半数致死量的测定

半数致死量的测定

半数致死量（LD50）是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。

由于生物间存在个体差异性，因此 LD50需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得，并且每种药物不同实验对象的 LD50值不相同。

测定 LD50的方法很多，如目测机率单位法、直线回归法、累计法及序贯法等。由于寇氏法较常用，并有计算简便，结果较准确等特点，故专门介绍之。 【目的】用寇氏法测定敌百虫对小白鼠的经腹腔注射的 LD50和95%可信限。 【方法】寇氏法（ Karber法 ） 【条件】

1.剂量必须按等比级数（剂量对数按等级数）分组。 2.各组动物数应相等。

3.“反应”应大致呈正态分布。最小剂量组的死亡率（Pn）应为0%，最大剂量组的死亡率（Pm）应为100%；

如果 Pn<20%或Pm>80%需用校正公式计算；如Pn>20%或Pm<80% 则不能用此法计算。 【步骤】 1.预备实验

（1）摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（Dm）和一个动物也不死亡的最大剂量（Dn）。

方法是据经验或文献定出一个估计量，观察 2～3只动物的死亡情况。如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出Pm=100%和Pn=0%的剂量，此两量分别为上下限。

（2）确定组数，组距及各组剂量

①组数：一般5～8组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定5组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。

②组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“d”来表示。D不宜过大，因过大可使标准误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或减少）而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可作为敏感性大小的标志。距离大，说明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求d应小于 0.155，多在 0.08～0.1之间。

③确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为 XK，下限剂量的对数值为X1，组数为G，则：d＝（XK-X1）/（G-1）

④确定各组剂量：由X1逐次加d（或由XK）逐次减d），得出各组剂量的对数值，再分别查反对数，即得出各组剂量（呈等比级数排列）。

（3）配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如 0.5ml/20g ）。 2.正式实验

（1）实验动物的选择与分组

①选择原则：可根据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。LD50常用小白鼠进行实验来测得。

②分组原则：每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数，就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共8组，每组10只动物，高剂量三个组的死亡数分别为6、9、10，但如果每组只用6只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是6。）

③分组方法：见附录，实验对象分组法。首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合编组，然后按体重分群，再随机分组，为求使各组平均体重相等。 （2）给药、观察死亡数、求出死亡率

①给药途径：可据不同药物及动物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可静脉注射。 ②给药顺序：宜采取间隔跳组方法。如共7组，先按2、4、6 组顺序给药，然后逆行按7、 5、3、1组的顺序给药。这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。而且当第3组给药后，如第2组动物已经全死，则可省下第1组动物及1号药液。如第7组已死亡，可补做第8组，争取做出0%死亡率的组来。每只动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。

③观察时间：直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡。 最后将死亡情况及各种数据填入下表中。 LD50计算表：

3.计算公式

①基本公式 lg LD50＝XK－d(∑P-0.5) 式中：XK死亡率为100%组的对数剂量

d对数组距 ∑P各组死亡率之和

②校正公式

当Pm>0.8或Pn<0.2时可用下公式计算 lg LD50＝XK－d(∑P--1

3?Pm?Pn) 4③ LD50＝lglgLD50，单位应换算成mg∕kg 或g∕kg表示。 ④ 95%可信限：

LD50±4.5S ㏒ LD50·LD 50 S ㏒LD50 ＝d√∑p（1-p）/（n-1） 式中：S ㏒ LD50是 ㏒ LD 50 的标准误

P各组死亡率 n每组动物数

【测定 LD 50 的原理及公式来源】

为了解LD50测定原理，首先需了解剂量与反应的关系。某被试因素对动物的毒性也是一种反应，其大小往往以其使动物致死的量表示。致死量小说明毒性大，反之说明毒性小。根据剂量与反应的关系，可绘出剂量反应曲线（量效曲线）。图中表示的是以死亡频数和死亡率为反应指标的质反应量效曲线，它们具有如下特点：

1.剂量与死亡频数的关系：是一条中间高，两侧低，右侧延长较远的曲线（图 5-a） 2.对数剂量与死亡频数的关系：是正态分布曲线（图 5-b）

3.剂量与死亡率的关系：是一条长尾“S”形曲线（图 5-d） 4.对数剂量与死亡率的关系：是一正“S”形曲线（图 5-c）

从对数剂量与死亡频率的正态分布中（5-b）可见，lg LD50恰在正态曲线中点所对应的横轴上，按此剂量给药动物恰好死亡一半。因在正态曲线中，其中点恰是均数所在处，所以lg LD50就是全部实验动物最小致死剂量对数的算术平均值（也是真数剂量的几何平均值）。 从对数剂量与死亡率关系的正S形曲线（图 5-c）中可见，lg LD50恰为正S形曲线中点所对应的横轴上的对数值，因此正S形曲线中点对应的纵轴（死亡率）恰为50%。这条曲线的特点是：①死亡率为50%（即LD50）时的斜率最大，由于其位于曲线中央，故灵敏度最高。②曲线两端平坦，接近0%或100%附近灵敏度最差，剂量不易确定，而且即使确定了也常不可靠。所以采用半数致死量做为判定某因素毒性大小的指标是恰当的。总之，如果求出正态曲线中点所对应的横轴上的对数值或正S形曲线中点所对应的横轴上的对数值，即可求出lg LD50及LD50。

公式推导：根据对数剂量与死亡率关系的量数曲线，通过面积法可得出公式： lg LD50=XK–d∑（Pi–Pi+1）/2

图中横坐标为对数剂量X，纵坐标为死亡率P，G为正S形曲线中点，它对应的纵坐标H点P＝50%，横坐标F点X＝lg LD50，A点P＝0%＝0，D点P＝100%＝1，B点XK为P＝100%的对数剂量。

由图可知：矩形AFED＝AF×AD＝lg LD50×1＝lg LD50 又：曲边△X1FG≌曲边△GCE（二边一角相等）

∴矩形AFED＝曲边形AX1CD＝lg LD50 则lg LD50＝矩形AXKCD－曲边形X1XKC。 ∵曲边形X1XKC相当于多个梯形面积之总合。 ∴曲边形X1XKC＝d×∑(Pi+Pi+1)/2 又矩形 AXKCD＝AXK×XKC＝XK×1＝XK ∴lg LD50＝XK-d∑(Pi+Pi+1)/2 上述推导过程用直观图表示：

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