恩诺沙星在黄羽肉鸡组织中残留消除规律研究

恩诺沙星在黄羽肉鸡组织中残留消除规律研究

吴　波１　段龙川２　罗厚强２　杨飞萍３

（１温州市动物疫病预防控制中心　温州　３２５０００　２温州科技职业学院动科系　温州　３２５００６３温州市农产品检测中心　温州　３２５０００）摘要】为了掌握恩诺沙星在黄羽肉鸡不同组织内的残留消除规律，确定该品种肉鸡的合理休　　【

／药期。饲料中分别添加５喂饲５０、１００和２００ｍＬ三个梯度剂量的乳酸恩诺沙星，０日龄黄羽肉ｇ，连续用药７ｄ分别在停药后０、肝和肾等组织采样，鸡，３、５、７、８、９、１０、１２、１５、２０ｄ时间点对肌肉、／／用Ｕ临床用药量）动物肌ＰＬＣ－ＭＳＭＳ方法测定乳酸恩诺沙星残留浓度。结果１００ｍＬ试验组（ｇ肉、肝、肾在分别停药１药物残留量才低于最高残留限量，分别为０．０、７、７ｄ后，０５５、０．１７８、／。结果表明临床用药量乳酸恩诺沙星对于黄羽肉鸡的休药期应在１０．１５９ｍｋ０ｄ以上。ｇｇ

／ＰＬＣ－ＭＳＭＳ；黄羽肉鸡　　关键词：恩诺沙星；Ｕ

DOI:10.14170/31-1278/s.2014.06.002

，ＥｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎＥＦ）是广泛应用于畜　　恩诺沙星（

主要用于禽养殖业中的第三代氟喹诺酮类抗菌药，１〕

，治疗畜禽细菌性疾病和支原体感染〔作为动物专用抗菌药物，具有抗菌谱广、杀菌活性强、与其他抗

２〕

。已备受兽医界重视〔菌药物无交叉耐药性等特点，

恩诺沙星在畜禽组织中的残留标志物为恩诺沙星

），及其活性代谢物环丙沙星之和（其在组织内ＥＦｓ分布快而广泛，并且在组织中的浓度要高于血浆中

３〕

。的浓度，在动物体内消除缓慢，半衰期长〔在养殖生产中，滥用恩诺沙星的现象普遍存

在，不仅造成畜禽中毒、病原菌对该类药物耐药等

４〕

，问题〔还会造成兽药在畜禽可食组织中的残留，严

重影响人类健康。中华人民共和国农业部２３５公告

喹诺酮类药物。

１．２　方法

１．２．１　试验动物分组。试验黄羽肉鸡分为试验组

和对照组，低、中、高三个梯度剂量试验组各４０羽，对照组４０羽。自由采食和饮水。１．２．２　饲养及给药方法。笼养，从５对照组仅饲喂基础日粮；试验组饮０日龄开始，

／水中分别以５０、１００和２００ｍＬ水平添加乳酸恩ｇ诺沙星，连续给药７ｄ后停药，停药后于不同时间点

测定试验动物可食组织中ＥＦｓ残留量。１．２．３　采样。于停药后０、３、５、７、８、９、１０、１２、１５、

称重２０ｄ时间点从对照组和试验组各抽取４羽鸡，

后立即屠宰，进行取样。每羽鸡各取胸肌和腿肌约、全肝、全肾，将样品编号后置于－２２５ｇ０℃冷冻保

待测。存，１．２．４　样品前处理。取（５±０．０２）ｇ经切碎匀浆的畜禽可食组织样品，置于５０ｍＬ具塞离心管中，加入约５ｇ无水硫酸钠和２涡旋混匀０ｍＬ乙腈，，／超声５ｍ以８２ｍｉｎ，ｉｎ０００ｒｍｉｎ冷冻离心５ｍｉｎ。　将上层提取液转移至１残渣００ｍＬ棕色鸡心瓶中，再加入２重复上述操作１次。合并提取０ｍＬ乙腈，液，向鸡心瓶中再加入１０ｍＬ异丙醇。在４０℃以下水浴减压浓缩至近干，再用氮气吹干。准确加入涡旋混匀溶解残留物，转移到１．００ｍＬ初始流动相，

再加入１ｍ１０ｍＬ具塞聚丙乙烯离心管中，Ｌ正己

／，以１取下层液烷混匀，００００ｒｍｉｎ冷冻离心５ｍｉｎ　过０．滤液待测定。２μｍ微孔滤膜，

１．２．５　色谱条件。ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＴＭＢＥＨＣ１８；色谱柱（１００ｍｍ×２１ｍｍ，１．７μｍ；Ｗａｔｅｒｓ公司）柱温３样品温度１进样体积５μ５℃；０℃；Ｌ；流动相体积分数）甲酸水溶液；流速Ａ为乙腈，Ｂ为０．１％（

／０．２５ｍＬｍｉｎ。

／、规定的最高残留限量（为：肌肉０．ＭＲＬ）１ｍｋｇｇ

／、／。恩诺沙星在健肝脏０．肾脏０．３ｍｋ２ｍｋｇｇｇｇ

５～９］

，康畜禽体内药物动力学的研究已有不少报道［

但是在黄羽肉鸡可食组织内药物残留消除规律研

究尚未见报道。笔者通过恩诺沙星药物在黄羽肉为合理休药提供参考。鸡组织内的残留消除试验，

１　材料与方法

１．１　材料

由浙江１．１．１　主要药品及仪器。乳酸恩诺沙星：国邦药业有限公司提供，批号１２１１０８１，含量－

／临床推荐用量为混饮，鸡１９９．５％；００ｍＬ。恩诺ｇ沙星标准品：由Ｄｒ．ＥｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒＧｍｂＨ公司提供，　

含量９由Ｄ９．２３％。环丙沙星标准品：ｒ．Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆ－含量９ｅｒＧｍｂＨ公司提供，９．１８％。ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣｅｖｏＴＱ超高效液相色谱－串联质谱联用－Ｘ　

）源；配有电喷雾离子（高速冷冻离心机，超仪：ＥＳＩ旋转蒸发仪，漩涡混匀器。声清洗仪，

体重１．１．２　试验动物。５０日龄黄羽肉鸡１６０羽，（），雌雄各半，试验前确保没有使用氟１．５±０．２ｋｇ

相对标准偏差均小于１表明９３％～１１６％，０．０％，

／ＥＦｓ０．１０～０．３０ｍＬ残留浓度附近具有较高的准　ｇ确度。

电离电压１．２．６　质谱条件。电离方式ＥＳＩ＋；

；／；离子源温度１锥孔反吹气流量３．５０Ｋｖ５０℃；５０Ｌｈ

／；脱溶剂气温度３脱溶剂气流量８采集模５０℃；００Ｌｈ；／。式为多反应监测（碰撞室气流量０ＭＲＭ）．２ｍＬｍｉｎ

１．２．７　方法的回收率和精密度。用未检测出ＥＦｓ的肌肉、肝及肾样品作为空白样品，分别做加标回

每个浓度设４个平行样。收及精密度试验，

２．２　停药后各时间点黄羽肉鸡ＥＦｓ残留量

肝、肾组织均未检测　　对照组黄羽肉鸡的肌肉、

，试验组黄羽肉鸡各停药时间点可食组织出ＥＦｓ中剂量组ＥＦｓ残留浓度如表２所示。停药０ｄ时，

（临床用药量）黄羽肉鸡肌肉、肝和肾组织残留量分／，别是２．８９９、４．５８４、３．４３９ｍｋＥＦｓ在组织中浓ｇｇ度分布差别较大，３个梯度试验组组织残留量高低顺序依次均为肝＞肾＞肌肉。ＥＦｓ在停药０～３ｄ时间区间内残留消除速度较快，如图１所示。其中，肝组织在０ｄ时残留浓度最高，但是残留量下降也最为迅速，中剂量组７ｄ后，残留量低于ＭＲＬ

〔〕１０

（／），／，残留浓度为０．停药０．３ｍｋ１７８ｍｋｇｇｇｇ未检出残留物；中剂量组肾组织在停药７ｄ１５ｄ后，

〔１０〕

／后Ｅ残留浓Ｆｓ残留量低于ＭＲＬ（０．２ｍｋｇｇ），／，度为０．停药１未检出残留物；中１５９ｍｋ２ｄ后，ｇｇ剂量组肌肉组织Ｅ停药ＦＳ残留代谢消除相对缓慢，。药物残留量为０．１０ｄ后，０５５ｍｋｇ／ｇ

２　结果

２．１　方法的回收率和精密度实验

）／、表１单位：ｎ＝４ｍｋ％）　方法回收率及精密度实验数据（　　（ｇｇ平均回收率相对标准偏差加标量可食

组织恩诺沙星环丙沙星恩诺沙星环丙沙星恩诺沙星环丙沙星

０．１０　

肌肉

０．２０　０．３０　０．１０　

肝

０．２０　０．３０　０．１０　

肾

０．２０　０．３０　

０．１０　０．２０　

９８．５５０２．４９　１　９９．１１７．５１　９　

２．１８　７．８５　６．４２　７．２１　５．６１　８．４３　８．５４　７．５４　９．１２　

５．１２６．１２５．９９８．４４７．２１９．１２８．６４８．８１６．５７

０．３００５．０１０３．５８　１　１　０．１００５．２０１１．４３　１　１　０．２００８．１２０８．９８　１　１　０．３００５．８１９．４３　１　９　０．１０　

９３．７４８．４３　９　

０．２０１５．６３０５．８５　１　１　０．３００５．５４０２．４３　１　１　

加标回收率范围　　由表１中的数据可以看出，

／）表２　乳酸恩诺沙星在黄羽肉鸡组织中的消除规律　　（单位：ｍｋｇｇ

停药时间０ｄ３ｄ５ｄ７ｄ８ｄ９ｄ１０ｄ１２ｄ１５ｄ２０ｄ

对照组

肌肉ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　

肝ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　

肾ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　

（／低剂量组ＥＦｓ５０ｍＬ）ｇ肌肉１．８４２　０．４４１　０．３２７　０．２０１　０．１０８　０．０７６　０．０３２　０．０１２　０．００１ＮＤ　

肝２．２１０　０．４１４　０．２０１　０．１８８　０．０８９　０．０４１　０．０３５　０．００２ＮＤ　ＮＤ　

肾２．０８１　０．３５６　０．１０２　０．０９９　０．０５１　０．０２１　０．００１　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　

（／中剂量组ＥＦｓ１００ｍＬ）ｇ肌肉２．８９９　０．８５１　０．４７３　０．３０５　０．２０１　０．１０２　０．０５５　０．０１８　０．００２０．００２

肝４．５８４　０．７９４　０．３８３　０．１７８　０．０７５　０．０４３　０．０２２　０．００１ＮＤ　ＮＤ　

肾３．４３９　０．５４９　０．２１０　０．１５９　０．０８７　０．１０２　０．００２　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　

（／高剂量组ＥＦｓ２００ｍＬ）ｇ肌肉４．１５１　０．８４１　０．２３２　０．２０１　０．１２０　０．１２０　０．０９８　０．０７６　０．０１３　０．００２　

肝

肾

１０．２１３７１２　４．２．１２３　０．７２１　０．４８９　０．３８９　０．１２０　０．１０８　０．０８８　０．０２１０．０１０

０．８８７０．４１３０．２０５０．０８６０．０４３０．０２２０．００６ＮＤＮＤ

“为未检出。残留标志物用ＥＮＤ”Ｆｓ

表示　注：

通过将恩诺沙星成盐改变其理化特性，且更有效，

以便于临床制成水溶性制剂。目前普遍采用的就，是乳酸恩诺沙星，其临床推荐方案为５ｄ由于兽医临床实际用药方案受诸多因素影响，研究时采用推荐剂量连用７ｄ给药方案，以最大限度降低因实际

图１　ＥＦｓ在黄羽肉鸡组织中的消除规律

（／中剂量组１００ｍＬ）ｇ

用药而导致的残留危害风险。３个剂量试验组在黄羽肉鸡肝组织中分布浓度最大，且代谢消除也最快，其次是肾组织，肌肉组织中ＥＦｓ代谢消除较缓，慢。在０ｄ３个梯度剂量试验组ＥＦｓ残留浓度差别明显，７ｄ后残留浓度及消除速度

（下转第９页）

３　讨论

在水中微溶　　恩诺沙星为类白色结晶性粉末，

解，但在鸡临床实践中，饮水给药较拌料给药方便

〔〕

发展起来的Ｂａｅｓ方法４。系统树分析法是根据ｙ

克夏种猪品种品系鉴定的方法，填补了以前只用于可服务于种猪资源引进的品种鉴品种鉴定的空白，

定、种畜禽生产经营管理、地方猪种的保种与开发，具有广泛的经济和社会价值，应用前景广阔。

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〔〕４ＲａｎｎａｌａＢ，ＭｏｕｎｔａｉｎＪＬ．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｉｍｍｉｒａｔｉｏｎｂｕｓｉｎ　　　　ｇｇｙｇ　　

〕Ｇｅｎｏｔｅｓ〔Ｊ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡ－ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ　　　　ｙｐｇ　ｃａｄｅｍｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵＳＡ，１９９７，９４：９１９７～９２２１．　　　　ｙ　〔〕５ＣａｖａｌｌｉＳｆｏｒｚａＬＬ，ＥｄｗａｒｄｓＡ　Ｗ　Ｆ．Ｐｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌ－　　　　－ｙｇｙ：Ｍｓｉｓｏｄｅｌｓａｎｄｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｒｏｃｅｄｕｒｅｓ〔Ｊ〕．Ａｍｅｒｉｃａｎ　　　ｐ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ１９６７，１９：２３３～２５７．　　　〔〕ｈｌｏｅｎｅｔｉｃｓ６ＮｅｉＭ，ＫｕｍａｒＳ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄ　　　　　ｐｙｇ

〔：，Ｍ〕．Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔＰｒｅｓｓ２０００．　ｙ　〔〕７ＢａｎｋｓＭ　Ａ，ＥｉｃｈｅｒｔＷ，Ｗｈｉｃｈｒｎ．Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１，ａｃｏｍ－　　　　ｕｔｅｒｒｏｒａｍｆｏｒｏｕｌａｔｉｏｎａｓｓｉｎｍｅｎｔｂａｓｅｄｏｎｍｕｌｔｉ　　　　　　　－ｐｐｇｐｐｇ，ｌｏｃｕｓｅｎｏｔｅｄａｔａ．ＢｏｄｅａＭａｒｉｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒＵｎｉｖｅｒ　　　　－ｇｙｐｇｙ，，ｓｉｔｏｆｃａｌｉｆｏｒｎｉａａｔＤａｖｉｓＢｏｄｅａＢａＣＡ，ＵＳＡ．２００１．　　　　ｙｇｙ　

采用某种方法构动物个体或群体间的遗传距离，

建系统树，再根据系统树的聚类情况进行判断和评价。最大似然法是根据动物个体特定标记的基采用最大似然法计算每个个体属于各自采因型，

样群体的最大似然概率值，从而判断个体的归属。而Ｂａｅｓ方法是根据动物个体或群体的基因型组ｙ成，运用Ｂ从而判断个体或群体属ａｅｓ概率理论，ｙ这３种方法都有于各自采样群体的概率。目前，

相应的理论基础和软件，在使用过程中极为方便，

５～７〕２〕

。毛永江等〔并且得到了广泛应用〔研究结果

表明，基于Ｂ是ａｅｓ理论的个体识别方法最准确，ｙ进行同类研究的首选工具，而系统数分析法和最大似然法可以作为其补充加以应用。本试验采用基于贝叶斯概率理论的Ｇｅｎｅｃｌａｓｓ２．０软件统计方　结果也证实了该理论在个体或群体鉴定上的法，

准确可行性。

本实验首次探索了利用微卫星标记组合进行大约克夏品系鉴定的方法。通过１２对微卫星引物的多重Ｐ以及基于贝叶斯概率理论的ＧＣＲ扩增，ｅ－可准确地对大约克夏ｎｅｃｌａｓｓ２．０软件的统计分析，　

种猪和美系长白种猪进行鉴别，更进一步能区分美系、法系、英系大约克夏的个体或群体。

本实验建立了通过利用微卫星标记进行大约

檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨

〔（３〕ＥＳｔｕｒｋＡ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎ上接第６页）　　　　　　　趋于一致。中剂量组肌肉、肝、肾在分别停药１０、７、组织残留量才低于最高残留限量标准；中华７ｄ后，

人民共和国农业部公告第２７８号规定恩诺沙星在肉。黄羽肉鸡品种生长周期相对鸡中的休药期为８ｄ

较长，药物代谢速度可能要低于其他肉鸡品种，肌肉组织ＥＦｓ残留在８ｄ时尚未达到安全标准。由此针对黄羽肉鸡品种，在临床使用Ｅ可知，Ｆ时，８ｄ的休药期可能是不安全的，应按照１０ｄ或者以上的休药期执行，以确保黄羽肉鸡可食组织ＥＦＳ残留低于国家规定最高限量标准。

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