.197 6, 同样说明核桃群体组内的遗传多样性大于组间的遗传多样性; 两者之间的遗传分化系数

Gst为0.093 5, 核桃群体组内的变异大于组间的变异, 遗传分化较低。

表3 4个群体AFLP特有扩增带统计结果

Table 3 Statistics of the specific AFLP bands of the four populations

群体 Population POP1 POP2 POP3 POP4

合计Total

特异带数(特有带编号) (占总位点百分比) No. of specific bands

(The band code) (Percentage in

the total bands) E32/M48-1540 E33/M61-1600 E33/M61-380

E33/M62-1380 E33/M62-540

E35/M61-1320

E32/M48-440 (POP2, POP3 shared) E32/M48-870 (POP2, POP3 shared) E35/M61-690 (POP3, POP4 shared) E35/M61-510 (POP1, POP4 shared) E33/M61-1160 (POP2, POP4 shared)E33/M62-240 (POP1, POP2 shared) E33/M62-390 (POP2, POP3 shared) E33/M62-380 (POP1, POP2 shared)

2群体共有带数 (占总带数百分比)

No. of shared bands between 2 populations (Percentage in the

total bands)

E32/M48-1650 (POP1, POP2, POP3 shared) E32/M48-1470 (POP2, POP3, POP4 shared) E32/M48-630 (POP1, POP3, POP4 shared) E32/M48-430 (POP1, POP3, POP4 shared) E32/M48-280 (POP1, POP3, POP4 shared) E35/M61-1630 (POP1, POP2, POP3 shared) E35/M61-1170 (POP1, POP3, POP4 shared) E35/M61-650 (POP1, POP2, POP4 shared) E33/M62-1330 (POP1, POP3, POP4 shared) E33/M62-770 (POP1, POP2, POP4 shared) E33/M62-530 (POP1, POP2, POP3 shared) E33/M62-450 (POP1, POP2, POP4 shared)

12 (4.92%)

3群体共有带数 (占总带数百分比)

No. of shared bands among 3 populations

(Percentage in the total bands)

E32/M48-1620 E32/M48-1300 E32/M48-1180 E32/M48-970 E32/M48-540

E33/M61-720 E33/M61-640 E33/M62-1410 E33/M62-980 E33/M62-720 E33/M62-1010 17 (6.97%)

8 (3.28%)

只出现在1个群体的谱带为该群体特异带; 同时在2个群体出现的谱带为2个群体共有带, 以此类推 Specific band represents the

only band detected in one population, shared bands between 2 populations representing bands detected simultaneously in 2 populations, and soon 特有带编号E32/M48-1540表示E32/M48引物产生1 540 bp的谱带, 以此类推 The code of the specific band E32/M48-1540 means a band with length of 1 540 bp produced by amplification using primer E32/M48, and so on.

表4 AFLP检测的核桃、铁核桃4个群体的遗传多样性水平 Table 4 Genetic persity of the four populations detected by AFLP

N AP P A Ae H I 群体 Population

野生核桃 Juglans regia 种级水平Species level 0.286 3 (0.284 2)0.190 8 (0.197 6) 1.322 9 (0.363 1)1.553 3 (0.498 2)55.33% 135 34

0.249 2 (0.287 2)0.167 2 (0.200 2) 1.288 2 (0.368 4)1.471 3 (0.500 2)47.13% 115 12 POP1

0.255 9 (0.300 5)0.175 2 (0.210 1) 1.310 4 (0.389 4)1.442 6 (0.497 7)44.26% 108 14 POP2

0.230 6 (0.283 0)0.154 7 (0.195 1) 1.263 5 (0.354 2)1.422 1 (0.494 9)42.21% 103 8 POP3

铁核桃 J. sigillata

0.289 8 (0.295 5)0.196 1 (0.205 9) 1.339 9 (0.380 4)1.520 5 (0.500 6)52.05% 127 12 POP4

0.311 8 (0.286 8)0.208 7 (0.200 7) 1.356 3 (0.370 7)1.598 4 (0.491 2)59.84% 146 46 合计 In total

括号内数值为标准差 The value in the bracket is SD N: 样本数 Number of samples AP: 多态带数 Number of polymorphic loci P: 多态带百分率 Percentage of polymorphic loci A: 等位基因平均数 Average number of alleles per loci Ae: 有效等位基因数 Ef-fective number of alleles per loci H: Nei’s 基因多样性指数 Nei’s gene persity I: Shannon信息指数 Shannon’s information index

核桃种级水平的AFLP检测表明, 每个位点的等位基因数(A)为1.553 3, 多态位点(P)为55.33%, Shannon信息指数(I)为0.286 3。而在核

桃的各个群体水平上, POP 1、POP2、 POP3的 A、P、I分别为: 1.471 3、47.13%、0.249 2, 1.442 6、44.26%、0.255 9, 1.422 1、42.21%、0.230 6, 由此

1368 植 物 生 态 学 报

www. 32卷

可以看出, 在核桃种级水平上的A、P、I均略高于核桃内部各群体, 而在各群体之间, 这三个指标相差不大。铁核桃群体的遗传变异水平为: P、A、Ae、H分别为52.05%、1.520 5、1.339 9和0.196 1, 铁核桃的AFLP各项遗传多样性参数与核桃相近, 在DNA水平检测过程中未发现明显的遗传差异。 2.3 群体遗传变异的AMOVA分析

群体遗传变异的方差分析(AMOVA)表明(表5), 群体间的p值均小于0.001, 差异极显著。研究结果表明群体的遗传多样性主要分布于群体内, 占变异成分的88.93%, 而只有11.07%的变异分布于不同群体间; 从种级水平上来看, 核桃群体组

与铁核桃组在种间的遗传变异成分占12.4%, 而在组内占了87.6%。3个不同核桃群体与铁核桃群体两两间的Phist遗传分化系数(Фst)也不大(表6)。从4个不同群体间的AMOVA遗传多样性及遗传分化系数Фst值的比较来看, 秦巴地区群体(POP1)与攀枝花地区群体(POP4)的遗传结构关系最远(Фst值最大), 大渡河流域群体(POP2)与甘南地区群体(POP3)的遗传结构关系最近(Фst值最小), 秦巴地区群体(POP1)与大渡河流域群体(POP2)间、秦巴地区群体(POP1)与甘南地区群体(POP3)间的遗传结构关系介于两者间。

表5 运用方差分析(AMOVA)所得结果如下表所示

Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) of four populations

变异来源 Source of variation 群体间 Among populations 群体内 Within populations 组间 Among groups 组内 Within groups

自由度

df 3 42 1 44

方差 SS 168.58 977.70284.689 1 061.59

均方差Ms 56.19323.27984.68924.127

变异成分 Variance component 2.897 23.279 3.414 24.127

变异百分率Percentage of variance component

(%)

11.07% 88.93% 12.4% 87.6%

Phist系数 Фst 0.111 0.124

显著度检测p-value ﹤0.001

﹤0.001

表6 两两群体间的Phist遗传分化系数(Фst)

Table 6 Genetic differentiation of Phist analysis between

pairs of populations (ФSt) detected by AFLP

2.4 群体间的遗传一致度和遗传距离以及UPGMA聚类分析

为了进一步分析群体间的遗传分化程度, 计

POP1 POP2 POP3 POP4 POP2 0.087 4 * POP4

0.154 6

0.139 1

0.117 8

*

算了Nei’s遗传一致度IN和遗传距离D, 群体的遗

传一致度在0.933 2～0.962 5之间(表7), 遗传距离在0.038 2～0.069 2之间, 说明群体间的相似程度较高, 遗传距离小。其中, 大渡河流域群体(POP2)与甘南地区群体(POP3)的遗传相似性最高 (0.962 5), 遗传距离最小0.038 2; 秦巴地区群体(POP1)与攀枝花地区群体(POP4)的遗传距离最大(0.069 2), 遗传分化程度最高。根据4个群体间的Nei’s遗传一致度进行的UPGMA聚类分析结果显示(见图2) , 从总体上看, 核桃群体(POP1、POP2体(POP1)与攀枝花地区群体(POP4)的遗传距离最大, 大渡河流域群体(POP2)与甘南地区群体(POP3)的遗传距离最小, 秦巴地区群体(POP1)与大渡河流域群体(POP2)间、秦巴地区群体(POP1)与甘南地区群体(POP3)间的遗传距离介于两者间。

POP3 0.081 7 0.0472 *

两两群体间遗传分化显著性检验p-value均小于0.001 All of the p-value between two populations is less than 0.001

表7 AFLP所检测的核桃4个种群间的遗传距离及 遗

传一致度

Table 7 Nei’s genetic identity and genetic distance be-tween two populations detected by AFLP

POP2 POP3 POP4

0.044 3 0.049 1 0.069 2

* 0.038 2 0.068 6

0.962 5 * 0.068 2

0.933 70.934 1*

POP1 POP2 POP3 POP4 和POP3)与铁核桃群体(POP4)分开, 秦巴地区群

右上三角为为遗传一致度, 左下三角为遗传距离 The upper triplet on the right indicates Nei’s genetic iden-tity and the lower triplet on the left indicates genetic dis-tance

6期 陈良华等: 用AFLP技术分析四川核桃资源的遗传多样性 DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.06.017

1369

中发现“核桃与铁核桃共享条带多, 差异不明显”的实验结果一致, 所以本试验得出的结论更支持杨自湘和奚声珂(1989)的观点, 认为铁核桃不宜划为另一个种。 3.2 遗传多样性

从核桃3个群体AFLP检测结果来看, 用4对引物共扩增多态性条带135条, 平均每对引物检

55.33%, 而对于铁核桃群体, 4对引物所检测的多

图2 4个群体基于AFLP分析的UPGMA聚类结果

态性条带为127条, 平均每对引物检测到31.75, Fig. 2 Dendrogram of UPGMA analysis of the four

populations of Juglans regia and J. sigillata based 多态性条带比率为 52.05%, 两者之间多态性比例

on AFLP makers

基本相当; 本研究结果显示核桃及铁核桃遗传多

测到33.75条多态性条带, 多态性条带比率(P)为

3 讨论与结论

3.1 核桃与铁核桃种属关系探讨

核桃和铁核桃是四川省核桃属主要的两个种, 核桃与铁核桃种属分类鉴定经历了由形态学、细胞学到同功酶及分子标记分类鉴定过程, 匡可任和路安民(1979)根据形态学等特征, 将铁核桃作为核桃属的1个种, 归为核桃组Sect. Jug-lans; 杨自湘和奚声珂(1989)通过同功酶酶谱分析认为两者之间主要酶谱均为第1种酶谱, 由此推断铁核桃与核桃生态型平行, 不宜划为另一个种; 吴燕民等(2000b)运用RAPD技术对核桃属内9个种及近缘属的2个种进行标记, 找到了铁核桃自身特征性标记带OPA01-259, 认为铁核桃为核桃属中一个独立种; 梅秀英等(1998)通过对核桃与铁核桃包括角质层厚度等6项叶片旱生结构指标的方差分析表明, 每项指标差异极显著, 这说明铁核桃形成了对干旱干热河谷的适应性; Orel等(2003)通过对核桃与铁核桃的叶绿体DNA的研究表明, 两者显示出了非常近的亲缘关系。种群特异带及种群间共有带的差异与分布揭示了各群体的遗传差异及相似性, 总的说来, 种群遗传分化越大, 在AFLP分子标记中群体在酶切位点上的变异就越大, 具有的特有谱带更多, 本研究对4个种群AFLP扩增特异性谱带及种群间共有谱带进行了统计, 铁核桃种群的特异性带最多(11条, 占总带数的4.5%), 铁核桃种群与3个核桃群体之间的遗传变异显然要比核桃内部群体之间的遗传变异高, 这与分子方差分析的结果相一致。但从种级水平来看, AFLP检测过程中也没有发现明显的遗传差异, 与郝艳宾等(2006)的实验检测过程

样性较丰富, 核桃3个种群的Shannon多样性指数(I)和平均Nei’s遗传多样性(H)分别在0.230 6～0.255 9之间和0.154 7～0.175 2之间, 而铁核桃种群分别为0.289 8和0.196 1, 铁核桃群体的遗传多样性略高于核桃群体; 陈少瑜等(2006)、Nicese等(1998)和Bayazit等(2007)研究的核桃遗传多样性百分率分别为60.78%、25%和10%, 与之相比, 本研究的多态性百分率较高; 与已有研究报道的胡桃科其它物种相比, 如与近缘异属的山核桃属植物山核桃(Carya cathayensis)相比, 郭传友等(2006) 所作山核桃群体的Shannon多样性指数(I)和平均Nei’s遗传多样性指数(H)分别为0.199 2~ 0.28和0.129 7~0.205 1, 王正加等(2006) Shannon多样性指数(I)和Nei’s遗传多样性指数(H)分别为0.476 1和0.186 5, 从这两项指标来看, 本研究比郭传友所做研究群体的遗传多样性更丰富, 但比王正加的略低。造成遗传多样性水平差异的原因, 可能与本试验材料的取材范围, 群落生态环境(生境多样性、种群的分布格局)差异及核桃与铁核桃特有的生物学特性, 如孤雌生殖、天然杂交亲和力、基因流状况(Nicese et al ., 1998)等有关。 3.3 遗传结构与基因流

从聚类图分析来看, 各种群的亲缘关系与赵安玖等(2004)的生态区划聚类基本一致, 秦巴山种群与大渡河流域种群在地理位置上最近, 自然气候条件也较为一致, 遗传结构关系上非常接近, 而前3个种群均是核桃种群, 聚在了一起; 铁核桃作为另一个种, 在四川多生长在金沙江流域干热河谷地带, 表现出特有的地理生态型, 因此该种群与前三者的亲缘关系最远。

核桃属植物为雌雄花同株异位, 异花授粉,

1370 植 物 生 态 学 报

www. 32卷

且为“雌雄异熟”型, 而“雌雄异熟”是异花授粉植物的有利特性, 同时也是核桃具有稳定遗传性的原因之一(郗荣庭和张毅萍, 1992)。群体遗传结构的形成与基因流(Nm)密切相关, Nm水平一方面可能主要与种子传播方式、地理隔离有关, 另一方面, 群体间的基因流可能由于环境恶化和强烈的人为干扰活动(如采收果实)等造成的生境片段化而降低, 生态环境片段化使各群体在空间上相对隔离, 在个体、种子、花粉等的迁移能力不变的情况下, 隔离距离越大, 群体间的基因流越小, 从而导致群体间的遗传分化增大(周连第等, 2006)。本研究中AFLP标记检测表明核桃遗传多样性主要存在于群体内, 群体间占11.07%, 3个核桃群体间基因流Nm为3.47, 说明核桃不同群体间有一定的基因交流, 但是四川省地形复杂, 山体高大, 群体间遗传分化系数(Gst=0.126)相对较大; 而从总体上看, 4个群体间的遗传分化系数(Gst)为0.165 3, 基因流Nm为2.56, Nei的的遗传多样性分析方法与分子方差分析(AMOVA)得出的研究结果一致, 群体内遗传变异大于群体间遗传变异, 这与郭传友等(2006), 王正加等(2006)的研究结论一致。分子方差分析中的Фst 相当于遗传分化系数, Wright (1951)认为分化指数介于0～0.05之间说明种群间分化很弱, 0.05～0.15之间表示中等分化, 0.15～0.25之间表示分化大, 大于0.25表明分化极大, 本研究中总的Фst为0.111, 大致说明各种群间属于中等分化, 但是由表6可以看出, 凡是核桃种群之间的遗传分化系数均小于0.1, 而核桃种群与铁核桃种群之间的遗传分化系数Фst均大于0.1, 最大的POP1～POP4之间为0.168, 这两者之间的遗传分化大, 总的说来, 核桃种群与铁核桃种群之间的遗传分化要大于核桃内部种群的分化, 但是核桃种群与铁核桃的分化仅达到中等水平, 这与在DNA检测过程中未发现明显的不一致相符。POP1和POP4, POP2和POP4, POP3和POP4的遗传分化系数(Gst)和基因流Nm分别为0.131 1和3.314 7, 0.127和3.436 3, 0.134 6和3.21, 可见核桃种群与铁核桃种群间有一定的基因交流, 但是并不频繁, 这可能与核桃存在孤雌生殖现象(郗荣庭和张毅萍, 1992; 高绍棠等, 1999)以及核桃与铁核桃的天然杂交有关。

本实验采用的是混合样品, 它可以作为样品母树的代表, 又可以更准确地代表该地区整个居

群的遗传结构及变化(黎裕等, 2003)。对于核桃属植物而言, 花系风媒花, 虽然雌雄花同株, 但雌雄异熟, 多异交(郭传友等, 2006), 与许多开放授粉群体(如野生稻(Oryza meyericana), 玉米(Zea mays))有相似之处(钱韦等, 2000; 黎裕等, 2003), 因为样品母本即为所采母树, 父本则不能确定, 可能是邻近的, 也可能是来至其它地区的基因流, 所以本研究认为混合样品更适合评价该地区种群遗传结构的变化。

综上所述, 首先, 核桃种群与铁核桃种群的AFLP分析可以较好地反映群体遗传结构及群体间的遗传分化, 对于指导核桃种质资源的保护和育种有一定的参考价值; 其次, 在探讨核桃与铁核桃种间关系时, 其种群之间遗传分化不大, DNA检测过程中并没有发现明显的遗传差异, 两者的种属关系值得进一步研究。

参 考 文 献

Bassam BJ, Caetano-Anollés G, Gresshoff PM (1991). Fast

and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide

gels. Analytical Biochemistry, 196, 80-83.

Bayazit S, Kazan K, Gülbitti S, Cevik V, Ayanoglu H,

Ergül A (2007). AFLP analysis of genetic persity in low chill requiring walnut (Juglans regia L.) geno-types from Hatay, Turkey. Scientia Horticulturae, 111,

394-398.

Chen J (陈静), Wang WJ (王文江) (2004). Extraction of

DNA for AFLP amplification reaction in tender walnut leaves. Journal of Agricultural University of Hebei(河北农业大学学报), 27, 44-47. (in Chinese with English abstract)

Chen SY (陈少瑜), Yang E (杨恩), Xi XL (习学良), Fan

ZY (范志远), Zhang Y (张雨) (2006). Molecular iden-tification of main varieties in Juglans sigillata Dode from Yunnan Province by ISSR. Nonwood Forest Re-search (经济林研究), 24(4), 41-45. (in Chinese with English abstract)

Conner PJ, Wood BW (2001). Identification of pecan culti-vars and their genetic relatedness as determined by randomly amplified polymorphic DNA analysis. Journal of the American Society for Horticultural Sci-ence, 126, 474-480.

Dangl GS, Woeste K, Aradhya MK, Koehmstedt A, Simon

C, Potter D, Leslie CA, McGranhan G (2005). Charac-terization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut. Journal of the American Society for Horticultural Science, 130,

348-354.

6期 陈良华等: 用AFLP技术分析四川核桃资源的遗传多样性 DOI: 10.3773/j.issn.1005-264x.2008.06.017 1371 Fjellstrom RG, Parfitt DE, McGranahan GH (1994). Ge-netic-relationships and characterization of Persian

walnut (Juglans regia) cultivars using restric-tion-fragment-length-polymorphisms (RFLPs). Journal of the American Society for Horticultural Science,

119,833-839.

Foroni I, Woeste K, Monti LM, Rao R (2007). Identification

of ‘Sorrento’ walnut using simple sequence repeats (SSRs). Genetic Resources and Crop Evolution, 54,

1081-1094.

Gao HZ (高焕章), Zhang Y (张义), Li QJ (李秋杰), Bao

XM (鲍新梅) (2000). General situation of production and sales of world walnut and countermeasures on de-velopment of Hubei excellent and famous products. Journal of Hubei Agricultural College (湖北农学院学报) , 20, 141-143. (in Chinese with English abstract) Gao ST (高绍棠), Liu CB (刘朝斌), Liu DL (刘杜玲), Li L

(李莉), Ye NL (叶乃玲), Chen YF (陈耀锋) (1999). Apomixis characteristics of Juglans regia L.. Journal of Northwest Forestry University (西北林学院学报), 14(1), 45-47. (in Chinese with English abstract) Gao X (高翔), Pang HX (庞红喜), Pei AW (裴阿卫)

(2002). Application of molecular marker techniques in the plant genetic persity study. Journal of Henan Agricultural University (河南农业大学学报) , 36, 356-359. (in Chinese with English abstract)

Guo CY (郭传友), Huang JQ (黄坚钦), Wang ZJ (王正加),

Fang YM (方炎明) (2006). RAPD analysis for natural population genetic structure of Carya cathayensis. Journal of Nanjing Agricultural University (南京农业大学学报), 29(3), 12-17. (in Chinese with English ab-stract)

Hao YB (郝艳宾), Xiao YQ (肖永强), Qi JX (齐建勋), Qi

S (齐实), Chen LL (程丽莉) (2006). Application of Microsatellite DNA on analyzing the homology of re-lated species in Juglans L.. Journal of Beijing Agri-cultural College (北京农学院学报), 21(3), 1-4. (in Chinese with English abstract)

Huang JQ (黄坚钦), Zhang BS (章滨森), Wang ZJ (王正

加), Guo CY (郭传友) (2003). RAPD analysis on ge-netic relationship among species in Genus Carya. Journal of Southwest Forestry College (西南林学院学报), 23(4), 2-5. (in Chinese with English abstract) Kafkas S, Ozkan H, Sutyemez M (2005). DNA polymor-phism and assessment of genetic relationships in wal-nut genotypes based on AFLP and SAMPL markers. Journal of the American Society for Horticultural Sci-ence, 130, 585-590.

Kuang KR (匡可任), Lu AM (路安民) (1979). Flora

Reipublicae Popularis Sinicae (中国植物志). Science Press, Beijing, 21, 30-35. (in Chinese)

Li WY (李文英), Gu WC (顾万春), Zhou SL (周世良)

(2003). AFLP analysis on genetic persity of Quercus Mongolica populations. Scientic Silvae Sinicae (林业科学), 39(5), 29-36. (in Chinese with English abstract) Li Y (黎裕), Wang TY (王天宇), Tian SJ (田松杰), Shi YS

(石云素), Song YC (宋燕春) (2003). Sampling strate-gies of Maize populations when molecular markers are used in genetic persity analysis. Journal of Plant Genetic Resources (植物遗传资源学报), 4, 314-317. (in Chinese with English abstract)

Mei XY (梅秀英), Jiang ZM (姜在民), Gao ST (高绍棠),

Cui HA (崔宏安), Liu CB (刘朝斌), Cao YM (曹玉美) (1998). A study on the anatomical structures of the leaves of 14 Juglans regia and Juglans sigillate varie-ties (excellent clones). Journal of Northwest Forestry College (西北林学院学报), 13(1), 16-20. (in Chinese with English abstract)

Nei M (1973). Analysis of gene persity in subpided

population. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 70,

3321-3323.

Nicese FP, Hormaza JI, McGranahan GH (1998). Molecular

characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L.) genotypes based on RAPD markers.

Euphytica, 101, 199-206.

Ninot A, Aleta N (2003). Identification and genetic rela-tionship of Persian walnut genotypes using isozyme markers. Journal of the American Pomological Society,

57, 106-114.

Orel G, Marchant AD, Mcleod JA, Richards GD (2003).

Characterization of 11 Juglandaceae genotypes based on morphology, cpDNA, and RAPD. HortScience, 38,

1178-1183.

Peng JY (彭建营), Su HR (束怀瑞), Sun ZX (孙仲序)

(2001). Application prospects of molecular markers in the research of fruit gdrmplasm resources. Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science Edition) (山东农业大学学报(自然科学版)), 32,103-106. (in Chinese with English abstract)

Potter D, Gao FY, Aiello G, Leslie C, McGranhan G

(2002). Intersimple sequence repeat markers for fin-gerprinting and determining genetic relationships of walnut (Juglans regia) cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Science, 127,

75-81.

Qiang W (钱韦), Ge S (葛颂), Hong DY (洪德元) (2000).

Assessment of genetic variation of Oryza granulate detected by RAPDs and ISSRs. Acta Botanica Sinica

1372 植 物 生 态 学 报

(植物学报), 42, 741-750. (in Chinese with English abstract)

Sun QL (孙庆磊), Liang YR (梁月荣), Ding ZT (丁兆堂),

LU JL (陆建良) (2004). AFLP molecular marker tech-nique and its application to tea genetic and breeding research. Journal of Tea (茶叶), 30, 203-206. (in Chi-nese with English abstract)

Wang GA (王国安), Zhang FP (张虎平), Hu HF (虎海防),

Niu JX (牛建新), Ma BG (马兵钢) (2004). Identifica-tion of a RAPD marker related to early-bearing char-acteristic of walnut seedlings. Journal of Fruit Science (果树学报), 21, 485-487. (in Chinese with English abstract)

Wang ZJ (王正加), Huang YJ (黄有军), Guo CY (郭传友),

Huang JQ (黄坚钦), Wang HF (王华芳) (2006). RAPD analysis on genetic persity of Carya Dabieshanensis populations. Journal of Plant Ecology (Chinese Ver-sion) (植物生态学报), 30, 534-538. (in Chinese with English abstract)

Woeste K, Burns R, Rhodes O, Michler C (2002). Thirty

polymorphic nuclear microsatellite loci from black

walnut. Journal of Heredity, 93, 58-60.

Wright S (1951). The genetical structure of populations.

Annals of Eugenices, 15, 323-354.

Wu YM (吴燕民), Liu Y (刘英), Dong FX (董凤祥), Xi SK

(奚声珂) (2000a). Study on different ecological types of Chinese walnut (J.regia) using RAPD markers. Journal of Beijing Forestry University (北京林业大学学报), 22(5), 23-27. (in Chinese with English abstract) Wu YM (吴燕民), Pei D (裴东), Xi SK (奚声珂), Li JR (李

嘉瑞) (2000b). A study on the genetic relationship among species in Juglans L. using RAPD markers. Acta Horticulturae Sinica (园艺学报), 27, 17-22. (in

www. 32卷

Chinese with English abstract)

Xi RT (郗荣庭), Zhang YP (张毅萍) (1992). Chinese Wal-nut (中国核桃). China Forestry Publishing House, Beijing, 111-117. (in Chinese)

Yang KQ (杨克强), Wang YJ (王跃进), Zhang YD (张银

东), Zheng XQ (郑学勤) (2002). RAPD analysis for the identification of the precocious trait in walnut. Acta Horticulturae Sinica (园艺学报), 29, 573-574. (in Chinese with English abstract)

Yang ZX (杨自湘), Xi SK (奚声珂) (1989). A study on

isozymes of peroxidase of 10 species in Juglans L.. Acta Phytotaxonomica Sinica (植物分类学报), 27, 53-57. (in Chinese with English abstract)

Zhang FM (张富民), Ge S (葛颂) (2002).Data analysis in

population genetics. I. Analysis of RAPD data with AMOVA. Biopersity Science (生物多样性), 10, 438-444. (in Chinese with English abstract)

Zhang RQ (张日清), He F (何方), Lv FD (吕芳德), Li B

(栗彬) (2001). Population genetic analysis by ran-domly amplified polymorphic DNA markers in Pecan. Economic Forest Researches (经济林研究), 19(2), 1-4. (in Chinese with English abstract)

Zhao AJ (赵安玖), Xiao QW (肖千文), Hu TX (胡庭兴)

(2004). Ecological quality regionalization of walnut in Sichuan Province. Economic Forest Researches (经济林研究), 22(2), 1-4. (in Chinese with English abstract) Zhou LD (周连第), Lan YP (兰彦平), Han ZH (韩振海)

(2006). Study on heritance persity of Chinese chest-nut (Castanea mollissima) variety resources at mo-lecular level. Acta Agriculturae Boreali-Sinica (华北农学报), 21(3), 81-85. (in Chinese with English ab-stract)

责任编委: 葛 颂 责任编辑: 李 敏

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kwfq.html