产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定

4881（2011）03-0006-03文章编号：1009-DOI：10．3969/j．issn．1009-4881．2011．03．002

产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定

陈

燕，王小芬，金

伟，胡申才，曾

驰

（武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

摘

要：在长期有腐烂植物的潮湿处采集8种样品，用羧甲基纤维素液体培养基富集培养，分

离得到34株产纤维素酶的霉菌。利用刚果红染色法对所得菌株进行染色并以水解圈/菌落直

径大小为筛选标准进行初筛，得到11株菌。再用DNS法测定初筛所得菌株发酵液中纤维素

wx1005，酶的活力，得到两株纤维素酶活性较高的菌株wx0503、其发酵液纤维素酶活力分别可47．46U/mg。此外，达31．31U/mg、用苏丹混合液染色法对初筛所得到的产纤维素酶菌株染

wx1007。色，镜检观察其产油脂情况，得到2株产油量较大的纤维素酶产生菌株wx0403、关键词：纤维素酶；真菌；酶活；油脂

中图分类号：Q939．96

文献标识码：A

Screeningandcharacterizationofcellulase－producingfungistrains

CHENYan，WANGXiao－fen，JINWei，HUShen－cai，ZENGChi

（SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering，WuhanPolytechnicUniversity，Wuhan430023，China）Abstract：Inthisstudy，eightsampleswerecollectedfrommoistenvironmentswithplantsdecaying，inwhichthirty－fourcellulase－producingfungistrainswereisolatedthroughenrichmentculturingbyCMC－Naliquidmedium．Thesecellulase－producingfungistrainswerethenscreenedusingcongoredstainingandelevenstrainsproducingbighydrolysiscirclewereselected．Subsequently，theDNSmethodwasemployedtoscreentheselectedstrains．Twostrains，wx0503andwx1005，wereshowntoproducethehighestcellulaseactivity，whichwere31．31U/mgand47．47U/mg，respectively．Besides，sudanmixturestainingwasperformedtoevaluatetheoilproductionbythecellulase－producingstrainsandtwostrains，wx0403andwx1007，wereselected．Keywords：cellulase；fungi；enzymeactivity；oil4糖苷键连接纤维素是由葡萄糖残基以β－1，［1］

而成的高分子聚合物。纤维素是生物圈里最丰富的有机物质，是植物细胞壁的主要成分，也是绿色

［1］

植物光合作用的主要产物。全世界每年产生的纤维素大部分以焚烧的形式处理掉，这不仅造成大量资源的浪费还造成环境污染。纤维素完全降解后

的产物葡萄糖是食品、饲料、燃料和化学原料的重要

来源。假如人类掌握了经济的水解纤维素的技术，不但可以提高纤维素的利用率，而且还可以减少森林工业、农业、造纸工业、木材加工业以及纺织工业所产生的废料对自然环境的污染。近几年来，随着人口增长、粮食短缺、石油危机的出现，将纤维素水

04-08．收稿日期：2011-E－mail：541565140@qq．com．作者简介：陈燕（1990－），女，本科生，

E－mail：zeng_chi@yahoo．com．cn．通讯作者：曾驰（1980－），男，讲师，

基金项目：湖北省教育厅科学项目（B20111701）；武汉工业学院校立科研项目（2009Q08）；武汉工业学院校级大学生创新性实验计划

项目（CX200909）．

解为小分子单糖再通过微生物发酵生产各种有用的

［1］

产品显得尤为重要。

纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖

［2］

又称纤维素酶系。纤维素酶的的一种复杂酶系，

来源也很广。大多数纤维素酶主要来自种类繁多，

［2］

微生物体。目前，人们对各种微生物（包括真菌和细菌）的纤维素酶的关注较多，尤其是源于真菌的纤维素酶。所有能分解微晶纤维素的真菌，均能或多或少地分泌纤维素酶，所以纤维素酶的真菌源非常广泛。而真菌中的霉菌由于纤维素酶产量高、活性高，因此成为目前纤维素酶的主要生产菌［2］

种。发展具有自主知识产权的产纤维素酶霉菌菌种是近年来的研究热点。

本研究使用羧甲基纤维素液体培养基富集培养

分离得到34株产纤维素酶的霉菌。使用环境样品，

得到2株纤维素酶刚果红染色初筛和DNS法复筛，

wx1005。同时还使用苏活较高的霉菌菌株wx0503、

丹混和液染色检测初筛所得到的产纤维素酶菌株，

筛选得到2株纤维素酶活与产油量均较高的霉菌菌wx1007。株wx0403、

染色30上加入浓度为0．5%的刚果红溶液3mL，

，1mol/L的NaCl溶液彻底洗去染液，再用5%（m/v）的醋酸固定颜色。若霉菌产生纤维素酶，则在菌落的周围会出现清晰的透明圈。以透明圈直径与菌落直径之比的大小为参考指标对菌株进行初筛：比值大的证明该菌株的纤维素酶产量高；反之，则证明该菌株的纤维素酶产量低，可以将其剔除掉。

1．4可降解纤维素真菌的复筛

将参照菌株及初筛获得的纤维素钠水解圈/菌

28落直径比值较大的菌株接种到PDA培养基上，℃培养4—5d进行活化，之后接种到30mL（250

mL三角瓶）PDA液体培养基中，180r/min于28℃、3d后取样测定上清发酵液中的CMC下摇床发酵，酶活力。1．5

DNS法测CMC酶活

本实验将酶活力定义为：在适当的温度和pH值条件下，每1min水解相应的底物转化成1mg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）。方法：在

2mL的CMC液（浓试管中加入0．2mL的粗酶液，

40℃度为1%）和2mL的醋酸缓冲液（pH为4．8），水浴1h。接着往试管中加入DNS显色液2mL，再

放进沸水中水浴10min，然后定容到15mL，最后用分光光度计测其在540nm下的OD值。

计算纤维素酶类的活性单位依据以下公式：

（bx+a）×n×1000

（U/g）．纤维素酶活力=

0．2×Ta：由葡萄糖浓度和式中x：样品OD值的平均值；b、

相应的OD值通过回归方程求得；n：酶液的稀释倍数；T：酶促反应的时间；0．2：所加酶液的量。1．6产油脂的纤维素酶产生菌检测

近几年来产油微生物的研究越来越引起人们的

那么它关注。如果一株菌既产纤维素酶又产油脂，的应用价值将会大大提高。因此本文也对筛得的产

纤维素酶真菌进行了产油脂的检测。所用的方法为苏丹混和液染色法

［5］

1

1．1

材料与方法

样品、参照菌株、培养基与试剂

样品：采集不同来源的10份样品，编号（来源）

wx02（钟祥棉秆）、wx03分别为wx01（钟祥竹林）、

（钟祥柴堆）、wx04（钟祥稻草堆）、wx05（枣阳树

wx06（枣阳柴堆）、wx07（武汉土豆）、wx08（武林）、

wx09（武汉生菜）、wx10（武汉芹菜）。汉茶叶）、

020408，参照菌株：020219，本实验室保藏。

［3］

培养基：PDA培养基、羧甲基纤维素培养［4］

基。如配固体培养基则另外添加总重1．5%的琼

脂粉。

NaCl脱试剂：刚果红染色试剂（刚果红染色液、

［5］

DNS法测羧甲基纤维素钠发酵液酶活力色剂）、

［4］［5］

所用试剂、苏丹混和染液。1．2样品采集、产纤维素酶真菌的富集与分离

。

在湿润且含有大量腐烂植物的环境采集样品，接

－6－6

种到加有青霉素（100×10）和庆大霉素（20×10）28℃摇床培养。将的羧甲基纤维素钠液体培养基中，

培养液系列稀释后涂布PDA固体培养基平板（加入

－6－6

庆大霉素20×10，青霉素100×10抑制细菌生

28℃培养2—3d，长）上，分离得到霉菌菌株。

苏丹混合液染色法：取PDA液体培养基发酵培

养的菌丝少许，置10mL小烧杯中，吸干液体培养基，加人苏丹混和液1—2mL于室温染色5min，取出菌丝于水中洗涤5min，挑取菌丝制作临时装片，镜检观察。根据油滴颗粒大小及密集程度作出产油

同时作好菌丝体形量（以+来评价产油量）的评价，

转态的观察记录。对镜检评价为++以上的菌株，

入斜面培养基上，冷藏保种。

1．3可降解纤维素真菌的初筛方法（刚果红染色）向长有霉菌的羧甲基纤维素钠固体培养基平板

2

2．1

结果与分析

富集培养，经分离纯化后共得到34株产纤维素酶的霉菌。所得的菌株如表1所示。

可降解纤维素霉菌的分离

将采集的样品接种到CMC－Na液体培养基中

表1分离得到的可降解纤维素霉菌

样品

wx012

wx022

wx036

wx043

wx053

wx064

wx071

wx082

wx094

wx107

分离出的菌株数

2．2刚果红初筛的结果2．5菌株形态观察

刚果红法是目前公认的鉴别真菌是否产纤维素

［5］

酶的有效方法。刚果红染色初筛得到生长迅速且透明圈直径/菌落直径大的菌株有wx0101、wx0305、wx0402、wx0503、wx0602、wx0603、wx0604、wx0904、wx1005、wx1006、wx1007，共11株。2．3DNS法测定粗酶液中CMC酶活力的大小将初筛得到的菌株用PDA液体培养基进行发酵，用DNS法测定发酵液的CMC酶活力，发现菌株wx0503、wx0603、wx1005等菌株的酶活力都比实验室保存的参照菌株020219和020408大。结果见表2。

表2纤维素酶活力

菌株酶活/U/mL

020219020408wx0503wx0603wx100516．94

14．98

31．31

23．3

47．46

——对筛得的纤维素酶活力最高的2株菌株—

wx0503和wx1005、纤维素酶活与产油量均较高的2——wx0403和wx1007进行显微镜观察并拍株菌株—照，结果见图1。从图片中可以清晰地看见纤维素酶活与产油量均较高的2株菌株菌丝间有大量的黄色油滴

。

2．4产油脂检测

对刚果红初筛的菌株进行产油脂的检测，并对产油情况进行评价。评价结果如表3。油滴多少分++、+、＜+表示。别以+++、

表3菌株产油脂检测结果

菌株wx0101wx0202wx0303wx0304wx0401wx0402wx0403wx0502wx0503wx0601wx0602wx0603wx0604wx0904wx1005wx1006wx1007

评价++++＜++＜+++++++++++++++++++

图1菌株形态观察

3讨论

——并不是在CMC本研究中观察到一种现象—

－Na培养基上长的最好（就是菌落直径最大）的菌

DNS法所测得的纤维株其刚果红染色水解圈最大，

素酶活力最高，可能的原因是有些菌所产生的纤维

素酶为胞内酶。这对酶活力是一个很好的解释，但用于解释刚果红染色水解圈就有些牵强了。

研究中还遇到另一个问题：在用刚果红做染色鉴定时，我们首先尝试将能在CMC－Na培养基上生长的菌直接接种到纤维素－刚果红培养基（配方（NH4）2SO42．0g，MgSO4·7H2为：CMC－Na2．0g，

O0．5g，K2HPO41．0g，NaCl0．5g，刚果红0．4g，水1000mL，琼脂20g）平板培养。结果所接种的菌大

（下转第13页）

4结论

tensioninspontaneouslyhypertensiverats［J］．LifeScience，2006，78：2960－2966．

［4］刘静波，林松毅，张铁华，等．蛋清高F值寡肽

．沈阳农业大学学可控酶解条件的筛选［J］2007，38（24）：174－177．报，

［5］金嫘，李新华．中性蛋白酶酶解蛋清制备活性

J］．安徽农业科学，2007，35（11）：肽的研究［

3258－3259．

［6］李和平，隋继学，张雪，等．中性蛋白酶水解鸡

J］．食品科全蛋清制备活性肽工艺条件优化［2009，34（8）：186－189．技，

［7］迟玉杰，J］．田波．蛋清寡肽制备技术的研究［2004，25（11）：177－179．食品科学，［8］刘静波，赵法利，刘瑜，等．外切蛋白酶作用蛋

J］．清蛋白制备高F值寡肽的外切效果研究［2006，27（11）：192－194．食品科学，

［9］郑云，蔡木易，范慰慰．蛋清白蛋白酶解工艺

J］．食品与发酵工业，2005，31（12）：的研究［

69－71．

本试验以新鲜鸡蛋蛋清为原料，探讨了碱性蛋白酶对蛋清的酶解效果。由于蛋清蛋白结构致密，因此需要进行一定的预处理，使之形成蛋白酶作用的状态。本试验所选出的最佳变性条件为沸水浴加热处理15min。通过单因素试验和正交试验，得到碱性蛋白酶酶解蛋清的最佳工艺条件为：底物浓度4%，pH值9．5，酶解温度55℃，加酶量6%，酶解时间4h。

参考文献：［1］金嫘，王晶，李新华．Alcalase碱性蛋白酶酶

J］．食品研究与开解蛋清制备抗氧化活性肽［2009（6）：59－62．发，

［2］田波，迟玉杰．蛋清蛋白水解物的水解程度与

J］．食品工业科技，2002分子量关系的研究［

（11）：14－15．

［3］MartaMiguel，RosinaLopez－Fandino，Merce-desRamos，etal．Longtermintakeofeggwhitehydrolysateattenuatesthedevelopmentofhyper-

（上接第8页）

部分无法生长，有生长的菌株也没产生预期的明显

的水解圈。因此我们设计了2组平行实验，一组是将菌接种到纤维素－刚果红培养基（即在CMC－Na培养基配方中增加了0．4g/L的刚果红）固体平板上培养，另一组是将菌接种到CMC－Na培养基上，然后用刚果红染色法进行染色鉴定。理论上刚果红鉴定培养基和刚果红染色法均应看见水解圈，但实际上菌株在加了刚果红的培养基上的生长情况同纤维素－刚果红培养基，而后一种方案确实达到了预——菌株生长状况较好，期效果—经染色后也都出现了水解圈。原因可能是所加入的刚果红抑制了菌株对CMC－Na的利用，从而影响菌株的生长。参考文献：

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．andtheirpotentialindustrialapplications［J］BiotechnolAdv，1997，15（3－4）：583－620．［2］BayerEA，LamedR，HimmelME．Thepo-tentialofcellulasesandcellulosomesforcellu-losicwastemanagement［J］．CurrOpinBiotech-nol，2007，18（3）：237－245．

［3］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验（第三

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［5］岳思君，李学斌，李爱华，等．高酶活纤维素

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kov4.html