泛素

泛素-蛋白酶体途径及研究进展

【摘要】

泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制。负责执行这个调控过程的组成成分包括泛素及其启动酶系统和蛋白酶体系统。泛素启动酶系统负责活化泛素, 并将其结合到待降解的蛋白上, 形成靶蛋白多聚泛素链, 即泛素化。蛋白酶体系统可以识别已泛素化的蛋白并将其降解。此外, 细胞内还有另一类解离泛素链分子的去泛素化蛋白酶形成反向调节。泛素-蛋白酶体途径涉及许多细胞的生理过程, 其调节异常与多种疾病的发生有关。

【关键词】泛素化 去泛素化 类泛素化 一．泛素及其启动酶系统

泛素-蛋白酶体途径( Ubiquitin-Proteasome pathway )是一个新近受到关注的调节蛋白质降解与功能的重要系统。其主要作用于细胞内一些半衰期短的调节蛋白和一些结构异常、错构或受损伤的蛋白。其过程是以共价键形式联结多个泛素( ubiquitin)分子, 形成靶蛋白多聚泛素链即泛素化后, 再输送到26S 蛋白酶体上被消化降解。这一途径在很多细胞生命过程中起调节作用, 包括细胞周期循环、信号转导、核酸密码翻译、DNA 损伤修复、异常蛋白代谢、抗原递呈及细胞受体功能等, 并与许多疾病的发生发展密切相关。因此对该系统的调节及其意义的研究已成为医学研究的一个热点。

泛素是由76个氨基酸组成的球形热稳定蛋白,其结构在真核细胞

中高度保守。在不同生物体间组成泛素的氨基酸序列差别很小, 如酵母和人的泛素仅有3个氨基酸序列的差别。泛素能以自由的形式存在, 也能和其他蛋白形成复合物。泛素是通过一系列泛素启动酶的作用而与靶蛋白连接的。泛素启动酶包括E1 泛素激活酶、E2 泛素结合酶、E3 泛素连接酶。首先, 在ATP参与下, 游离的泛素被E1激活, 即E1的半胱氨酸残基与泛素的C末端甘氨酸残基形成高能硫酯键。然后, 活化的泛素被转移到E2的活性半胱氨酸残基上, 形成高能硫酯键。接着, E2再将泛素传递给相应的E3。E3可直接或间接地促进泛素转移到靶蛋白上, 使泛素的C末端羧酸酯与靶蛋白赖氨酸氨基形成异肽键, 或转移到已与靶蛋白相连的泛素上形成多聚泛素链。以上即泛素化过程。

在该途径中, E3是通过识别和结合特异的靶蛋白序列或降解决定子(degron: 决定某一蛋白发生降解或部分降解的序列)来特异性地调节靶蛋白的降解代谢。根据识别靶蛋白序列中结构域不同, E3又分为两类: (1)HECT 型E3连接酶, HECT 结构域包含保守的350个氨基酸。该结构域上的半胱氨酸残基与泛素的硫酯键连接形成复合物U b-E3作为过渡, 再将泛素转移到靶蛋白上。(2) RING-finger E3连接酶, 包括c-Cb1, APC和SCF, 在泛素转运过程中都不直接与Ub形成过渡的蛋白复合物, 而且都包含一个RING-finger结构域或一个结构相关的结构域,例如U-box 结构域。RING结构域可以与Ub-E2形成复合体, 随后直接将Ub转移至靶蛋白上。 二．26S蛋白酶体系统

蛋白酶体定位于胞核和胞质内。26S蛋白酶体是由2个环状的19S亚单位和1个20S微粒体状的亚单位组成。19S亚单位由包含6 个AAA-ATP 酶的碱性亚复合体和包含8个非ATP酶的亚复合体组成。它的功能是识别泛素化的靶蛋白并在其进入20S复合体前对其进行去泛素化、打开折叠和移位。20S催化核心有4 个环叠成圆筒状结构, 其中两侧外环由1~ 7亚单位组成, 两个内环由1~ 7亚单位组成, 4个环的中央形成一个狭窄的孔。亚单位促使底物移位进入中央孔隙水解中心, 并使20S复合体和19S调节复合体之间发生构象改变。亚单位N末端苏氨酸残基是蛋白酶体的水解中心, 但是不同的亚单位有不同的蛋白酶活性, 包括胰蛋白酶样、糜蛋白酶样和半胱氨酸蛋白酶样活性,分别能裂解羧基端碱性、疏水性或芳香性和酸性氨基酸残基, 从而消化底物, 释放出短肽碎片。

蛋白酶体被认为是细胞内的再生与回收中心,泛素化的靶蛋白在此被分解为短肽和氨基酸, 而泛素被回收再利用。 2. 1.蛋白质降解的泛素化调节

研究发现, 蛋白质带有某些能被泛素系统识别的信号, 这些信号包括: (1) N-degron: 早在1986年, Varshavsky等进行了一系列试验, 提出了N-末端规则, 即通过蛋白质N-末端的氨基酸来预测它的半衰期, 如蛋白质N-末端是丝氨酸, 半衰期可以长达20 h; 相反, 如果是天冬氨酸, 半衰期只有3min。但N-degron如何启动并标记泛素的机制还不清楚。(2)有些氨基酸序列是降解的信号: PEST序列是其中之一, 在短短8个氨基酸的片段上, 富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸

和苏氨酸。如转录因子Gcn4p, 有281个氨基酸, PEST 序列位91~106, 此蛋白正常的半衰期大约为5min,如果将PEST 序列移除,半衰期增加到50min。此外,有时信号也可能隐藏在疏水核心中或被掩盖。当一些蛋白以天然状态存在时, 信号被隐藏, 蛋白不被降解。但蛋白结构出现变化如出现部分解链区,信号就会暴露而被泛素系统发现并降解。这就是为何部分折叠、异常和突变蛋白易被降解的原因。目前, 泛素-蛋白酶体途径对蛋白质降解信号的识别和它们被标记的具体机制仍然不清楚。

2. 2.去泛素化酶系统

特异性的去泛素化酶主要有两大类: (1)泛素羧基末端水解酶家族( ubiquit in C-term inal hydro lases, UCH s) , 属于半胱氨酸蛋白酶。UCHs通常是小分子蛋白, 包括UCHL-1, -2,-3等分子。UCH s可以通过裂解C 末端76位甘氨酸将泛素分子从小的多肽底物上释放出来。现已发现UCH s与一些疾病及肿瘤关系密切。如UCHL-1 主要分布在神经组织, 与帕金森病等发病有关; (2)泛素特异性修饰酶家族( ubiquit in-specific processing enzymes, UBPs) 包括U bp-M, UBP41, UBP4, HAUSP, ISOT1等, 这些酶分子都含有2 个短而保守的片段即Cys盒和H is盒, 包括了所有有催化作用的残基,UBPs能将泛素分子从大的蛋白上移除。总之, 两组酶都能催化水解泛素分子C 末端的多肽链连接, 起到去泛素化作用。目前, 利用泛素化或去泛素化来调控细胞内蛋白质的水平, 并影响其功能已成为蛋白质研究的一个重要策略。如已知P53的泛素化降解与许多肿瘤发生相关。1997年

发现UBP成员疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶( herpes

virus-associated Ub-specific protease, HAUSP)与细胞核内分子结合, 与前髓细胞白血病发病相关, 随着研究的深入, Muyang等证实HAU SP能特异性结合P53泛素化链, 使其去泛素化, P53降解减少, 稳定性增强,并抑制肿瘤细胞的生长。 三．蛋白质降解的泛素化调节和去泛素化调节

研究证实, 细胞内80% ~ 90% 的蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。泛素的靶蛋白包括: 细胞周期调节因子、肿瘤抑制因子、转录激活因子和抑制因子、细胞表面受体以及突变或受损蛋白质, 通过以上 靶蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解后, 可以影响或调节多种细胞活动。但随着对泛素-蛋白酶体途径的研究深入, 进一步发现蛋白泛素化调节是一个可逆的过程。细胞内同时还存在一些特异的去泛 素化蛋白酶进行负向调节 3．1．泛素化途径与细胞周期

由依赖于SCF的泛素化途径参与降解的与细胞周期有关的蛋白Cyc lin D是细胞周期中Gl期向S期过渡的重要的调控因子, 它与CDK4 、6结合, 使Rb发生磷酸化而失活, 释放出转录因子EZF,转录因子进入细胞核内, 转录出介导Gl期向期过渡的调控因子。如果Cyclin D l过量表达, 则会导致细胞加速通过Gl期和S期。研究发现Cy-elin Dl 的降解是由于CDC34和SCFskpZ相互作用的结果。在Gl期, Cychn Dl定位于细胞核上;在S 期,Cychn Dl则定位于细胞质上。如果使定位于细胞核上的Cyclin Dl第268位上的氨基酸发生磷酸化, 则会使

过程所必需的。Ubp8与延伸中的RNA 聚合酶结合, 然后RNA 聚合酶与SAGA的一个亚基作用,共同进入开放性读码框区域。RNA 聚合酶既可与Rad6结合, 又可与Ubp8结合, 说明在转录延伸过程中可能存在多次泛素化和去泛素化。但这些因子是否同时与RNA 聚合酶发生尚不十分清楚。转录延伸过程中多次泛素化和去泛素化过程, 可使RNA 聚合酶的转录延伸过程间断性暂停,进而协调转录过程与mRNA 的加工过程。此外, 组蛋白H2B泛素化是RNA 聚合酶转录所必需的。体外转录延伸实验表明, H2B泛素化在FACT 促进RNA聚合酶在染色质上顺利延伸的过程中起辅助作用。FACT在RNA聚合酶催化转录过程中起着分子伴侣的作用, 当RNA 聚合酶在染色质上滑动时, FACT可使H2A /H2B二聚体与核小体核心短暂性解离, 使RNA 聚合酶顺利通过核小体而在染色质上延伸。

3．5．泛素化修饰与植物免疫应答

ET 参与多种生物胁迫应答, CTR1, E IN2和E IN3是ET 信号途径中的关键组分。植物对多种PAMPs的感知和病原菌感染能诱导乙烯生物合成。此外, ET 能通过NPR1精确调控拮抗激素SA 和JA 应答。泛素介导的蛋白酶水解在ET 识别、生物合成和信号传导等多个过程中发挥作用。尽管PAMPs的识别诱导ET 合成的具体机制尚不清楚, 但已有的研究表明, PAMPs 的识别能激活MPK 6, 而MPK6能通过磷酸化ET合成酶ACS2和ACS6, 阻止ACS2 和ACS6 被蛋白酶降解。同样, ACS4、ACS5 和ACS9 等其他型ACSs也受蛋白水解酶控制。最近的研究表明, E IN 3受MAPK 级联反应的调控。MPK6 能通过Thr 174 对E IN3进行

磷酸化, 该位点的磷酸化使E IN3更易于被SCFEBF1 /EBF2介导的途径降解; 而不依赖MPK 6的E IN3 中Thr592残基的磷酸化则能保护E IN3 不受降解。由此可ET信号途经与PAMP激发的信号途径之间的交互应答被认为参与乙烯应答元件结合因子ERF104的稳定性调节。对PAMP鞭毛蛋白flg22的保守肽段的识别能诱导ERF104 的磷酸化和从MPK6复合体的释放, 从而引起促进ERF104 的更新。另外, ERF104中磷酸化位点的突变能降低其稳定性, 也表明蛋白质的修饰对其泛素化和降解至关重要。

四．泛素-蛋白酶体途径与疾病 4．1．在肿瘤发病机制中的作用

泛素-蛋白酶体通路在肿瘤的发病机制中起重要作用。肿瘤可以起 因于癌基因蛋白/生长促进因子的稳定或由于肿瘤抑癌基因的不稳定。某些常规通过蛋白酶体降解的癌基因蛋白, 如果不能及时地从细胞中清除, 就会诱导细胞恶变, 如泛素结合的靶目标有N-myc, c-myc,c-Fos, C-Jun, Src及腺病毒E IA 蛋白等, 而一些抑癌基因的不稳定如p53和p27也已经证实与泛素化降解密切相关。正常细胞P53是一个半衰期很短的蛋白, 它通过Mdm2连接酶作用而经泛素化降解, 在某些肿瘤中, 常出现Mdm2 过表达, 从而引起P53降解, 细胞基因的异常扩增。如在高危险病毒株HPV 引起的宫颈癌中P53的水平是极低的, 体外和体内的实验证明高危险HPV 癌基因蛋白E6-16或18可通过HECT E3促进P53泛素化及降解, 而低危险株HPV E6-11则不引起P53降解, 也不引起细胞转化。细胞周期依赖激酶抑制因子P27是CDK2

/Cyclin E 和CDK2 / CyclinA 复合物活性的负调节因子,可阻止细胞从G1期进入S期。P27也是由泛素介导降解的。实验表明, 在肠癌、前列腺癌及乳腺癌中P27水平降低。P27 的低水平与肿瘤的侵袭性、肿瘤的恶性度、临床分期及不佳预后密切相关。动物实验证明, 肿瘤中SKp2, 一种F-box蛋白, 水平明显升高, 而后者可促进P27泛素化。其他如VHL基因蛋白的泛素化与肾透明细胞癌有关,BRCA1与乳腺癌的发生有关等。

4. 2 在囊性纤维化发病机制中的作用

囊性纤维化( cystic fibrosis)是一种先天性常染色体隐性异常的疾病。实验发现, 其致病原因之一是在肺和胰腺组织的腺体上皮细胞膜上有一蛋白, 即囊性纤维化跨膜调节因子( cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的合成减少。CFTR 是受泛素化调节降解的, 当其基因出现某一位点突变如在F508, 使CFTR 合成变异, 从而引起泛素化及降解增强, 上皮细胞膜的功能改变并引起囊性纤维化病变。

4. 3在神经系统疾病发病机制中的作用

近年来发现泛素系统也与神经细胞变性有关。如引起帕金森病的一个重要因子是Park in, 后者是泛素和蛋白的E 3连接酶, 能与E2 U bcH7和U bcH 8共同作用, 而且Park in 自身也是经泛素化调节降解, 一旦Park in变性, 影响某些蛋白降解, 就会引起多巴胺类神经元的毒性损伤而引起常染色体隐性少年型帕金森病( autosomal recessive juvenile park insom ism)。在A lzheimer病中神经纤维出现缠结和

老年斑, 与Tau蛋白磷酸化及泛素调节有关。免疫和炎症反应、肌肉疾病等都与泛素-蛋白酶体途径有关。

综上所述, 泛素-蛋白酶体途径是调节细胞内蛋白水平与功能的重要机制, 涉及许多重要的生理过程和许多疾病及肿瘤的发病机制。近20年来该领域的研究已取得很多令人鼓舞的成果和进展, 部分成果已开始应用到临床疾病与肿瘤的预防和治疗上。但另一方面, 仍有大量的问题和机制尚未清楚,有待进一步深入研究。 五．类泛素化修饰Neddylation

NEDD8 最初的报道是在小鼠胚胎的脑组织中高度富集的新的mRNA，RNA 印迹实验表明NEDD8 在发育过程中表达下调．在成人组织中NEDD8 在心脏和骨骼肌中特异表达．特异性抗体实验分析检测到NEDD8 可表达为6 ku 单体和与其他蛋白质结合的高分子质量聚合体或NEDD8 多聚体．免疫细胞化学实验表明，NEDD8 在细胞核中高度表达，在细胞质中表达相对较弱．相对地，泛素在细胞核和细胞质中表达基本一致．NEDD8 是由81 个氨基酸编码的蛋白质，它和泛素具有60%的一致性和80%的相似性，在酵母和植物中其同源基因被称为Rub1，它可以产生并且连接到少量的细胞内蛋白质上．NEDD8 和Rub1 的晶体结构已经被解析出来，总体结构与泛素相似，主要的区别仅在两者表面区域具有不同的静电势能面，所以与其他发现的类泛素分子相比，NEDD8 的结构与泛素是最为接近的，大多数真核生物(植物、动物、真菌) 中NEDD8 高度保守，因此NEDD8 在真核细胞中具有十分重要的功能．NEDD8 特异性地与底物蛋白相结合的修饰过程被

称为Neddylation．Neddylation 异常可以导致人类的神经行性疾病和癌症。

NEDD8 参与的生化反应过程是一系列独特的活化酶级联反应过程，最终使NEDD8与底物蛋白结合，完成蛋白质的修饰，从而调节细 胞活动．虽然NEDD8 研究在近10 年取得了很大的进展， 但是还有许多问题有待阐明．如Neddylation 的E2 酶只发现了一种UBC12，而泛素化有多种E2 酶，Neddylation 是否还有其他的E2 NEDD8 与泛素高度同源，已知的NEDD8 的E3 酶只有几个，并且目前发现的E3 只对部分底物蛋白是必需的，已知的能被NEDD8 修饰的蛋白质 也比被泛素修饰的蛋白质少得多，因此我们有理由相信还有更多的Neddylation 修饰相关的E3 连接酶有待发现．此外，NEDD8 参与的Neddylation 的过程关键位点是赖氨酸残基，该残基同时也可以发生 乙酰化、甲基化和泛素化，因此进一步探讨这些翻译后修饰的动态平衡与交互关系也将有助于更多地了解和阐明NEDD8 的生物学功能。 六．总结和展望

基因表达涉及到多层次多角度的调控，去泛素化酶作为一类重要的蛋白质水解酶类，在基因表达的调控中发挥了举足轻重的作用．一方面，去泛素化酶介导的转录因子稳定性调控毋庸置疑在基因表达调控中发挥核心作用．另一方面，组蛋白泛素化水平动态变化和多梳基因家族介导的基因沉默研究加深了我们对染色质3D 结构动态变化的理解，并涉及到基因表达活化和失活的多种机制．此外，宏观的基因表达调控涉及到的细胞周期调控和DNA损伤修复，二者通常与多种肿

瘤和癌症的发生发展有关，它们在更广阔的层面充分体现了DUB 对于基因表达调控的重要性．DUB 中的不同亚家族成员，尽管享有共同的保守型核心催化结构域，但由于其精细结构的不同而参与了基因表达调控的不同层面，并呈现出结构和功能的高度多样性．一方面DUB 在基因表达调控中靶向的生理底物种类繁多，许多重要的转录因子、细胞周期调节因子和损伤修复因子的DUB 有待发现和研究．例如最近热门的干细胞转录因子的稳定性研究有助于我们理解胚胎发育、细胞分化的基本过程，并为转化医学、组织工程提供助益．而且DUB 可以改变这些蛋白质的亚细胞定位，对于涉及到细胞生命活动的信号通路( 如MAPK、NF-κB、PI3K-Akt、Wnt、TGF-β 途径)的研究具有 指导意义．另一方面，调节DUB 表达活性和时空特异性的相互作用蛋白也越来越引起科学家们的关注，这往往比发现DUB 的底物本身更有价值．例如USP37 本身可以调控细胞周期，整个细胞周期进程中自身的动态变化也受到UPS 系统调节，USP37 在G1 晚期开始表达， 在G1 期早期被APC/C 泛素化，在G2/M 转换期被SCFβ-TrAP泛素化调节．有些DUB 如USP7 能定位到不同基因座位，并识别特定的DNA 序列，提示我们DUB 的特异性不仅体现在蛋白质稳定性调控的层次．此外，与DUB 有关的相互作用网络值得深入和系统的研究．目前已有数篇组学的文献报道了去泛素化酶相互作用网络图谱，并提出了调节去泛素化酶活性的新策略，为设计基于去泛素化酶靶点的抑 制剂药物提供了新思路．今后相关领域的研究有以下几个方面值得关注：a．新的DUB 的鉴定．建立去泛素化酶特征的金标准，利用组的

手段筛查去泛素化酶并进行合理的GO 分类，尤其是在基因表达调控领域的DUB．b．USP7 这类“全才型”的DUB 的存在，提示我们在基因表达调控水平上，“一专多职”的现象值得发现与归纳．c．从 USP 家族和OTU 家族诸多成员能同时识别K48 位和K63 位泛素链的特性，提示我们许多重要蛋白质既在蛋白质稳定上受到DUB 调控又在细胞学活性上受到其调控，如前所述，肿瘤抑制因子PTEN可被USP7 去除单泛素化修饰从而改变细胞学定位，而PTEN 作为抑癌蛋白，去除其K48 位蛋白稳定性的DUB 尚未报道，后者可能由于剂量效应 而具有更重要的生理意义．d．生理功能的系统性发现．对于去泛素化酶的重要调控因子和去泛素化酶的相互作用网络调控的进一步挖掘，并利用比较基因组学的思想，对于肿瘤、常见疾病的通路进行 分析，以发掘出新的药物治疗靶点。

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