《生物技术大实验》实验手册（试行）0906

《生物技术大实验》

实验指导（试行）

四川农业大学农学院

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目录

第一章 基因克隆技术………………………………………………………3

实验一 植物基因组DNA的提取及检测 ………………………………………………3 实验二 RNA的制备和分析………………………………………………………………6 实验三 蛋白质的提取及检测……………………………………………………………9 实验四 琼脂糖电泳技术…………………………………………………………………11 实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析………………………………………………17 实验六 核酸印迹技术-DIG标记探针的分子杂交……………………………………20 实验七 λDNAHindⅢ酶切鉴定…………………………………………………………24 实验八 DNA片段的纯化回收…………………………………………………………26 实验九 DNA体外重组…………………………………………………………………29 实验十 重组DNA的蓝白筛选…………………………………………………………31

第二章 植物基因转化技术………………………………………………35

实验一 农杆菌浸染的油菜花瓣转化表达GUS基因试验……………………………35 实验二 基因枪介导的基因转化实验……………………………………………………38 实验三 转化目的基因的检测- GUS组织化学染色……………………………………39

第三章 植物育种分子标记技术………………………………………40

实验一 RAPD分子标记技术……………………………………………………………36 实验二 SSR分子标记技术（包括垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳）………………………43 实验三 SNP分子标记技术………………………………………………………………47

第四章 重组蛋白诱导表达………………………………………………49

实验一 大肠杆菌菌种的活化和菌种的保存……………………………………………49 实验二 感受态细胞的制备-采用CaC12 法制备感受态细胞…………………………50 实验三 碱式裂解法提取表达载体质粒…………………………………………………52 实验四 大肠杆菌的热激转化法…………………………………………………………54 实验五 Taq聚合酶基因的诱导表达……………………………………………………55 实验六 Taq聚合酶的提取纯化…………………………………………………………57 实验七 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq聚合酶分子量及纯度………………58 实验八 Taq聚合酶活性单位标定和比活性检测………………………………………60

第五章 生物信息数据库及生物软件的使用…………………61

实验一 NCBI等数据库的使用…………………………………………………………61 实验二 常用生物软件的使用……………………………………………………………63

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第一章 基因克隆技术

实验一 植物基因组DNA的提取及检测

实验目的

通过本实验学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法

实验原理

基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。

实验材料

玉米、马铃薯等农作物叶片

试剂配方

1. CTAB 抽提缓冲液

Table 1 CTAB Extraction Buffer (100ml)*

1 M Tris-Hcl pH 8.0

7.5 ml

NaCl 6.2g

0.5 M EDTA-8.0

3.0 ml

CTAB 2.0 g

BME 0.2 ml

* Use freshly made. Warm buffer to 60-65℃ before adding CTAB (cetyltriethylammonium bromide) and BME (β-mercaptoethanol). Add BME just prior to use under a fume hood.

2. 氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。

实验步骤

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1. Sample leaves (or other organs) from vase or field. It is preferable to use young leaves

after darkness treatment of several days, although older leaves that are not senescent may be used. 2.

Place samples in a vacuum bottle with ice to keep them cool (but do not allow to freeze).

Samples may be stored at -80℃ until ready to continue the following steps. NOTE: Once sample frozen, do not allow it to thaw until continuing step 4. 3.

Remove mid rib, cut leaves into 1 cm sections, put in a mortar pre-frozen, add liquid

nitrogen, grind to a fine powder with a pre-frozen pestle and ladle in a 5 ml centrifuge tube up to about the 2 ml mark. 4.

Add 2 ml warm (65℃) CTAB extraction buffer (table 1) and mix several times by gentle

inversion. 5.

Incubate in a 65℃ water bath for 30-40 min, mixing gently by inversion every 10 min.

NOTE: Wear rubber or plastic gloves and go on with step 6-9 under a fume hood. 6.

Add one volume of chloroform / isoamyl alcohol (24:1) and mix gently by inversion for

15 min. 7.

Spin in a table-top centrifuge with 8000~10000 rpm at room temperature for 15 min.

Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube.

NOTE: Below 15℃ the CTAB and nucleic acid complex may precipitate, ruin preparation and even cause damage to the centrifuge. 8. 9.

Repeat step 6 and 7 in order to eliminate protein clearly.

Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube and add one volume of isopropanol, mix

well and keep at -20℃ for at least 10 min to separate out the DNA. 10.

Use a pin to hook out the DNA. Rinse it with ice-cold 70% ethanol twice and absolute

ethanol once. 11. 12.

Dry pellet in vacuum desiccator with middle speed for 10 min.

Dissolve the DNA in 50 μl HPLC H2O. (Add 3 μl of 10mg/ml RNase A (pre-boiled), mix

by gentle inversion and incubate at 37℃ for 30 min.) 13.

Dilute 50-500 times and read absorbance at 260 nm and 280 nm in spectrophotomemter

and calculate concentration and quality. 14.

Store at 4℃ for use or -20℃ for a long time.

注意事项

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1. 叶片磨得越细越好 2. 移液器的使用

3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

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实验二 RNA的制备和分析

实验目的

通过本实验学习和掌握从植物组织中提取RNA的方法

实验原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

材料

玉米、水稻、小麦等农作物根或叶

仪器试剂

(一) 仪器 1． 低温离心机 2． 分光光度计

3． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。 4． 高压灭菌锅

5． 研钵、剪刀、一次性手套等 (二) 药品

1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍 4. 醋酸钠(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇

9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 琼脂糖

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11. 异丙醇 (三) 试剂配方 1． 0.1% DEPC水

0.1 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。

2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。

3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液(pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L

(溶液均需用DEPC处理过的水配制)

操作步骤

方法1

1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管； 2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；

3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min； 4. 在8℃条件下，12000 rpm离心15 min；

5. 溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管， 加入0.5 ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10 min；

6. 然后在, 2~8℃条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部； 7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；

8. 风干后，加入25 μl DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。 方法2 1. 匀浆处理:

a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有how(event)\污染。

c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml

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TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项

1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。

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常见问题分析：

得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B. RNA沉淀未完全溶解

A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高 B．样品匀浆时加的试剂量太少 C. 匀浆样品时未在室温放置5分钟 D. 吸取水相时混入了有机相 E .RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃ C. 细胞在用胰酶处理时过度

D. 溶液或离心管未经RNase去除处理 E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少

B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液

蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。 4. 在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。

5. RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。

思考题

1. 实验中使用的各种药品的作用？

2. 真核生物的总RNA提纯后，可以继续做那些工作？

3. DNA和RNA相比，为什么说提纯植物细胞的mRNA是研究结构基因更关键的一步

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实验三 蛋白质的提取及检测

实验目的

熟悉植物叶蛋白的几种提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。

实验原理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

植物叶蛋白或称绿色蛋白浓缩物(leafproteinconcentration，简称LPC)，是从新鲜植物叶片中提取的高质量浓缩蛋白质，不仅是畜禽生长发育和生产畜产品的主要营养物质，而且目前也正成为人类的保健营养理想食品之一。天然蛋白存在于为数甚多的植物体内，对其分离应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和品质加以考虑。

天然蛋白质一般在溶液中呈稳定的亲水胶体状态，故LPC亦称叶蛋白胶。其特点是： (1)水化作用即蛋白质分子表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的水化膜； (2)电荷排斥作用水化膜外还有电荷层(具阴、阳离子)能有效地防止蛋白质分子的凝集。故溶液蛋白质颗粒(溶质)呈溶解状态；(3)欲提取植物组织中的蛋白质必须利用溶解度的差异进行分离纯化(如盐析、有机溶剂分级沉淀法、疏水层析、结晶、加热、离心分离等法)，利用分子大小和形状差异进行分离纯化(分子筛层析法)；还可利用电荷性质的差异分离纯化(离子交换法)。只要创造上述影响因素，即可使蛋白质从植物叶片中分离并沉淀出来。

植物叶蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物叶蛋白制备过程中一般需要有四种试剂①离液剂：尿素和硫脲等；②表面活性剂：又称去垢剂，早期常用NP-40、Tritonx-100等非离子型去垢剂，离子型去垢剂有SDS、胆酸钠、LiDS等，还有象CHAPS(含

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它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent等双性离子去垢剂；③还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base等；④蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物(Proteaseinhibitorcocktails)等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.1～5mmol/LEDTA，同时使金属蛋白酶失活。

仪器和试剂

仪器

离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱。 试剂

1.20mL样品提取缓冲液：2.5mL0.5mol/LTris-HCl 3.-20℃下预冷丙酮(含0.07%β-巯基乙醇) 4.-20℃预冷的80%丙酮(含0.07%β-巯基乙醇)

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实验四 琼脂糖电泳技术

实验目的

通过本实验学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

实验原理

在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。

天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。（2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研

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究中常用实验方法之一。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和纯化DNA片段一种方法和技术。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分于质量相同，但构型不同的DNA分子。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。

线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系

琼脂糖凝胶的百分浓度（%）

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

分离线状DNA分子的有效范围（kb）

60~5

20~1 10~0.8 7~0.5 6~0.4 4~0.2 3~0.1

Amount of Agarose and TBE buffer for Typical Gel Sizes and Electrophoresis Parameters Agarose concentration

Gel size Agarose 6×8cm

0.7% DNA.

for

14cm Genomic 11×

11×20cm

0.17g 0.52g 1.05g

1× TBE

Sample

Electrophoresis

mA

Time

buffer volume/well Volt 25ml 75ml 150ml 300ml 75ml 150ml

10μl 20μl 20μl 20μl 20μl 18μl

15-20 15h 15-20 15h 15-20 15h 15-20 15h 25-30 25-30

20×25cm 2.10g

14cm 1.5% for fragments 11×

1.12g

from 200 to 3500bp 12×24cm 2.25g

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such as STSs. 20×25cm 3.00g 24×24cm 4.50g 11×14cm

1.12g

200ml 300ml 75ml 150ml 200ml 300ml 75ml 150ml 120ml 200ml 300ml

20μl 16μl 20μl 18μl 20μl 16μl 20μl 18μl 12μl 20μl 16μl

100 100 100 100 100

25-30 25-30 35-40 35-40 35-40 35-40

2-3h 2-3h 2-3h 2-3h 2-3h

2% for RAPDs.

12×24cm 2.25g 20×25cm 3.00g 24×24cm 4.50g

3% for fragments 11×14cm 2.25g

below 400bp such as 12×24cm 4.50g plasimds, probe inserts 12×24cm 3.60g or SSRs (Proportion of 20×25cm 6.00g Metaphor agarose:Seakem agarose=2:1 or 1.5:1.5 for fine separation and resolution).

24×24cm 9.00g

试剂配方

1. 10×TBE, 但电泳时采用工作液位0.5 ×TBE

Table 5.2 10× TBE Gel Buffer (0.9 M Tris, 20 mM EDTA) Stock

Tris base (MW=121.10) Boric Acid (MW=61.83) 0.5 M EDTA pH 8.0

1 Liter 108.0g 55.0g 40.0ml

3 Liter 324.0g 165.0g 120.0ml

5 Liter 540.0g 275.0g 200.0ml

* pH to 8.0 with glacial acetic acid. A precipitate may form when stored for long periods of time. 2. 凝胶载样缓冲液：

0.25%溴酚蓝，40%（m/V）蔗糖水溶液, 4℃保存 protocols: 15.

Melt agarose in microwave oven, keeping covered to avoid evaporation and mixing

vigorously several times during heating. Make sure all the agarose is dissolved (it takes longer to

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dissolve than lower concentrations). The solution surface can be marked before heating and add dH2O up to the mark after heating, or weigh again after heating and make up for the evaporated weight with dH2O. Heat up one more time. 16.

Apply some vacuum to the flask containing the agarose solution to eliminate very small

bubbles created by much mixing. 17.

Cool to about 55℃ (if desired, the flask can be placed into cool water to speed cooling),

pour agarose solution right away into gel tray with taped ends and insert combs and leave it to solidify (20-30min). It could be cooled at 4℃ for 15 min before loading samples. We often prepare such gels one day ahead and keep them covered with Saran Wrap at 4℃. 18.

Remove tapes, place tray in electrophoresis rig and pour enough 0.5× TBE buffer (table

5.2) in to cover the gel by at least 0.5 cm. Remove combs only when ready to load samples. 19.

Run samples into gel according to the parameters in table 2.3 until the bromophenol blue

dye has migrated to just above the next set of wells. You may run gel at a higher rate, however resolution of the samples may suffer. Resolution can be improved by recirculating the buffer. 20.

Remove tray from rig and stain in 1μg/ml ethidium bromide (100μl of 10 mg/ml ethidium

bromide in 1000 ml dH2O) for 20 min with gentle shaking.

CAUTION: Ethidium bromide is extremely mutagenic—wear a lab gown and double gloves when handling and use extra precaution. 21.

Rinse gel in dH2O for 20 min, slide gel onto a UV transilluminator and photograph. For

Fotodyne PCM-10 camera with 20×26 cm hood and Type 667 Polaroid film use an f8 or f5.6, 1sec exposure. For Fotodyne MP-4 camera Type 665 Polaroid (negative) film use an f8 or f5.6, 2 min exposure.

注意事项

1．琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。 2．溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。

3．紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。

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实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析

实验目的

了解聚合酶链式反应的原理。

掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

实验原理

PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

材料

Amplify core sequence of Bt gene from genomic DNA of transgenic maize plant and plasmid (CK) with the method of polymerase chain reaction.

实验步骤

22.

On ice, in 0.2 ml centrifuge tube, add:

16

Stock ddH2O 10 × buffer 25 mmol/L MgCl2 2.5 mmol/L (each) dNTP 1 μmol/L (each) primers

Template DNA

10 ng/μl pCUSBK-Hyg ? ng/μl Genomic DNA 5 U/μl Taq

23.

For 20 μl Final concentration

Up to 20 μl 2.0 μl 2.0 μl 1.2 μl 5.0 μl 2.0 μl ? μl 0.2 μl

1 × 2.5 mmol/L 150 μmol/L 0.25 μmol/L 5 ng 50 ng 1 U

Amplify from maize genomic DNA with following program: 1 cycle of

30 cycles of 94℃ for 30 sec 55℃ for 30 sec 72℃ for 30 sec

1 cycle of 72℃ for 5 min

Keeping at

4℃

94℃ for 5 min

24.

Amplify from plasmid with following program: 1 cycle of

30 cycles of 94℃ for 10 sec 55℃ for 10 sec 72℃ for 30 sec

1 cycle of 72℃ for 5 min

Keeping at

4℃

94℃ for 1 min

NOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps. 25.

In 500 ml flask, add 2.0 g agarose and 200 ml 0.5 × TBE. Melt agarose in microwave oven,

mixing several times during heating. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation. 26. 27.

Tape ends of gel tray, insert comb, pour agarose in and allow to be solidified.

Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel

top face with 0.5 × TBE and remove comb. 28. one. 29.

Run electrophoresis at 85 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just Load Φ174 Hinc II in first well as molecular weight marker and amplified samples one by

above the next set of wells. 30.

Remove tray from tank, stain in 0.5 μg/ml EB for 10 min with gentle shaking.

17

31. 32. 33.

Destain in 10 mmol/L MgCl2 for 5 min with gentle shaking. Rinse in H2O for 10 min with gentle shaking. Take picture with ultraviolet light in gel image system.

18

实验六 核酸印迹技术-DIG标记探针的分子杂交

实验目的

掌握实验的核酸印迹技术基本原理，熟悉基本操作

实验原理

放射性核素因其灵敏度高而被人们利用在杂交筛选中，但它标记探针可利用时间短（放射性同位素有半衰期，如32P为14.2天），并且对人体有害，易污染环境，所以近年来逐步发展了非放射性杂交筛选。按照标记方法的不同,主要有两类, 一种是预先已连在NTP 或dNTP上, 因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合反应方法参入到核酸探针上, 如生物素, 地高辛等, 由于生物素等标记物是连接在碱基上, 而不是磷酸基团, 因此不能用多核苷酸激酶进行末端标记。 另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上, 如生物素化学标记法的主要思路是: 将生物素与另一种化学性质较活泼的基团相连, 在特定的条件下是活泼基团活化而与核苷酸特定部位共价结合。DIG（地高辛）、HRP（辣根过氧化物酶）及生物素等, 它们常通过显色，发光来显示杂交信号。本实验中就是通过连接臂共价连接在dUTP C11上，如图13所示。DIG标记的dUTP代替部分dTTP掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的DIG抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同

图13 DIG标记的dUTP化学分子结构

19

图14 Ap分解底物释放光子的反应过程

图15 DIG标记探针的Southern blotting过程示意图

材料，试剂和仪器

1 材料：模板 DNA转移的膜，待标DNA探针 2 试剂

1) DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒提供的试剂

浓缩的固体杂交液成分（DIG Easy Hyb granules），随机引物标记试剂(DIG-High Prime)，10×封闭液(Blocking solution)，DIG抗体-AP(Anti-Digoxigenin AP Conjugate)，反应底物CSPD(CSPD ready-to-use)

2）洗膜液： （1）2×SSC及0.1%SDS（2）0.5%SSC及0.1%SDS。 3）杂交及免疫反应所需附加的试剂

Maleic acid Buffer: 0.1M Maleic acid（顺丁烯二酸）及0.15M NaCl用固体NaOH pH至7.5。 Washing buffer: 0.1M Maleic acid（顺丁烯二酸）及0.15M NaCl,0.3%(v/v)tween20,用固体NaOH pH至7.5。

20

Detection Buffer：0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl及50mmol/L MgCl2调pH至9.5。 3仪器：恒温水浴震荡器（室温-100℃），杂交袋，水浴锅，暗盒。

实验步骤

1.DIG标记探针的制备

1) 取纯化好的待标DNA 1μg，体积为16μl，于100℃水浴中变性10min，取出后立即置于冰上5 min。

2) 在冰上加入4μl随机引物标记试剂,其中含有核苷酸混合物、随机引物、Klenow enzyme和反应缓冲液。混匀后置37℃保温至少1hr，可长至20h以提高标记量。 3) 加2ul 0.2M EDTA或65℃加热10min中止反应,置－20℃放置备用。 2.预杂交

将处理好的NC膜用2×SSC浸润5min后放到杂交袋中，加入预杂交液（用Maleic acid Buffer稀释10×封闭液为1×封闭液）50－100mL， 65℃预杂交30min-6hr。 3.杂交

将预杂交过的膜放入杂交袋中，加入5mL的杂交液（用灭菌ddH2O溶解浓缩的固体杂交液成分）。将标记好的探针沸水浴变性5－10min，冰上5min，加到杂交袋中，混匀，赶出气泡。42℃摇动杂交过夜。 4.洗膜

经过杂交的膜用洗膜液I（2×SSC, 0.1%SDS）室温下振动洗膜5min，重复一次。然后用洗膜液II（0.5×SSC, 0.1%SDS）60-68℃洗两次，每次15min。 5.免疫反应

1) 用50mLWashing buffer短暂浸膜1-5min。 2) 将膜置1×blocking solution 100mL中封闭30min。

3) 用1×blocking solution按1：10000稀释DIG抗体-AP至75mU/mL，将膜浸在10－20mL抗体溶液中30min。

4) 用100mL Washing buffer洗膜两次，每次15min。 5) 用20mL Detection Buffer平衡2～5min。 6．杂交信号检测

1）将杂交膜放入小塑料袋中，有DNA一面朝上，在上面加1mL反应底物CSPD。赶走气泡，使反应液均匀分布，封口后15-25℃平放5 min。倒掉反应液，封口，37℃放置10 min增强光子释放。

21

2）用保鲜膜包好，暗室中压X光片。曝光4-48hr。

注：光子的释放在最初的几个小时达到高峰，并能维持24-48 hr。

注意事项

DNA杂交信号没有或很弱可能有以下原因引起: 试剂过期;没用带正电荷的尼龙膜而用其他类型的膜；探针浓度低或标记效率差;抗体浓度低; 过度洗膜;曝光时间短。

杂交背景高可能由于预杂交时间短、洗膜不彻底、探针浓高、抗体浓度高和选用错误类型膜等原因引起。

思考题

1. 核酸杂交的各步试剂的作用是什么?其特异性取决于什么? 2. 放射性核素杂交和非放射性杂交的优缺点?

22

实验七 λDNAHindⅢ酶切鉴定

实验目的

通过本实验了解限制性内切酶的特性，学习和掌握根据具体目的设计适当的酶切体系。

实验原理

利用限制性内切酶切割DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切为后续工作提供了有效的实验材料。限制性核酸内切酶是一类能识别并水解双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。它的识别位点具有180°旋转对称的回文结构，一般能识别4-6个碱基对，并在特定位点切割，例如HindIII的识别序列：

。

限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。

本实验使用HindⅢ 酶对λDNA分子进行酶解，并通过琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。λDNA是噬菌体的基因组DNA, 是线状，双链的DNA, 大小约为48.5kb, 它的上面有7个HindⅢ 限制性内切酶的酶切位点，经过HindⅢ酶切之后就产生8个大小为23Kb，9.4Kb， 6.5Kb， 4.3Kb， 2.3Kb， 2.0Kb，564bp，125bp的片断，通过琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下可见到8条电泳条带。

实验步骤

In a 1.5 ml centrifuge tube, add ddH2O 12.5 μl, 10 × buffer 2.0 μl, 1 mg/ml acetylated BSA 2.0 μl, 0.35 μg/μl λDNA 3.0 μl, 16 U/μl HindⅢ restriction enzyme 0.5 μl. Incubate at 37℃ for at least 1 h.（加入试剂体积（μl）灭菌水 13，MULT buffer 2，λDNA 4，HindⅢ１，

总体积 2０ ）

NOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps.

1 In 250 ml flask, add 2.4 g agarose and 300 ml 0.5 × TBE (table 1). Melt agarose in microwave oven, mixing several times during heating. Add 2 μl GoldViewTM DNA dye. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation.

2 Tape ends of gel tray, insert comb, pour agarose in and allow to be solidified.

3 Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel

23

top face with 0.5 × TBE and remove comb.

4 Heat λDNA (30 ng/μl) and bromophenol blue loading buffer (table 2) mixture at 65℃ for 10 min and place immediately on ice for 5 min. Load in well as molecular weight marker. 5 Load samples.

6 Run electrophoresis at 125 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just above the next set of wells.

7 Remove tray from tank and take picture with ultraviolet light in gel image system.

注意事项

1 酶切反应体系依不同的酶、不同的酶切目的而异。

2 37℃保温一段时间后可取少量样品电泳检测。若已达到酶切目的可结束反应。 3 使用加热使酶失活应视限制性内切酶的特性而异；也可使用EDTA使酶失活。

24

实验八 DNA片段的纯化回收

实验目的

了解DNA片段的纯化回收基本原理，掌握基本技能

实验原理

载体及目的DNA 片断经酶切后，如果无多余的片断（如载体单切）可以直接酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收直接连接用。但多数还有多余片断（如载体双酶切后有插入片断但要回收空载体，多个目的DNA片断选择其一克隆），必须电泳分离后回收目的片断。回收的方法既有传统的方法，这些方法基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后通过酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收，也有公司生产的商品化的试剂盒可用，这些试剂盒多采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。

材料、试剂和仪器

材料

待回收DNA样品 试剂

1) 1% 低熔点胶，琼脂糖，

2) glassmilk kit: 裂解缓冲液，漂洗液，glassmilk 3) TE, ddH2O,

4) 酚/ 氯仿, 氯仿, 无水乙醇，70％乙醇，

5) DNA回收试剂盒: 树脂， 80％异丙醇，Syringe Barrel, 3仪器： 离心机 ， 水浴锅， 电泳仪

实验步骤

1 低熔点胶法：

1) 电泳到适当位置后在目的DNA条带的前端挖一长方形槽，向槽中加入融化的低熔 点胶，待凝固后进行电泳。当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳。紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。

2) 将切下的胶放到离心管中，加入200ul的TE，65℃温浴3min以融化低熔点胶。 3) 分别用酚/氯仿，氯仿抽提一次。

4) 取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀DNA 2hr以上，12 000rpm离心15min，弃上

25

清，用70%乙醇洗涤，吹干后溶于10ul无菌水中，取1ul电泳检测。 2. 冻融法:

1) 电泳后直接切下凝胶中目的条带后加200ul TE，再加2倍体积酚，在液氮中 冻2min ，再65℃水浴中融化10min，这样重复数次.

2) 10 000g离心5 min，取上相液加2倍体积100%冰乙醇-20℃沉淀过夜。 3) 离心回收DNA，70%乙醇洗一次后溶于适量的TE或无菌水中，电泳检测回收 效果。 3 Glassmilk法:

1) 0.8%琼脂糖凝胶电泳PCR或酶切产物。 2) 紫外灯下迅速切下目的条带,放入EP管中。

3) 在含胶的EP管中加入3倍体积的凝胶裂解缓冲液混匀。 4) 6 0℃水浴5min, 以融化凝胶。

5) 加入10ul glassmilk混匀 ,室温静置5min。 6) 8 000rpm离心1min，弃上清。 7) 加入125ul漂洗液混匀。 8) 8000rpm离心数秒钟,弃上清。 9) 再加入125ul漂洗液,如此反复两次。 10) 沉淀中加入适量无菌双蒸水混匀。 11) 60℃水浴5min。

12) 1 500rpm离心2min,回收上清,取10ul电泳检测。

2.2.4. 试剂盒法(Technical bulletin of Wizard PCR Preps DNA Purification system Promaga公司): 1) 电泳分离PCR产物。

2) 用干净无菌的刀片切割目的DNA条带，放入1.5mL Ep管中，积累凝胶至大约300ul。 3) 在装有凝胶的离心管中加入1mL树脂， 65℃水浴5min或直到凝胶完全溶解。 4) 拔出注射器活塞备用，将 Syringe Barrel和Minicolumn 连接。 5) 将树脂DNA混合液移入Syringe Barrel中，插入活塞缓慢将混合液推入 Minicolumn.

6) 分开syringe Barrel和Minicolumn ,去掉活塞。重新连接Syrringe Barrel和 Minicolumn, 加入2mL 80％异丙醇到Syringe中以洗柱子。插入活塞，缓慢将

26

异丙醇推入Minicolumn。

7) 去掉Syringe，将Minicolumn移入1.5mL离心管中，10 000g（半径5.5~6cm 13000rpm）离心2min以干燥树脂。

8) 将Minicolumn放入一新的离心管中，加入50ul ddH2O或TE到Minicolumn中， 放置1min，10000g，离心20sec。

9) 去除Minicolumn，将纯化的DNA贮存于4℃或-20℃。

结果分析

DNA纯化回收后, 电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带, 那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。

思考题

1 纯化回收DNA的目的是什么?

2 若DNA纯化回收后的电泳结果为两条带,那么可能有哪些原因？如何补救？

27

实验九 DNA体外重组

实验目的

了解DNA体外重组的基本原理，掌握基本技能

实验原理

载体与外源DNA分子体外重组时，如何选择优化连接条件以达到最高的重组率。因此有必要根据影响连接效率的因素综合考虑连接条件。影响连接效率的因素很多，如反应温度、插入片段和载体之间的摩尔比、DNA末端性质、反应时间、ATP浓度等。

1. 反应温度是比较重要的影响因素。因为连接酶的最适反应温度为37℃，但在此温度下仅含4-6bp的退火粘末端之间的氢键结合不稳定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒热运动的破坏，因此连接温度应介于酶的最适温度和粘末端退火温度之间，一般为4-22℃，平末端连接温度要更低些。退火粘末端之间的连接可视为分子内的连接，而平末端之间为分子间的连接。从分子动力学角度讲，后者更为复杂，且速度也要慢得多，因此平末端的连接效率要低一些为粘末端连接效率的1/10-1/100。一般采用如下组合：粘端连接反应16℃12小时或22℃4-5小时，平端连接反应4-8℃12小时。

2. 插入片段和载体之间的摩尔比经验值一般为3-10， 即插入片段要多于载体数，这样有利于提高重组率。一般的计算公式为：

载体(ng)×插入DNA长度(kb)

插入DNA分子的量（ng）= ——————————————× 比率（一般为3-10）

载体DNA长度（kb）

3.连接酶用量一般为0.1-2U,平端连接酶用量要高一些。

4.ATP浓度一般为10μΜ-1mM ,但载体环化受ATP浓度影响较大，当ATP浓度为0.1mM 环化程度最大。

5.如在反应缓冲液加一定浓度PEG可以提高连接效率。

材料，试剂和仪器

1 材料:质粒载体，插入DNA片段

2 试剂: Promega 公司的T4DNA连接酶试剂盒 3仪器：恒温水浴锅

实验步骤

1 连接

28

1) 采用20ul的体系，在灭菌的200μlEppendorf管中顺序加入： 载体DNA X ul （0.5 ug） PCR产物 X ul （1.0 ug） 10×Buffer 1.0ul

T4DNA Ligase 0.5ul （1.5U） 用ddH2O补足至终体积 10ul . 2）14-16℃连接反应过夜。

结果与分析

连接成功与否，有的实验指导书上建议连接后采用电泳检测，除载体和目的DNA片段外，还应出现一条或几条电泳相对滞后的重组DNA带，表明重组成功。这在载体和目的DNA片段充足的条件下检测不失为一种直观的方法。但如果载体和目的DNA片段量较少，这种

检测就不经济了，倒不如做载体和插入片段不同比例的连接体系能获得好结果。

29

实验十 重组DNA的蓝白筛选

实验目的

了解蓝白筛选的基本原理，掌握基本技能

实验原理

基因克隆的最后一道工序就是从众多的转化菌中筛选出目的阳性克隆并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得目的基因的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能或表达产物。从大量的菌落或噬菌斑中鉴定出重组子有许多方法，如插入失活法、抗性筛选、蓝白筛选、杂交筛选、免疫学筛选、酶切图谱鉴定、PCR鉴定等。而蓝白筛选常用在重组子和非重组子的初步筛选中，它是通过载体和宿主菌之间基因内互补来实现。许多载体（如pUC,pBS等）都是带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影响功能。若有外源基因插入多克隆位点则破坏编码读框产生没活性的α肽段。宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生其余肽段。两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。利用此方法仅通过目测就轻而一举地筛选出重组菌落。

材料，试剂和仪器

1 材料: 受体菌DH5α ，含lacZ`的重组质粒。 2 试剂:

1）LB固体培养基 2）LB液体培养基 4）0.1mol/L CaCl2 5）抗生素母液 6) 0.5mol/L IPTG 7) 100mg/mL X-gal

表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性机理 抗菌素名称

作用方式 30

抗性机能

氨苄青霉素（Amp） 母液:50mg/ml(溶水) 工作浓度:50ug/ml 氯酶素（Cml） 母液:34mg/ml(溶乙醇) 工作浓度:170ug/ml 卡那霉素（Kan） 母液:10mg/ml(溶水) 工作浓度:50ug/ml 链霉素（Sm） 母液:10mg/ml(溶水) 工作浓度:50ug/ml 四环素（Tet） 母液:5mg/ml(溶乙醇) 工作浓度:50ug/ml 这是一种青霉素的衍生氨苄青霉素抗性基因（bia物，它通过干扰细菌胞壁或ampr），编码的一种周合成之末端反应，而杀死质酶，即β－内酰胺酶，可生长的细胞 特异地切割氨苄青霉素的β－内酰胺环，从而使之失去杀菌的效力 这是一种抑菌剂，它通过氯酶素抗性基因（cai或同核糖体５０Ｓ亚基的结cmlr）编码的乙酰转移酶，合作用，干扰细胞蛋白质它特异地使氯霉素乙酰化的合成，并阻止肽键的形而失活 成 这是一种杀菌剂，它通过卡那霉素的抗性基因（kan同７０Ｓ核糖体的结合作或kanr）编码的氨基糖苷用，导致mRNA发生错读磷酸转移霉，可对卡那霉(misreading) 素进行修饰，从而阻止其同核糖体之间发生相互作用 这是一种杀菌剂，它通过链霉素抗性基因（str或同核糖体的３０Ｓ亚基的strr）编码的一种特异性结合作用，导致mRNA发霉，可对链霉素进行修饰，生错译 从而抑制其同核糖体３０Ｓ亚基的结合 这是一种抑菌剂，它通过四环素抗性基因（tet或同核糖体３０Ｓ亚基之间tetr）编码的一种特异性的的结合作用，阻止细菌蛋蛋白质，可对细菌的膜结白质的合成 构进行修饰，从而阻止四环素通过细胞膜从培养基 31

中转运到细胞内

3仪器: 恒温摇床， 冰冻离心机，恒温培养箱， CaCl2转化法

(1) 划线复壮宿主菌37℃过夜。挑一单菌落于30mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇至OD600=0.2-0.4，取出置于冰上10-15min。

(2) 取1mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中。4℃,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清， 吸干残存培养基，加500μl冰预冷的0.1M CaCl2,重悬菌体，置冰浴15-30min。

4℃,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干水，加100μl冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体。放置于4℃用于转化，若不用则加30%甘油置-70℃备存。

(3) 加入10μl连接产物到100ul感受态细胞中，轻旋以混和内含物，置于冰上30min。 (4) 42℃热休克90sec，不要摇动试管。置冰上1-2min。 (5) 加400ul 液体培养基，37℃150rpm摇培45-60min。

(6) 微波炉融化LB固体培养基，待冷却至50℃左右时，根据载体的抗性加入相应的抗生素，如Km 母液至终浓度50ug/mL或Amp母液至终浓度60ug/mL ，摇匀。趁热倒平板，每板20mL左右，室温下凝固10-15min。

(7) 取适量菌液（体积别超过200 ul，如果想多涂菌可以先室温下5000rpm离心5min回收细胞，弃去一部分培养基后，重悬细菌后再涂），加入5ul IPTG（0.5M） 和30ul X-gal (100mg/mL) ，混匀，加到抗性平板上，用烧过灭菌的涂布器涂布器涂匀，涂布器应凉下来用，否则容易烫死细菌。

(8) 培养皿用石蜡膜封好后，37℃倒置培养过夜。待出现蓝色时取出放在4℃冰箱中，使其颜色更加明显。

注意: 1 ）质粒DNA要纯 2 ）受体细菌的OD600nm=0.3-0.4 3） 重组质粒的体积小于转化菌液体积的1/10。

结果与分析

若抗性平板上出现白色菌落，说明连接的重组质粒被转化。根据蓝白的比例可以判断重组率，根据菌落数目可以计算出转化率。一般来说采用定向连接的重组质粒的重组率较高，而平末端或单一酶切位点连接的重组率较低。

32

转化是一定设不加质粒只含感受态宿主菌的负对照和加入已知抗性的质粒的正对照，以便分析结果。如果负对照长出菌落说明感受态宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正对照没出来，说明感受态细胞有问题或加错抗生素或操作过程中造成细菌死亡（如涂布时烫死）。

图6 蓝白筛选

思考题

1 转化的原理是什么?转化注意事项? 2 蓝白筛选的意义和原理?

33

第二章 植物基因转化技术

实验一 农杆菌浸染的油菜花瓣转化表达GUS基因试验

实验目的

转基因植物在近代工业、医药业、特别是农业等各个领域的研究和应用越来越为人类所重视。通过农杆菌对植物植株、器官、组织及细胞的侵染进行质粒转化，是将外源基因导入目的植物的重要方法之一。本实验使同学了解农杆菌对植物质粒转化的基本原理及具体操作过程，从而对转基因植物的产生和外源基因转入植物后产生的特殊性状具有更加感性的认识。

实验原理

将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。如转基因的抗虫棉花，通过人们的改造，使棉花在生长过程中体内能够自主地产生抵抗害虫的毒素，以达到自我保护、减少农药使用增产增收的目的。

随着科学家的不断探索，将人们获得的有用基因转入目的植物方法发展较快，现有农杆菌介导法、基因枪轰击法、细胞显微注射法、花粉管真空渗透法、化学法及电穿孔法等，其中农杆菌介导法是今仍然广泛使用的一种有效转化方法。农杆菌介导法所使用的质粒载体分根癌农杆菌和发根农杆菌两大类。在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。 Ri质粒具有普通的质粒的特点：是细菌染色体外的遗传物质，能独立复制，为闭合环状双链DNA。它是非必要的遗传物质，一般控制细菌的次要性状，可自我复制并具有遗传的稳定性，在特殊环境中对细菌的生存起着重要的作用。它具有可转移性、可重组性、可整合性、可消除性等特点。Ri质粒的环状基因可按功能可分为Vir、T-DNA、Ori三个区，该三个功能区在对植物的浸染与表达中分工明确。

Vir区的作用：该区基因不发生转移，但它在T-DNA转移的过程中起着十分重要的作用，这个区的缺矢或突变会使发根农杆菌的菌株丧失对植物的侵染能力。Vir区7个基因群（A-G）的A一直处于活性表达状态而其它的6个基因通常情况下处于抑制状态。发根农

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杆菌感染寄主时，被损伤的植物细胞会合成特殊的小分子酚类化合物乙酰丁香酮等，此时其可以与Vir区A基因的表达产物结合，诱导其它的联合基因的活化，从而发生感染过程。 T-DNA区的特点与功能：T-DNA区的基因群具有致使发状根产生（包括生长素合成）的有关基因、冠瘿碱合成的有关基因以及某些抗性标记基因和特殊的酶切位点。其在侵染的过程中转移到寄主的细胞中与其DNA相整合，从而随寄主细胞中的DNA进行复制和表达。由于真核细胞中才具有T-DNA区的基因群中某些基因（如生长素合成的有关基因、冠瘿碱合成的有关基因等）的功能启动子，因而这些基因只能在寄主真核细胞中转录表达，在农杆菌中处于抑制状态。

Ori区的功能：在农杆菌中启动质粒DNA的复制。

农杆菌将T-DNA转入寄主的过程：首先受伤的植物从伤口处产生特殊的小分子酚类化合物乙酰丁香酮等，与Vir区A基因的表达产物结合，诱导其它的联合基因的活化，从而发生感染过程，T-DNA区的两端先后单链短裂，短裂下来的单链T-DNA被转移到植物细胞中与植物的基因组随机的整合，Ri质粒中移走的T-DNA区通过DNA复制得到修复，因此尽管发生了单链T-DNA的转移，发根农杆菌细胞没有因此丧失任何遗传信息。

β-葡糖苷酸酶基因，简称Gus基因，是从大肠杆菌中分离克隆到的一个基因。当它的产物β-葡聚苷酸酶与特定的生色底物X-Gluc试剂结合，能产生特定的蓝颜色反应 (β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到) ，因此，常作为植物转基因研究中的报道基因。用X-Gluc试剂溶液处理该基因转化后的植物组织，通过组织化学的染色反应，来“报道”植物是否被转化，基因是否被导入。油菜基因组中不存在Gus基因，因此，油菜的组织与X-Gluc试剂溶液不可能产生蓝颜色反应。

通过农杆菌介导的转基因方法，把Gus基因导入至油菜的花瓣，用X-Gluc试剂溶液处理，花瓣呈蓝色反应，证明Gus基因已经整合至这一植株的染色体中。(由于Gus基因的插入是随机的，而且，不可能同时插入在一对同源染色体的同一位点上，因此，染色体上的外源Gus基因在减数分裂过程中，会随同源染色体发生分离重组。这样转基因植株上收获的种子，用X-Gluc试剂溶液处理，籽粒中出现颜色分离。这种颜色反应和籽粒颜色分离可以通过实验直接被观察到。而且，可通过卡方测验，来检测籽粒颜色分离是否符合孟德尔的分离规律。)

试剂及配方

浸染液：A: 50mmol/L 磷酸钠缓冲液（ph7.0）A:NaH2PO4.2H2O 3.12g 定容100ml B:

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Na2HPO4.12H2O 7.17g定容100ml A取39ml B取61ml 混合定容100ml

农杆菌OD值1.8-2.0（500ml的液体培养出来的农杆菌可以和1L的缓冲液混合1:2）

实验步骤

1) 取浸染液浸染油菜花序，把那些太小的和已经开花的去掉，也要去掉腋芽，要浸泡的是含苞欲放的花蕾、花蕾下面的嫩叶及腋芽，浸泡5分钟。此后间隔1、3、5天重复浸泡。 2) 浸染后挂牌在上面写上自己的名字。

3) 瞬时表达检测取浸渍后7-10天的材料：浸泡几天后就开花了检测花瓣或新长出的腋芽或柱头或花蕾下面的嫩叶。

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实验二 基因枪介导的基因转化实验

实验目的

掌握基因枪介导转化的原理和方法

实验原理

基因枪法，又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。它是继农杆菌介导转化法之后又一应用广泛的遗传转化技术。这种方法操作简单，效率高，适应性强。一次可以向数以千计的细胞导人基因，不受细胞、组织或器官的类型限制，此外其目标命中率高，因此格外受重视。基因枪根据其加速装置可分为火药式、电动式和气动式。

经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导人细胞或原生质体，获得整合与表达的目的。微弹复合体对受体细孢造成的损伤可以修复。

实验步骤

1 取金粉悬液（60mg直径1.5一3.0 p m的金粉用无水乙醇消毒，悬浮于Iml 无菌水中）25p 1， 加人5,ug 质粒DNA,50 y1 2 .5mol/L,2Cal 20川0.1m ol/L亚精胺，充分混匀，离心，无水乙醇沉淀，重新悬于60风无水乙醇，备用。

2 可裂膜选用1550psi，将可裂膜、载体膜事先用70％乙醇浸泡半小时，在超净工作台晾干。 3 每次吸取10风DNA－金粉复合体涂布于载体膜，充分晾干

4 选取生长状态旺盛、大小一致的愈伤组织进行轰击，靶材料距离可裂膜6cm，每皿受体

材料轰击1次。

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实验三 转化目的基因的检测- GUS组织化学染色

实验目的

掌握GUS组织化学染色方法

实验原理

适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

实验材料

转基因油菜花瓣

药品试剂

1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100μL，保存于-20℃。 2) 底物溶液（染色液）：

1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-100 染色液：50mmol/L 磷酸钠缓冲液（ph7.0）中含：0.1mol/L K3[Fe(CN)6] +0.1mol/L K4[Fe(CN)6] +10mol/L Na2EDTA+ 0.001%(v/v) Tritonx-100+0.1-0.3% x-gluc(注：母液两周内使用有效，最好现用现配) 实验器材

小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器

实验步骤

1 将材料放在5ml的离心管里面，管中预先加入2ml的染色液，回到实验室用抽气机抽气10-20min。

2 放入30度恒温箱过夜培养。

3 70%酒精脱色2-24小时（除去叶绿素），中途换酒精。 4 第二天镜检,白色背景上的蓝色斑点既是GUS表达位点。

实验结果

花瓣上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

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第三章 植物育种分子标记技术 实验一 RAPD分子标记技术

实验目的

运用PCR-RAPD 分子标记技术，对不同种植物的基因组DNA进行PCR扩增，获得指纹图谱。同时运用统计分析方法，计算不同物种的遗传距离，得出物种间的亲缘关系。

实验原理

随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技术之上的一种分子标记方法，它是以一系列不同随机排列的寡聚核酸单链为引物，对于所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性。对于任一特定的RAPD引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点，这些位点在基因组某些区域内的分布符合PCR反应的条件，即随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的3’端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段，如果基因组在这些区域发生DNA的片段的插入或者缺失，或者碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生变化，而使PCR产物增加或者减少，发生分子量的变化，通过对于PCR产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。

实验材料

土豆、玉米等农作物

试剂及仪器

10×buffer: 500mM KCl

100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４×dNTP: 1mM

引物： 3种RAPD引物 5.0uM 模板： 20ng/μl Taq酶： 5u/μl

PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统

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实验方法

１．向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl

引物 2μl 模板DNA(20ng) 4μl 总体积 25μl 反应体系混匀，离心

3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 94℃变性 １分钟 36℃退火 １分钟 72℃延伸 ２分钟 经过40个循环

4．７２℃延伸反应7分钟。

5．取20μl反应液加4μl Loading buffer在 6. 1.5％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结 8 数据处理与统计分析

用“1”(有) 和“0”(无) 记录谱带，把图形资料转换成数据资料。根据Jacard相似系数法，求得品种i 和j 之间的遗传相似性系数(F)，再根据D=1-F, 用SPSS软件进行聚类分析，构建分子进化系统树，进行遗传多样性和遗传关系分析。

结果分析

根据RAPD扩增结果计算: 1.遗传相似性系数 S S = 2 Nxy / (Nx + Ny)

Nxy为种间共有的扩增带，Nx为X种具有的扩增带，Ny为Y种具有的扩增带

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