实验指导

实验项目：水杨酸在植物诱导抗寒性中的作用

实验目的：通过了解植物在低温逆境条件下的生理变化，研究探讨“外源水杨酸”在植物诱导耐寒性方面的机理。 实验对像：番茄幼苗

实验原理：低温逆境条件会影响植物的正常生长发育，表现在叶绿素分解、光合速率降低、细胞膜透性增加、丙二醛含量提高、根系活力降低、生长量减少等，植物本身也会因低温逆境而诱导产生相应的抵抗机制，如超氧化物歧化酶（SOD）活性提高、过氧化物酶（POD）活性提高、过氧化氢酶（CAT）活性提高、细胞膜透性降低等，以维持植物在低温逆境条件下的生长。而随着环境温度的继续降低，植物的低温耐受能力达到极限，生长发育受阻，甚至出现冷害或冻伤。外源施用水杨酸（SA），作为信号可以大大提高植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性提高、过氧化物酶（POD）活性提高、过氧化氢酶（CAT）活性，降低细胞膜透性，减缓低温对植物的伤害，从而大大提高植物对低温逆境的抵抗能力。

实验仪器、设备：穴盘、光照培养箱、营养钵、分光光度计、电导率仪、光合测定仪、温湿度计、喷壶、玻璃棒、往复振荡机。 实验试剂：水杨酸、 实验步骤：

1.材料选择及处理方法：

3．过氧化氢酶活性测定

取样品0.2g加5ml50m mol/l PBS（pH7.8），冰浴磨碎，低温离心20min,取上清液为酶液，取3ml反应液（50m mol/L PBS（pH7.0）+10 mmol /LH2O2），加入0.2ml稀释酶液，用紫外光度计记录240nm的OD值下降速度，每10秒1次，共10次。以不加H2O2的50m mol/L PBS（pH7.0）为空白。每0.01OD值定义为一个酶活力单位。

4．过氧化物酶活性测定(间隔计数法) (1) 酶液制备

称取0.2克左右植物样品，记下实际重量后剪碎于研钵中，加入预冷的酶提取缓冲液5ml，置于冰浴上充分研磨。匀浆液全部转入塑料离心管，平衡后于4000rpm、4℃下离心30min。上清液全部倒入刻度小试管，准确记下其体积，此上清液即为酶液，插入冰浴中待用。

(2) 酶活力测定

① 分光光度计预热10min，波长定于460nm处；

② 在比色杯内先加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液和1ml0.25%愈创木酚溶液，再加入0.2ml酶液(视酶活力大小而定)，最后加入0.1ml 0.75%H2O2溶液，迅速颠倒混匀，立即反比色杯插入比色架上，立即盖上盖子，迅速把A460调至0并开始计时，每隔30秒读取A460值，共读3分钟，分别记下所读的A460值； 5．丙二醛含量的测定

① 取0.2g植物样品，加5% TCA 4ml，研磨后所得匀浆在3000rpm下离心10min。 ② 取上清液2ml，加0.67% TBA 2ml,混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。

③ 分别测定上清液在450nm、 532nm 、600nm处的消光度值。并按公式计算出MDA浓度。

公式：C(μmol L～1)=6.45(D532～D600)～0.56D450

? 测量时以2mlTCA+2mlTBA为空白调零

根据MDA浓度(μmol L～1)进一步算出单位重量组织中MDA含量(μmol/gFW)

6．超氧化物歧化酶（SOD）测定（NBT）

取0.1g左右＋5ml酶提取液（50mmol/L PBS，pH7.8）→冰浴研磨→冷冻离心（4000rpm×30min）→得上清液(量出体积Vt)。

酶活性测定：

总反应体积为3ml，内含40mmol/L PBS，pH7.8，13mmol/L Met，100nmol/L EDTA，75μmol/L NBT，4μmol/L Riboflavin（核黄素）， 按以下顺序加反应液： PBS 2.2ml

Met 0.2 ml（甲硫氨酸） 核黄素 0.2 ml EDTA 0.1 ml 酶液 0.1 ml

NBT 0.2 ml（氮蓝四唑）

以缓冲液反应管不照光为空白；

不加酶液（以缓冲液代替）的反应管同时照光作为最大光化还原管； 照光20min后（至显蓝色为止）→立即避光→迅速测定A560值。

1．激素含量测定(ELISA)

2．H2O2含量的测定(按林植芳方法)

取新鲜花芽，剥除鳞片后称取0.2g，加冷丙酮5ml研磨成浆，定容至8ml；取1ml提取液加0.2ml20%四氯化钛的浓盐酸溶液，再加0.2ml浓氨水，5000g离心10min。沉淀溶于5ml 1.0mol L-1的浓硫酸中，然后测定410nm处的吸光度值(OD)。

标准曲线：同法 3．过氧化氢酶活性测定

取样品0.5g加0.2mol/L、pH值7.0磷酸缓冲液5ml研磨匀浆4000r/min离心10min，取上清液；在三角瓶中加入酶液3ml，置于30℃水浴中，加入0.1 mol/L H2O2. 3ml，反应15min；加入3.6N硫酸3ml终止反应，用0.1 mol/L高锰酸钾标准溶液(用前稀释10倍)滴定至出现粉红色为终点。酶活性以每克组织鲜重每分钟分解H2O2毫克数表示。

4．过氧化物酶活性测定(间隔计数法) (1) 酶液制备

称取0.2克左右植物样品，记下实际重量后剪碎于研钵中，加入预冷的酶提取缓冲液5ml，置于冰浴上充分研磨。匀浆液全部转入塑料离心管，平衡后于4000g、4℃下离心30min。上清液全部倒入刻度小试管，准确记下其体积，此上清液即为酶液，插入冰浴中待用。

(3) 酶活力测定

① 分光光度计预热10min，波长定于460nm处；

② 在比色杯内先加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液和1ml0.25%愈创木酚溶液，再加入0.2ml酶液(视酶活力大小而定)，最后加入0.1ml 0.75%H2O2溶液，迅速颠倒混匀，立即反比色杯插入比色架上，立即盖上盖子，迅速把A460调至0并开始计时，每隔30秒读取A460值，共读3分钟，分别记下所读的A460值； 5．丙二醛含量的测定

① 取0.2g植物样品，加5% TCA 4ml，研磨后所得匀浆在3000rpm下离心10min。 ② 取上清液2ml，加0.67% TBA 2ml,混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。

③ 分别测定上清液在450nm、 532nm 、600nm处的消光度值。并按公式计算出MDA浓度。

公式：C(μmol L-1)=6.45(D532-D600)-0.56D450 ? 测量时以2mlTCA+2mlTBA为空白调零

根据MDA浓度(μmol L-1)进一步算出单位重量组织中MDA含量(μmol/gFW) 6．可溶性糖的含量测定

酒精提取：将芽在110℃的烘箱中鼓风固定15min，然后调温至70℃过夜。干芽体磨碎后称取50mg样品倒入10ml刻度离心管内加入4ml80%酒精，置于80℃水浴不断搅拌40min，离心(3000r/m)，收集上清液，其残渣加80%酒精重复提2次，合并上清液。在上清液中加入活泩炭10mg，80℃脱色30min。定容至10ml，过滤后取滤液(视需要)测定。

可溶性总糖测定：取一定量的酒精提取液，浓缩至0.05～0.1ml，加入3ml蒽酮试剂《150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸(76ml浓硫酸加入到30ml水)中》，90℃保温15min,测定D620。取20～50μg葡萄糖同法测定，做成标准曲线进行计算。

试剂和仪器、设备

1．试剂：80%甲醇

仪器：研钵、微量进样器、5000g高速低温离心机

2．试剂：4℃冷丙酮、浓盐酸、四氯化钛、浓氨水、1.0mol L-1的浓硫酸 仪器：研钵、微量进样器、分光光度计、5000g离心机

3．试剂：0.2mol/L、pH值7.0磷酸缓冲液；0.1 mol/L H2O25ml；3.6 mol/L硫酸；

0.1mol/L高锰酸钾标准溶液

仪器：研钵、微量进样器、滴定管、4000r/m离心机 4．试剂：

酶提取缓冲液：50mmol/L硼酸—硼砂缓冲液(pH值8.7)内含5mmol/L(0.03g)亚硫酸氢钠(临用前加)；

测定液：0.1mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液(pH值5.4)；0.25%愈创木酚(溶于50%乙醇中)溶液(临用前配制)；0.75% H2O2溶液(临用前配制)。

仪器：研钵、微量进样器、分光光度计、电子天平、4000g高速低温离心机 5．试剂：5%三氯乙酸(TCA)；0.67%(W/V)硫代巴比妥酸(TBA)

设备：研钵；试管；可调加样器；恒温水浴锅；3000rpm冷冻离心机；分光

光度计

6． 试剂： 80%(v/v) 乙醇、活泩炭、蒽酮试剂《150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸

(76ml浓硫酸加30ml水中)》

设备：烘箱、4000r/m离心机、分光光度计

、激素：80%甲醇 2、H2O2测定：

Ticl4(强刺激性、遇水分解)：20%(体积比：10ml+40mlH2O) 浓氨水：

1M H2SO4：5.4ml(H2SO4)+94ml(H2O) 3、过氧化氢酶(CAT)活性测定： 提取液：

50m mol/L PBS（pH7.8）：Na2HPO4·12H2O（16.385g）＋NaH2PO4·2H2O

（0.663g）溶解于1000ml H2O中，用NaOH滴定至pH7.8。

反应液：50m mol/L PBS（pH7.0）+10 mmol /LH2O2

50m mol/L PBS（pH7.0）：Na2HPO4·12H2O（10.923g）＋NaH2PO4·2H2O

（3.042g）溶解于1000ml H2O中，用NaOH滴定至pH7.0。

10 mmol /LH2O2：先取2.6ml H2O2（30%）定容至25ml(用50m mol/LPBS

（pH7.0）配制)；

再吸取1ml定容至100ml（同上）。（临用前配制）

4、过氧化物酶(POD)活性测定：

50mmol/L 硼酸—硼砂缓冲液（pH 8.7）:

硼酸（0.2M）：4.9464g溶于400ml H2O。

硼砂（0.05）（Na2B4O7·10 H2O）：11.4411g溶于600ml H2O。 两者合而为一，后用HCl滴定

临用前加NaHSO3（每5ml＋2.6mg＝5mmol/L）

0.1mol/L 醋酸—醋酸钠缓冲液(pH值5.4)；

0.1mol/L NaAc：3.2812g溶于400ml H2O 0.1mol/L HAc：1.2ml 冰醋酸溶于200 ml H2O 向NaAc中滴加HAc至pH＝5.4

0.25%愈创木酚：250μl愈创木酚溶于100ml 50%乙醇中 (临用前配制)。 0.75% H2O2：2.5ml 30% H2O2溶液定容至100ml(临用前配制)。 5、丙二醛（MDA）含量的测定

5%三氯乙酸(TCA)：5ml TCA+ H2O 定容至100 ml。

0.67%硫代巴比妥酸（TBA）：0.67g TBA溶于100ml H2O中。（用前配） 6、总呼吸速率测定（光合仪）

0.05mg/L丙二酸：（配制母液）取0.05g溶于100ml H2O中；

取1ml溶于1000ml H2O中；

0.02mg/L Na3PO4：（配制母液）取0.02g溶于100ml H2O中；

取1ml溶于100ml H2O中；

取10ml溶于100ml H2O中；

7、超氧化物歧化酶（SOD）测定（NBT法）（母液）

50m mol/L PBS（pH7.8）：（同3）

195mmol/L 甲硫氨酸（Met）：1.455g溶于50ml H2O中。 3μmol/L EDTA：（三次稀释）取0.4384g溶于50ml H2O中；

取1ml溶于100ml H2O中； 再取1ml溶于100ml H2O中。

1.125mmol/L NBT（氮蓝四唑）：取0.046g溶于50ml H2O中。

60μmol/L Riboflavin（核黄素）：（两次稀释）取0.0113g溶于50ml H2O中； 取5ml溶于50ml H2O中。 调pH ：0.1mol/L HCl：取0.865ml浓HCl＋H2O定容至100ml。 0.1 mol/L NaOH：取0.4g加H2O定容至100ml。

取10ml溶于100ml H2O中；

7、超氧化物歧化酶（SOD）测定（NBT法）（母液）

50m mol/L PBS（pH7.8）：（同3）

195mmol/L 甲硫氨酸（Met）：1.455g溶于50ml H2O中。 3μmol/L EDTA：（三次稀释）取0.4384g溶于50ml H2O中；

取1ml溶于100ml H2O中； 再取1ml溶于100ml H2O中。

1.125mmol/L NBT（氮蓝四唑）：取0.046g溶于50ml H2O中。

60μmol/L Riboflavin（核黄素）：（两次稀释）取0.0113g溶于50ml H2O中； 取5ml溶于50ml H2O中。 调pH ：0.1mol/L HCl：取0.865ml浓HCl＋H2O定容至100ml。 0.1 mol/L NaOH：取0.4g加H2O定容至100ml。

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