拟南芥突变体的筛选与鉴定综述

本科生文献综述

题 目

拟南芥突变体的筛选综述

系 别

林学与园艺学院

班 级

姓 名

园艺102班

唐辉

学 号 103231228

答辩时间 年 月

新疆农业大学 林园 学院

拟南芥突变体的筛选综述

唐辉 指导老师：王燕凌

摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。 关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究

Screening Summary of Arabidopsis Mutants

Tang Hui Instructor:Wang Yanling

Abstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screening

proposed resilience of Arabidopsis mutants.

Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research

拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。它是分子生物学研究的模式植物，它的完整基因组已被成功测定。近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。鉴于拟南芥在遗传操作上所具有的优势，它已广泛应用于植物整个生命活动各个过程的研究，为新基因及基因功能等方面的研究提供了很多依据。 1. 拟南芥抗旱突变体的筛选

张娇娇[1]在拟南芥突变体的筛选研究中采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫，以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体库中筛选抗旱突变体，筛选出2株候选突变体，最终得到1株稳定突变体vem1，通过表型和生理生化鉴定，确定为抗旱突变体。该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础，对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义。

实验所用拟南芥（Arabidopsis）生态型为Columbia，野生型(WT)和突变体（Mutant）来自美国拟南芥种质资源中心[2]，实验采用2种方法培养植株[3-4]。分别是培养基培养与土壤培养，而培养基培养的方法是将种子经0.1％Hgcl2消毒3min后，用无菌水冲洗4～5次，然后将种子点种在加入1.5％蔗糖和0.8％琼脂的培养基中；并用封口膜封装于4℃条件下处理2d后转至光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2温度22～23℃的培养室。土壤培养是将幼苗移至装有混合好的灭菌营养土的盆钵中，置于光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2、温度22～23℃的培养室内，移栽和开花时各浇1次营养液，并根据植株生长需要浇以适量水。土壤培养是将种子播种于装有灭菌土的盆钵中，浇含有不同浓度甘露醇的营养液，置于光周期16h光/8h暗、光照100μmol·m-2·s-2、温度22～23℃的培养室内培养。

确定抗旱突变体的筛选浓度将野生型拟南芥种子分别点在甘露醇浓度为250、300、350、400mmol/L的MS培养基上，每个浓度3个培养皿，每个培养皿中播种50粒种子，成5×10矩阵，水平放置培养。经过4℃冰箱黑暗2d春化、光照

培养7～10d后，记录发芽率。以野生型几乎不能发芽或者发芽不能存活的甘露醇浓度为临界筛选浓度。再以确定的筛选浓度配制培养基进行筛选。培养皿中央点野生型种子作为对照，其余部分点突变体种子，水平放置培养。定期观察并拍照，若有能生长的突变体幼苗，作为候选突变体，将之移栽到土壤中培养。 2. 拟南芥耐硒突变体的筛选

慈凌坤[5]在拟南芥耐硒突变体筛选研究中采用不同质量浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3)对拟南芥突变体库中的2121株拟南芥进行筛选,筛选出29株候选突变体，最终得到2株稳定突变体vse1和vse2，通过表型鉴定和生理生化鉴定确定是突变体。该研究为耐硒基因克隆及功能分析奠定了基础,对于揭示植物耐硒的分子机理具有重要的理论意义。

实验所用材料是拟南芥(Arabidopsis)生态型为Columbia,野生型(WT)和突变体(Mutant)来自美国拟南芥种质资源中心。实验采用2种方法培养植株：①培养基培养:种子经0.1%HgCl2消毒3min后用无菌水冲洗4～5次，将种子点种在1.5%蔗糖和0.8%琼脂的培养基中；并用封口膜封装,于4℃条件下处理2d后转至光照为100μmol·m-2·s-2 、温度为22～23℃的培养室中。②土壤培养：种子播种于装有土壤的盆钵中，置于光周期为光照16h, 黑暗8h、光照为100μmol·m-2·s-2 、温度为22～23℃ 的培养室内, 播种和开花时各浇1 次营养液, 并根据植株生长需要浇以适量水。

通过培养实验确定50mg/LNa2SeO3为筛选质量浓度后。在普通MS培养基上点种，育苗7d后移入50 mg/LNa2SeO3选择培养基，以根长作为筛选指标,选择根长明显长的作为候选突变体。 3. 拟南芥耐低钾突变体筛选

3.1 不同钾浓度的低倍钾对拟南芥生长的影响

蒋春运[6]为了探讨筛选耐低钾突变体的最优条件，比较了5种琼脂粉(糖)及不同钾浓度的低钾培养基对拟南芥生长的影响。结果表明:添加Seakem LE agarose培养基的钾离子浓度为43.07Lmol/L；钾离子浓度在60、80、100、120、160μmol/L 时,拟南芥弯根长度显著或极显著高于在40Lmol/L时，因此40Lmol/L左右可作为耐低钾突变体的筛选标准。

植物材料为Wassileskija生态型的拟南芥。基本培养基为1/2MS培养基，筛选培养基为含有不同琼脂粉(糖)的MS低钾培养基和含不同钾离子浓度的MS培养基。5种琼脂粉(糖):Agar D、Agar B 为Bio Basic USA Inc 生产，普通琼脂粉为北京奥博星生物技术有限责任公司生产，Seakem LE agarose为瑞士Lonza E生产,Invitrogenagarose 为美国invitrogen生命技术公司生产。

在实验过程中首先要对种子消毒、播种与培养条件次氯酸钠表面消毒15min(期间多次颠倒混匀)，再用无菌水冲洗5～6遍。播种前种子与0.15%(m/v)琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出,成行地播种于1/2MS 培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化2d,之后转入培养室中光照培养，培养皿垂直放置。待根长至2cm时,将拟南芥幼苗转移至相应的低钾培养基上倒置培养，观察拟南芥根的弯曲情况。培养室温度22～24℃，照条件：16h光照,8h黑暗,光强100μmol·m-2·s-2。不同品牌的琼脂粉(糖)钾离子含量的测定方法5种不同琼脂粉或琼脂糖各称取0.25g放进坩埚中,在马弗炉中首先在300℃中灰化2h，然后再500℃灰化10h，灰分用硝酸溶解,加纯净水定容到10mL，用火焰光度计进行钾离子含量的测定。每个样品3个重复。

拟南芥根生长测定方法将根长2cm的拟南芥幼苗分别转移到含有5种琼脂粉(糖)的低钾培养基上，培养基中的钾由琼脂粉(糖)提供。倒置培养,培养条件同上。10d之后观察测定幼苗的弯根长度，比较拟南芥在不同琼脂粉(糖)低钾培养基上的生长情况。每处理3个重复，每个重复16株拟南芥幼苗。根据上述结果选择合适的琼脂粉(糖)用于配制低钾培养基，外加KNO3调节钾浓度，分别配成总钾离子浓度为40、60、80、100、120、140、160、180μmol/ L的低钾培养基。将根长2cm的拟南芥幼苗从1/2MS培养基转移到含不同钾离子浓度的低钾培养基上,倒置培养，6d之后统计幼苗弯根长度。每个浓度处理3次重复，每个重复16株幼苗。 3.2 利用甲基磺酸乙基（EMS）处理拟南芥种子

赵淑清[7]利用经甲基磺酸乙酯( EMS)诱变处理的拟南芥种子，接种于MS培养基上，垂直放置培养4天后,将幼苗转移至胁迫培养基中，以倒置幼苗180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体利用这种方法，成功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。

以拟南芥( Arabidopsis thalianacv. Landsbergerecta)为材料，对植物体进行诱

变，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒)野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃下放置12小时后，把种子转移到盛有30ml100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)的100ml三角瓶中，加入0. 2%(v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)，封口后放在水浴(25℃)振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次,每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。将经EMS诱变处理后的拟南芥种子(M1)播种于用1/4Hoagland营养液浸透的混有蛭石的营养土中(营养土: 蛭石= 2: 1，v/v)，种植后覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度18～22℃光照强度120μmol/ m2·s1、光暗周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子(M2代)。

将所收种子进行培养、接种并筛选出所需要的植株。具体方法有以下三点（1）基本培养基:：MS培养基，1.0%琼脂(w/v)，pH 5.7。选择培养基(实验是去钾培养基)：大量元素(单位mg/L)NH4NO3 2350，NH4H2PO4 144，CaCl2-2H2O 440，MgSO4·7H2O370，微量元素同MS培养基，去K+琼脂1.2%(w/v)，蔗糖3%(w/v)，pH 5.7(Tris- HCl调节)。（2）接种方法：与培养条件拟南芥种子用0.5%(v/v)次氯酸钠加0.1%(v/v)Tr-iton X-100表面消毒10分钟,再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%(w/v)低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22℃，连续光照,光强30μmol/m2s- 1。(3) 根弯曲试验：将经过灭菌的野生型种子接种于MS培养基中，在光照培养箱中( 条件同上)培养4天，待幼苗根长至1～1.5cm时，再将幼苗转入含有系列不同K+浓度的低钾培养基中，排列成行，然后将培养皿倒置，使根尖朝上，继续培养。如根能够继续生长，则生长的根会由于重力作用而向下弯曲。以野生型拟南芥幼苗完全不能生长(根不发生弯曲)的K+浓度作为突变体的筛选浓度。(4)突变体筛选：在确定的选择压力下，利用上述根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再转入含0.6% 琼脂(w/v)的MS培养基中，根尖朝下培养一周左右；然后转入含有蛭石的营养土中培养，以收获M3代种子。M3代种子再进行上述低钾条件下的根弯曲试验。若某一株系的M3代幼苗仍表现耐低钾性状，则将其确定为耐低钾突变体。 4. 拟南芥抗氧化突变体筛选

蒋春云[8]建立筛选拟南芥抗氧化突变体的条件。将灭菌的野生型拟南芥种子播种于MS培养基上，4℃层化2d，并于23℃培养室中垂直放置培养4d后，将幼苗

转移至含有不同浓度的甲基紫精(MV)胁迫培养基中，倒置培养，比较不同MV浓度下根的弯曲生长情况，以根停止弯曲生长的MV浓度作为抗氧化胁迫突变体的筛选条件。野生型拟南芥幼苗的根在MV浓度为0.7μmol／L时受到明显抑制，停止生长；在MV浓度低于0.7μmoL／L时能正常生长或被轻微抑制。确定筛选抗氧化突变体的MV浓度为0.7μmol／L。

确实抗氧化突变体的MV浓度后在基本培养基为MS培养基中培养。筛选培养基:在MS培养基中加入不等量的MV，使培养基中的MV终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9μmol/L。点播前需要对种子消毒后再进行播种以及适合的培养条件。其具体方法是将拟南芥种子先用浓度75%乙醇消1min，然后用浓度1%次氯酸钠表面消毒15min(期间多次颠倒混匀)，再用无菌水冲洗5～6遍。播种前种子与0.15% (质量浓度)琼脂糖混合，用吸管将种子吸出，成行播种于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱层化2d，之后转入培养室中光照培养，培养皿垂直放置。培养室温度22～24℃，光照16h/d，光照强度110μmol/(m2·s)。

将上述在培养室中生长4d，根长至1.0～1.5cm的拟南芥幼苗转入含有系列不同MV浓度的培养基中，排列成行；将培养皿倒置,使根尖朝上继续培养。如果根能够继续生长,则生长的根会由于重力作用而向下弯曲。以野生型拟南芥幼苗根生长完全受抑制的MV浓度作为抗氧化突变体的筛选浓度。 5. 拟南芥晚花突变体的筛选

在植物的生命周期中从营养生长到开花是发育过程的重要转折，花启动的时机对生殖生长的成功至关重要。植物开花时间突变体的获得，在揭示植物花发育的奥秘中起了十分重要的作用。曾群[9]以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料，将野生型拟南芥(Columbia生态型)的种子用甲基黄酸乙酯(EMS)诱变处理，将经诱变处理的种子M1播种收获M2种子用于突变体筛选。以初生莲座叶片数作为筛选指标,筛选出一株晚花突变体，命名flx(flowering locusx)。

供试材料是拟南芥( Arabidopsis thaliana Columbia erecta)种子用0.5%次氯酸钠加0.1%TritonX-100表面消毒10min，再用无菌水冲洗3遍，接种于MS培养基上。将培养皿置于4℃冰箱处理48h之后转入光照培养箱培养。培养1周后转入人工土壤(营养土∶蛭石= 2∶1)中继续培养,培养室温度18℃～22 ℃，光照强度100mol/(m2·s)，光暗周期16h/ 8h。并以拟南芥为材料，用0.2 % (v/v)的甲基磺酸

乙酯(EMS)进行诱变处理。经EMS诱变处理后的种子为M1代。对M2代植株进行筛选，将筛选得到的可能突变体单株收获种子M3代。为了得到可以稳定遗传的突变体，必需连续进行2次～3次筛选。而植物开花时间是根据植物的花梗自初生莲座叶片中央伸出0.5cm～1cm时莲座叶片数(LN)来计算的。所以LN值是植物开花早晚的一个重要标志。最后实验统计了36株(符合统计学要求的株数) 野生型拟南芥的LN值和开花天数，计算出LN和开花天数的平均值和标准误。将LN的平均值作为区分突变体与野生型的筛选指标。

通过分析得出筛选指标是在育苗盘中种植36株野生型Col拟南芥。通过调查统计36株拟南芥植株抽苔天数和莲座叶片数平均值表明:野生型的种子萌发后约25d初生莲座叶中央开始抽苔,当初生莲座中央的花梗长出0.5cm时(营养生长转变为生殖生长的标志)野生型植株的初生莲座叶片数为10片左右。根据野生型拟南芥种子萌发后约25d开始抽苔,此时莲座叶片数为10片左右的实验结果,我们把莲座叶片数大于15片作为晚花突变体的筛选指标。并以此指标在普通培养基中播种M2，对M2植株不同表现型进行筛选,共筛选到14株可能的晚花突变体。待14株可能的晚花突变体成熟后单株收获种子M3代(将每个离心管中的种子编号)。接着将14株M3代种子以相同的培养条件分别播种，结果只有一株突变体的莲座叶片数符合突变体的筛选指标(大于15片),收获该株种子M4代。将该M4继续播种，仍能稳定遗传，说明该突变体是可以稳定遗传的晚花突变体，我们将该突变体命名为flx(f lowering locus x )是所筛选的结果。 6. 拟南芥耐盐突变体的筛选

吕思敏[10]在耐盐突变体的筛选实验中采取在高盐平板上萌发的方法，对一个雌激素诱导激活型拟南芥突变体库进行了耐盐突变体的筛选，最终得到了2株稳定的耐盐突变体。对其中的一株耐盐突变体,命名为stg2( saltto lerance during germ ination2)，进行了研究。遗传实验表明它的耐盐特性是受雌激素诱导的，是功能获得型的耐盐突变体。实验中还探讨了stg2突变体的筛选过程及耐盐生理特点。

土壤盐渍化是限制农作物生长和增产的最主要的环境因素。不合理的灌溉和工业的不断发展，还在加速这种趋势。因此耐盐植物的筛选培育是十分重要的。植物的耐盐性状是由多基因控制的复杂性状，通过筛选耐盐或盐敏感突变体，可

以分离耐盐基因并了解它们在植物中的耐盐机理。在拟南芥中，已分离到一些能在高盐条件下萌发、生长的突变体, 如RS、rss、sa 和pst1【11】突变体，但目前还没有分离到这些突变体的耐盐基因。一些ABA合成缺陷的突变体也表现出一定程度的耐盐性【12】另外，Wu等用诱变的拟南芥幼苗筛选得到了一些盐敏感的突变体，命名为sos ( salt overly sensitive) ，并已克隆到了它们的基因。但这些有限的盐信号突变体对于深入理解植物的耐盐机制还远远不够，因此，还有必要采取一些新的方法来筛选更多的耐盐或盐敏感突变体，并阐明它们的耐盐机制，为最终改良农作物的耐盐性状积累研究数据。越来越多的研究数据，在种子萌发阶段耐盐相关的QTLs，与它们在早期生长阶段耐盐相关的QTLs不一样；通过萌发方法在高盐平板上得到的耐盐突变体在营养生长阶段并不一定耐盐,，如前面提到的RS、rss和san突变体。虽表明，植物的耐盐是与发育过程相联系的。植物在某个生长阶段耐盐并不一定意味着它在其它生长阶段也耐盐[13]。在大麦 、番茄和拟南芥中然有许多证据说明植物在种子萌发阶段有特殊的耐盐机理，但很少有耐盐基因被克隆出来，这可能归因于克隆突变基因比较困难，因为种子的萌发是个数量性状，在萌发水平上进行遗传分析要做大量的统计学分析，十分复杂也容易出错。本实验采用了一种新型的拟南芥突变体库来筛选在萌发水平上耐盐的突变体。这个突变体库是通过农杆菌的介导，将基于雌激素受体的化学诱导激活标签系统pER16转入拟南芥中得到的。我们对前期得到的18,000个株系的约180,000粒T2代种子在高盐平板上进行了耐盐突变体的筛选，得到两株稳定的耐盐突变体， 分别命名为stg1和stg2( salt to lerance during germ ination 1and2)。stg1的耐盐基因编码AtTAF10，它是转录起始复合物TFIID的一个亚基，可能参与了种子萌发阶段的一些耐盐相关基因的转录起始调控。本实验中重点探讨了stg2的筛选以及耐盐生理特点。

在实验中所需植物材料是拟南芥( Arabidopsis thaliana) Columbia生态型。生长条件：温度22℃左右,湿度80%，光周期为16h光照/8h黑暗。采用的化学诱导激活标签系统是转化载体pER16[14]，(由中科院遗传所左建儒研究员提供)化学诱导物为雌激素(B- estriol)。采用的拟南芥转化方法是floraldip方法，转化用的农杆菌菌株为GV3101。从18，000株转化了pER16载体的转基因株系的T2代种子中取出约10粒种子/每株系，共约180，000粒种子，每500株的种子混在一起，用于耐盐

突变体的筛选。种子的消毒。种子在EP管内经体积分数70%乙醇漂洗1min，无菌水洗1～2次，含有体积分数0.02% Triton- 100的5%次氯酸钠浸洗5min，无菌水洗3～5遍，最后加入质量分数0.1%的琼脂糖重悬，将用于实验耐盐突变体的筛选。突变体的初步筛选是采用高密度种植( 5,000粒/150mm平皿)。将转化pER16载体的T1代转基因株系的种子(T2代种子)表面灭菌后，通过质量分数0.1%的琼脂糖均匀悬浮后铺在高盐平板(5mol·L- 1B- estriol、250mmol·L- 1 N aCl、MS固体培养基)上。4℃放置4d后移入温室培养，14d后将子叶完全伸展并且为绿色的幼苗移入正常MS培养基上适应1d后，转移到蛭石中生长。耐盐突变体的复筛。收获初筛得到的可能的耐盐突变体的种子(T3代种子)，25℃干燥2d；将这些突变体的种子和野生型种子在正常MS培养基上共同萌发，确定种子活力正常后，在加了200mmol·L-1NaCl和5mol·L- 1雌激素的MS平板上进行共萌发，以鉴定突变体是否为稳定的耐盐突变体。对于突变体的进一步鉴定采用的是低密度种植( 150～200粒/100mm平皿)。将最终稳定的耐盐突变体在加了5mol·L- 1雌激素和不加雌激素的150mmol·L-1NaCl平板上进行共萌发实验，以测试它们的耐盐特性与雌激素的诱导关系。

突变体在各种盐分和甘露醇胁迫下的萌发基本过程是将种子消毒后铺在添加了各种化学物质的MS固体培养基上(含有质量分数2%蔗糖、1.0% 琼脂粉、pH 5.7)。培养基中添加的化学物质浓度为NaCl( 0～200mmol·L- 1 )、KCl(0～175mmol·L- 1 )、N a2 SO4 (0～125 mmol·L- 1 )、LiCl( 0～15mmol·L- 1 )和Mannitol (0～500 mmol·L- 1 )。待灭过菌的培养基温度降到50℃左右时,在超净工作台上加入5.0mol·L- 1的雌激素。平板在4℃黑暗放置4d后移入光照培养箱培养，温度为22℃左右，光周期为16h光照/8h黑暗，14d后统计已完成萌发生成的幼苗数，计算萌发率。 结论

国内有关拟南芥的研究主要集中在拟南芥突变体的抗氧化、耐低钾、耐盐筛选与鉴定方面，研究方法主要有模拟逆境环境与利用化学元素对拟南芥突变体作用影响来筛选等。可是对拟南芥抗热抗涝及抗寒等逆境方面研究不足，多数研究是局部的、个案的，有关抗旱抗热的研究文献较少，特别是拟南芥抗旱及抗旱基因方面的研究缺乏，而针对拟南芥抗旱的研究在干旱地区农作物的生长生育方面

具有重要意义为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础，对于揭示植物抗旱的分子机理具有重要的理论意义，需要深入的探索。 参考文献

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kqwo.html