DNA和RNA提取常见问题分析及对策

DNA和RNA提取常见问题

DNA和RNA提取 和 提取 常见问题分析及对策

DNA和RNA提取常见问题

DNA提取专题 DNA提取专题第一部分： 第一部分：DNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分： 第二部分：DNA提取常见问题分析及对策 提取常见问题分析及对策

DNA和RNA提取常见问题

前言DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 是遗传信息的载体， 是遗传信息的载体 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为 了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子 了进行测序、杂交和基因的表达， 量和高纯度的DNA是非常重要的前提。 是非常重要的前提。 量和高纯度的 是非常重要的前提

DNA和RNA提取常见问题

DNA提取原则 DNA提取原则保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染

DNA和RNA提取常见问题

DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法染色体DNA的提取 染色体DNA的提取 DNACTAB法 法 SDS法 SDS法 其它

DNA和RNA提取常见问题

DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法非染色体DNA的提取 的提取 非染色体 质粒DNA的提取 的提取 质粒 碱裂解法 煮沸法

线粒体、叶绿体 线粒体、叶绿体DNA的提取 的提取 差速离心结合 差速离心结合SDS裂解法 裂解法

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA- CTAB法 基因组DNA- CTAB法CTAB法原理(植物 提取经典方法) 法原理 植物DNA提取经典方法 提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基 ( , 溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， ),是一种阳离子去污剂 溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 该复合物在高盐溶液中( 该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的，通过有机溶剂 )是可溶的， 抽提，去除蛋白、多糖、 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 出来。 溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出， 注：CTAB溶液在低于 ℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 溶液在低于 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 ℃ 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA- CTAB法 基因组DNA- CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方 提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； )提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合 2+或Mn2+离子，抑制 螯合Mg 离子，抑制DNase活性； 活性； 螯合 活性 NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； 提供一个高盐环境， DNP充分溶解 存在于液相中； 充分溶解， CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 溶解细胞膜，并结合核酸

,使核酸便于分离； 溶解细胞膜 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 巯基乙醇是抗氧化剂

CTAB提取缓冲液的改进配方 提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合 (聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物， 物质，有效去除多酚，减少 中酚的污染； 物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合， 中酚的污染 同时它也能和多糖结合， 有效去除多糖。 有效去除多糖。

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA- CTAB法 基因组DNA- CTAB法CTAB法流程图 法流程图植物材料 裂解液酒精沉淀

液氮研磨

抽提

离心洗涤

DNA溶液 溶液

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA-SDS法 基因组DNA-SDS法SDS法原理 法原理SDS是一种阴离子去垢剂， 在高温 ( 55~65℃) 条件下能裂解细 是一种阴离子去垢剂，在高温( ~ ℃ 是一种阴离子去垢剂 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖 或 浓度并降低温度( 提高盐 浓度并降低温度 冰浴) 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 用酚/氯仿抽提 上清液中的 用酚 氯仿抽提， DNA。 。

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA-SDS法 基因组DNA-SDS法SDS法流程图 以动物组织为例) SDS法流程图 (以动物组织为例)动物组织抽提 离心洗涤

组织匀浆

上层溶液

干燥溶解

细胞裂解

酒精沉淀

DNA溶液 溶液

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA- 基因组DNA-其它方法根据细胞裂解方式的不同有： 根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式： 生物方式：酶法

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA- 基因组DNA-其它方法根据核酸分离纯化方式的不同有： 根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法： 吸附材料结合法：

硅质材料

高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 pH值结合核酸 pH值洗脱 快捷高效。 快捷高效。

阴离子交换树脂

低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 pH值结合核酸 pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验。 适用于纯度要求高的实验。

磁珠

磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。 从而达到分

离目的。

DNA和RNA提取常见问题

基因组DNA- 基因组DNA-其它方法浓盐法： 浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 和 在盐溶液中溶解度不同， 利用 在盐溶液中溶解度不同

有机溶剂抽提法： 有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂， 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用

密度梯度离心法： 密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物

DNA和RNA提取常见问题

质粒DNA- 质粒DNA-碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 DNA比质粒DNA分子大得多 DNA 而质粒DNA为共价闭合环状分子； DNA为共价闭合环状分子 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 DNA溶液时 DNA容易发生变性 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 DNA 而复性的超螺旋质粒DNA DNA分子则以溶解状态存在液相 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 从而可通过离心将两者分开。 中，从而可通过离心将两者分开。

DNA和RNA提取常见问题

质粒DNA- 质粒DNA-碱裂解法碱裂解法流程图对数期菌体 上清液 沉淀

溶液I充分重悬 溶液 充分重悬

抽提

干燥溶解

溶液II裂解 溶液 裂解

酒精沉淀

质粒DNA溶液 溶液 质粒

溶液III中和 溶液 中和

离心洗涤

DNA和RNA提取常见问题

质粒DNA- 质粒DNA-煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 DNA比质粒DNA分子大得多 DNA 而质粒DNA为共价闭合环状分子； DNA为共价闭合环状分子 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 DNA溶液时 DNA容易发生变性 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； DNA在冷却时即恢复其天然构象 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 DNA 而复性的超螺旋质粒DNA DNA分子则以溶解状态存在液相 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 从而可通过离心将两者分开。 中，从而可通过离心将两者分开。

DNA和RNA提取常见问题

细胞器DNA- 细胞器DNA-差速离心法线粒体和叶绿

体是生物体内半自主性细胞器， 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 它们的比重和大小一定 比重和大小一定， 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法， 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。 种组分分级分离出来。

差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质(蔗糖) 将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。 从而得以分离。

DNA和RNA提取常见问题

内容第一部分： 第一部分：DNA提取方法简介 提取方法简介 第二部分：DNA提取及常见问题分析 第二部分： 提取及常见问题分析

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kwai.html