细胞及细胞工程实验

实验一细胞的凝集反应

一、实验目的

了解细胞膜的表面结构； 二、实验原理

凝集素是一类可逆结合特异糖基的蛋白质，能与细胞外被的寡糖链相连接，使细胞发生凝集。 三、实验用品

1 ．器材: 显微镜、天平、载玻片、滴管、离心管、烧杯、10ml移液管、试管、试管架 2 ．材料: 土豆块茎、 2％鸡血红细胞 3 ．试剂: 抗凝血剂（ 3.8%柠檬酸钠）、PBS缓冲液（pH 7.4 0.2mol/L Na2HPO4 49ml + 0.2mol/L NaH2PO4 51ml, PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用）、0.17mol/L氯化钠。

四、实验步骤

1２％鸡血红细胞悬液制备

取已加抗凝剂的新鲜鸡血1 mL，加等量生理盐水轻轻混匀后2000 r/min离心５ min，重复3次，按红细胞压积用生理盐水配成２％鸡血红细胞悬液（淡红色）。 2 土豆凝集素制备

土豆２克切成薄片后加10 ml PBS，浸泡0.5-2 h（写具体时间，80min） 3 细胞凝集反应

制备不同浓度梯度的红细胞液：取1ml已制备好的2%的鸡血细胞悬液，通过系列稀释将血细胞悬液制备成不同浓度：在1ml的试管上编号为2%；在标号2%的试管中取0.5ml于另一只试管中，在试管中加入0.5ml生理盐水，混合均匀并编号1%；在1%的试管中取0.5ml的细胞悬液于另一只试管中，并加入0.5ml的生理盐水，混合均匀编号0.5%；

梯度稀释制备不同浓度的土豆悬浮液：取1ml的土豆凝集素悬浮液原液于其中一只试管中，并编号1×；另取0.5ml的土豆悬浮液原液于另一只试管中，加入0.5ml的PBS缓冲液，并编号0.5×；再取一只试管，加入1ml的PBS缓冲液，并编号0×； 土豆凝集素１滴、２％鸡血红细胞液１滴

载玻片上混匀，静置２０min（写实际时间，5min） 思考题：

1、生理盐水可以用蒸馏水代替吗？为什么？

不能用蒸馏水代替。生理盐水的渗透压与血浆的渗透压相当，用生理盐水是为了维持渗透压，保持细胞正常形态,防止发生细胞破裂。

2、如果你在显微观察时，看到很多碎片状小块发生凝集，而不是圆形的细胞，请分析可能导致这种现象的原因

可能是盖玻片压片时细胞破碎

实验二 MS培养基的配制

一、实验目的

了解MS培养基的组成、掌握MS培养基的配制方法 二、实验原理

植物生长发育需要多种营养成分，在配制之前，将各种成分按要求的比例，先配制成一定浓度的母液，方便保存和操作 三、实验用品 各种试剂

天平、高压灭菌锅、电炉、烧杯、pH试纸、容量瓶、量筒、移液管 四、实验步骤

1、配制几种母液

（1）配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取

名称 NH4NO3 KNO3 MgSO4·7H2O 重量 165g 190g 37g 名称 KH2PO4 CaCl2·2H2O 重量 17g 44g

各自配成1L的母液。各自倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液

一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）

名称 KI 重量 0.083g 名称 Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O 重量 0.025g H3BO3 MnSO4·H2O ZnSO4·7H2O 0.62g 1.69g 0.0025g 0.0025g 0.86g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

注：CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取CuSO4·5H2O 0.05g，CoCl2·6H2O 0.05g，各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液

一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）

名称 肌醇 烟酸 重量 10g 0.05g 名称 重量 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g 甘氨酸 0.2g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （4）激素母液的配制

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。 2、配制培养基

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作： 1）. 先在烧杯中放入一些蒸馏水。 2）. 分别取上面八种母液10ml倒入。 3）. 一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。 4）. 加蒸馏水用量筒定溶至1L。

5）. 按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。 用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确）可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

①当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 ②当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

6）. 称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

7）. 稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

8）. 放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

实验三植物组织培养（外植体的处理与愈伤组织的诱导）（开放）

一、实验目的

了解植物组织培养的基本原理，掌握培养基配制和消毒、植物材料的处理、接种等基本技术。 二、实验原理 植物细胞的全能性 三、实验用品

器材：超净工作台、培养架、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。 试剂：20%次氯酸钠、70%酒精、无菌水、培养基母液。 材料：菊花的茎段与叶片 四、实验步骤

1、培养基配置：诱导愈伤组织的培养基为：2,4-D0.5mg/l+NAA0.5-1mg/l+6-BA2mg/l+水解乳蛋白500mg/l 3%蔗糖+0.8%琼脂（金盏菊）,pH 5.8。

2、叶片的消毒：取幼嫩叶片用自来水充分洗净后，经75%酒精消毒30s, 20%次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗5-6次后，去掉主叶脉和大的侧叶脉，将叶片切成1.0-1.5cm2的小方块。

3、接种：用75%酒精擦洗接种台表面，解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后轻轻打开封口膜，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌，同时把长镊子也放在火焰上方灼烧，

将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝，用镊子取出处理好的叶片，背面朝下放到培养基表面。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。然后用封口膜封口，待所有人完成实验后，将其放入培养箱内进行培养，在培养箱内，分班做好标记（标记内容包括：班级名称、接种日期、接种数量、培养基类型等）。

4、注意事项：消毒以后的所有操作过程，都应在超净工作台上进行，操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后再切割。 注意：

（1）从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。

（2）外植体要选用两种消毒剂交替浸泡，初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见表1。

（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。且操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。 （4）接种前培养基出现大量污染现象要区分原因。

（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀，主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台出现故障等原因引起。应保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15-20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。

（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-15 min，自来水冲洗0 .5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。 五、实验结果 接种后污染调查

观察接种后第７天的污染情况，填入下表：

接种日期

培养基种类

接种数

污染率

生长情况

表1 植物组织培养中常用的消毒剂

消毒剂名称

使用浓度（%） 去残留难易

灭菌时间

（min） 0.1～3 2～15 5～30 5～30 5～30

消毒效果

乙醇 氯化汞 漂白粉 次氯酸钙 次氯酸钠

70～75 0.1～0.2 饱和溶液 9～10 2

易 较难 易 易 易

好 最好 很好 很好 很好

过氧化氢

10～12 最易 5～15 好 六、思考题 1、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？有时候会在消毒溶液中加入1～2滴的表面活性物质，例如吐温80或吐温20，为什么？

消毒水都具有很强的烧蚀性,在杀灭细菌的同时,也会作用于正常的细胞组织,影响正常细胞的成长或再生,所以外植体消毒后一般要用无菌水漂洗，以清除残留的具有杀伤力的消毒剂。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。

2、在接种过程中，通过哪些措施防止细菌对接种工具\\接种材料的污染？ ①认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌

②改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌 ③操作人员严格遵守无菌操作规程

④培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量 ⑤在培养基中加入适量的抗生素

⑥利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗 ⑦利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长 ⑧减少培养基中的某些有机成分，可抑制微生物的生长繁殖

实验四细胞膜的渗透性

一、实验目的

了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 二、实验原理

1溶血现象可作为物质是否进入红细胞及测量物质进入红细胞速度的指标。

2红细胞置于等渗溶液中，溶质分子进入细胞，使细胞内渗透活性分子的浓度改变，继而导致水的摄入，使细胞膨胀，细胞膜破裂，发生溶血。

3不同溶质分子进入细胞膜的速度不同，发生溶血所需的时间也不同。

4红细胞的溶血时间与溶质分子的极性、分子大小有关；同时细胞膜对进入细胞分子的选择性也对溶血现象的发生起重要作用。

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