AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

第 24 卷 第 7 期2009 年 7 月现 代 渔 业 信 息

MODERN FISHERIES INFORMATIONVol.24 No.7Jul., 2009

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

姚红伟 袁霞 付鑫

（大连水产学院生命科学与技术学院）

中国大连市黑石礁街52号 邮编：116023

景娜娜

（山西师范大学）

中国山西省临汾市贡院街1号 邮编：041004

【提要】 AFLP分子标记技术是DNA指纹技术的重大突破，由于其快速、简便、有效，因而在医学、农业、林业、畜牧业、渔业等领域中得到了广泛的应用。近年来人们不断地将这一技术完善和发展，使得AFLP成为迄今为止最有效的分子标记。本文简述了AFLP技术的基本原理、技术流程以及在水产动物中的应用情况。

姚红伟等，2009。AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用，《现代渔业信息》杂志，24（7）：22-24。

关键词：AFLP 水产动物 应用

扩增长度片段多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子该方法是继RFLP、标记方法，1993年获欧洲专利局专利，SSR和RAPD之后发展最快的DNA指纹技术，它结合了RFLP的可靠性和严格的PCR退火条件，有高度特异性，既克服了RFLP技术中Southern杂交的烦琐和耗时的缺点，又解决了RAPD等技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题。

［1］

提取方法有所不同。在提取过程中要特别注意避免基因组DNA的降解和其它物质的污染。

2.2 双酶切及连接

限制性内切酶的选择对AFLP分析的准确度具有关键性作用，其选择要根据分析对象的种类和所要达到的分辨度决定。可以采用单酶切，也可以双酶切或三酶切［3］，但一般多采用双酶切。双酶切的其中一种是稀有切点酶（Rare cutter），识别位点通常为6个碱基，如EcoR I、HindⅢ、PstI、Sac I、ApaI；另一种是多切点酶（Frequent cutter），识别位点通常为4个碱基，如Mse I和Taq I［4］。目前较为常用的两种酶仍是EcoRI和Mse I，基因组DNA用EcoRI和MseI双酶切可产生三种酶切片段：MseI-MseI、MseI-EcoRI、EcoRI-。EcoRI片段，实验证实扩增产物主要是EcoRI-MseI片段［5］

酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用下与两种内切酶相应的特定接头相连接，形成带接头的特异性片段。接头（Adaptor）一般是长度为14~18个核苷酸的人工合成的DNA双链，由两部分组成，一部分是核心序列（Core sequence），一部分是酶特定序列（Enzyme-specific sequence），能与酶切片段粘端互补。常用的多为EcoRI和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。

2.3 PCR预扩增

一般酶切片段要进行两次连续的PCR扩增，以提供大量的模板，并产生清晰、重复性高的扩增结果。第1次扩增为预扩增（Pre-amplification），AFLP扩增所用的引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列（Core sequence，CORE），限制性内切酶特定序列（Enzyme-specific sequence，ENZ）和3′端的带有选择性碱基的粘性末

［6］

端（Selective extension，EXT）。PCR预扩增的引物3′端具

1 AFLP基本原理

AFLP的基本原理是基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定的双链接头（Adaptor）连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列（Adaptor sequence）和PCR引物（Primer）3′末端的选择性碱基（Selective extension，ENT）的识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将特异的限制性片段分离开来，然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA指纹的多态性［2］。

2 AFLP技术流程

AFLP技术流程一般包括以下几步： 2.1 模板DNA的制备

在进行AFLP分析时，首先要提取高纯度的基因组DNA。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的

文稿收到日期：2009-05-29

作者简介：姚红伟（1981-），男，山西太原人，硕士研究生。研究方向：水产生物繁育。E-mail：yao_317@

有一个选择性碱基（EcoRI + A，MseI + C），通过预扩增对扩

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

增模板进行初步筛选，一方面可以避免直接扩增造成的指纹带型背景拖尾现象，另一方面可以避免直接扩增由引物3′端3个选择碱基误配形成的扩增产物。

2.4 PCR选择性扩增

预扩增产物经稀释后进行第二次扩增，即选择性扩增（Selective amplification）。使用的引物中含3个选择性碱基，可通过3个选择碱基的变换扩增（EcoRI + ANN，MseI + CNN），获得丰富的DNA片段。一般选择性扩增采用温度梯度PCR，PCR开始于高复性温度（多为65℃）增强选择性，随后复性温度经过循环逐步降低到稳定于复性效果最好的温度（多为56℃），并保持此温度完成其余PCR循环。

2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

选择性扩增产物一般在4%~6%的变性聚丙烯酰胺凝胶（ PAGE）上经过电泳分离，形成DNA 指纹，凝胶经过干燥、放射性自显影后即可进行结果分析。目前，用于AFLP技术的DNA多态性的检测，除了放射自显影技术外，主要是银染法、荧光扩增片段长度多态性检测和琼脂糖凝胶溴化乙锭染色法，对人体及环境的安全性较高。

在遗传连锁图谱的构建方面，由于AFLP技术呈孟德尔遗传，一次反应可以检测大量的多态位点，且不需预先知道研究对象的遗传背景，因此在对遗传背景了解相对较少的海洋生物中，被广泛应用于连锁图谱的构建。Kocher等发表了尼罗罗非鱼的第一个遗传连锁图，其中包括112个AFLP标记［17］。在虾类中，Moore等利用全同胞家系246个多态性的AFLP标记，构建了具有44个连锁群的日本对虾AFLP图谱，约覆盖整个基因组的57％，这是甲壳动物首次报道的连。在国内，岳志芹和李健等人也分别利用AFLP技锁图谱［18］

术对中国对虾遗传连锁图谱的构建进行了研究［19-20］，构建了中国对虾雌、雄性的遗传连锁图谱。在贝类中，Li等利用一回交家系，构建了太平洋牡蛎的遗传连锁图谱［21］。此外，喻达辉等人利用AFLP标记构建了印度合浦珠母贝全同胞家。目前，许多水产生物的遗传连锁图谱都系的遗传图谱［22］

是采用AFLP技术加以构建的。例如：虹鳟［23］和条斑紫菜［24］等。

在基因的定位及分离方面，由于AFLP技术具有强有力的多态性检出能力，通过比较种群内和种群间的AFLP指纹差异，可进行基因的快速定位，并能进一步将其分离出来。在斑马鱼、青鳉等模式动物中，已被广泛应用于筛选与生长、发育、抗逆等相关的功能基因［25］。Rubinstein等进行了斑马鱼的cyc野生型及cyc突变体的cDNA-AFLP分析，发现了两个新基因：Crestin和Calreticulin，并研究了它们在不同。Cui等运用cDNA-AFLP技术对组织及发育时期的表达［26］

红鳍东方鲀成熟和未成熟个体的逆转录DNA进行检测，发现了5个性别标记（TDF1-5）；其中前4个（TDF1-4）来自性腺，第5个（TDF5）来自尾鳍，因此，TDF5就可以用于快速鉴定红鳍东方纯性别，不必对鱼进行解剖［27］。

在种质资源鉴定方面，AFLP标记不受组织和器官种类、发育阶段、生境条件等诸多因素的影响，因此是用于种质鉴定、种质分类及种质亲缘关系研究的理想标记。Congiu L等用AFLP鉴定了纳氏鲟和美洲鲟杂交种［28］。Kim［29］等用AFLP分子标记结合表型分类法对海胆属的动物进行分类，用遗传距离系数和邻接分类法来构建系统树，发现海胆属内亲缘关系较近，种群间的遗传距离为种群内的3倍，因此建议将海胆属分为两枝，一枝包括Echinacea purpurea，E.sanguinea和E.simulate，另一枝为Echinacea taxa。国内刘必谦等人用AFLP技术对岱衢族大黄鱼进行种质分析。结果表明岱衢族大黄鱼可分为两类：岱衢族大黄鱼I型和岱衢族。此外，王志勇等人还利用AFLP指纹的比较大黄鱼Ⅱ型［30］

对我国养殖的四种鲍的亲缘关系进行了研究［31］。

3 AFLP标记技术在水产动物中的应用

AFLP是一种较新的分子标记技术，公开应用的时间不长，因此还未被广泛应用到水产动物研究的各个领域。但该标记具有良好地应用前景。目前，AFLP标记在遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、基因的定位及分离、种质资源鉴定等方面已得到了较为广泛的应用。

在遗传多样性分析方面，AFLP被广泛应用在那些无法通过形态特征加以区别的家系或近缘物种的系统发生关系的研究中，是生物多样性调查的重要工具［7］。周遵春等人利用AFLP对中间球海胆、光棘球海胆及杂交F1代群体遗传多样性进行了分析，结果表明群体内的遗传多样性比较丰富，尽管杂交海胆在表型上可以明显分成两种类型，但是通过AFLP 统计的遗传距离进行的个体聚类却随机聚在一起，不能分成两个群体。在鱼类的研究方面，徐冬冬等人应用AFLP技术对条斑星鲽、星斑川鲽及漠斑牙鲆的养殖群体进行遗传分析，结果表明，条斑星鲽和星斑川鲽养殖群体的遗传变异水平相对较低，而漠斑牙鲆的遗传变异水平相对较

［9］［10］［11］［12］高。除此以外，在皇姑鱼、紫红笛鲷、赤点石斑鱼

［8］

和松江鲈

［13］

等鱼类的遗传多样性研究中也有AFLP的应用。

在贝类研究方面，陈省平等应用AFLP技术对栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝等4种主要养殖扇贝的遗传多样性进行了分析，找到了21个种内特异性AFLP标记。彭永兴等人利用荧光标记扩增片段长和种间共享标记［14］

度多态性（fAFLP）技术对文蛤、青蛤、菲律宾蛤仔和硬壳蛤4种帘蛤科贝类的群体遗传多样性和种间关系进行了研究。结果表明文蛤与菲律宾蛤仔遗传关系最近，青蛤与其他3物种遗传关系较远。其它利用AFLP研究遗传多样性的贝类还有湖北钉螺［15］、马氏珠母贝［16］等。

4 结束语

虽然AFLP技术的过程复杂，基因标记获得的程序复杂，成本较高，而且扩增时有假阳性结果和假阴性结果的出现，以及凝胶背景杂乱等缺点。但是由于具有多态性高、DNA用量少，检测效率高、可靠性好，分辨率高、能分析克

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

34-38.

隆片段、稳定的遗传性和选择上为中性的优点，并且随着人们对其认识的加深、实验条件的逐步规范化和一些相关检测技术的进一步完善。AFLP技术必将在更多领域得到广泛的应用。

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AFLP Molecular Marker Technique and Its Application

In Aquatic Animals

Yao Hong-wei，Yuan Xia，Fu Xin

（College of Life Science and Technology，Dalian Fisheries University，Dalian，Liaoning 116023，China）

（Shanxi Normal University，Linfen，Shanxi 041004，China）

Jing Na-na

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ksd1.html