人参皂甙 Rh2对人乳腺癌MCF7AdrR细胞增殖和凋亡的影响

人参皂甙 Rh2对人乳腺癌MCF7AdrR细胞增殖和凋亡的影响

人参皂甙- Rh2对人乳腺癌MCF7/AdrR细胞增殖和凋亡的影响

Efficacy ofGensenoside Rh2 on proliferation and apoptosis forMCF7 /AdrR human

breast cell line

摘要: 目的 研究人参皂甙- Rh2 ( GS- Rh2 ) 对乳腺癌MCF7 /AdrR细胞增殖和

凋亡的影响。方法 以MCF7 /AdrR细胞不加药物干预, 作为对照组; 以Rh2单独 作用于MCF7 /AdrR 细胞, 作为Rh2 组; 以低浓度阿霉素( ADM ) 单独作用于

MCF7 /AdrR细胞, 作为ADM 组; 以Rh2和阿霉素联用于MCF7 /AdrR 细胞, 作为 Rh2 + ADM 组。用MTT比色法观察GS- Rh2对体外培养的MCF7 /AdrR 细胞

生长的抑制作用; 用荧光显微镜观察用药前后MCF7 /AdrR 细胞的形态学变化;

用流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期变化; 用W estern blot的方法检测Fas、

Bax、Bc l- 2及Bcl- xL蛋白表达的变化。结果 MCF7 /AdrR 细胞经GS- Rh2

作用后, 生长受抑制, 呈剂量和时间依赖性; 显微镜显示, 经GS- Rh2作用后,

MCF7 /AdrR细胞呈较明显的凋亡形态学改变, GS - Rh2能将细胞周期阻滞于

G0 /G1期, 同时可能参与促凋亡蛋白Fas、Bax 表达升高及抑制凋亡蛋白Bcl- 2

表达降低; 但在GS- Rh2处理前后Bc l- xL无明显变化。结论 GS - Rh2能抑

制体外培养的MCF7 /AdrR 细胞增殖并诱导其凋亡, 且这种作用可能是通过上调 Fas、Bax表达、下调B cl- 2表达以及阻滞细胞周期而实现。

关键词: 人参皂甙- Rh2; 乳腺癌; 细胞凋亡

中图分类号: R737 9; R979 1 文献标识码: A

文章编号: 1001- 6821( 2010) 12- 0923- 05

Abstract: Objective To exam ine the effect of GensenosideRh2 ( GSRh2

) on proliferation and apoptosisMCF7 /AdrR human breast cell line

Methods MCF7 /AdrR ce lls w ere d iv ided into contro l group, added w ith

normal saline; ADM group, added w ith adriamyc in(ADM ) at the low con

centration; Rh2 group, added w ith Rh2; and ADM + Rh2 group, added

w ith ADM at the low concen trat ion and Rh2 Ce ll grow th inh ib ition w as

evaluated by MTT co lorimetric assay C ellu larmorpho logy w as observed

underm icroscope Apoptot ic cells and the changes of cell cyclew ere de

term ined by flow cytom etry Western b lo tw as used to detect the prote in expression o f Fas, Bax, B cl- 2 and B cl- xL Results The inh ib itiono fGS - Rh2 on the grow th o fMCF7 /AdrR ce lls w as in a t ime- and

dose- dependent manner byMTT GS- Rh2 w as capab le o f arresting the cell cyc le at G0 /G1 phase Pro- apopto tic factors, Fas and Bax w ere re

markably h igher than contro l cells, wh ile the an ti- apopto tic factors, Bc l- 2 w ere sign ificantly low er than contro l ce lls, but the expression o f Bc l- xL prote in did no t change significan tly Conclusion GS- Rh2 exh ibited grow th inh ib ition e ffect and induced apoptosis onMCF7 /AdrR cell

line in vitroApoptosis ofMCF7 /AdrR cells induced by GS- Rh2 maybe

related w ith arrest ing ce ll cycle, up- regulating Fas, Bax protein expression and down- regulating mutated B cl- 2 pro

tein expression

Keywords: G ensenoside Rh2; breast cancer; apoptosis cell

近年研究发现[ 1, 2] , 人参具有抗癌活性, 其主要活性成分人参皂苷能诱导细胞分化和凋亡, 从而发挥抗

人参皂甙 Rh2对人乳腺癌MCF7AdrR细胞增殖和凋亡的影响

肿瘤作用。人参皂苷单体Rh2 ( G - Rh2 )是从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合, 是人

参的主要抗癌成分。国内外报道[ 3- 9] , Rh2对多种肿

瘤细胞(如小鼠黑色素瘤B16细胞、C6胶质瘤细胞、

人肝癌细胞SK- HEP- 1等)具有增殖抑制和诱导凋

亡作用。为此本实验以人乳腺癌MCF7 /AdrR 细胞株

为受试细胞, 研究GS - Rh2的诱导凋亡作用, 旨在进

一步阐明人参抗肿瘤作用机制, 为其应用于肿瘤的临床治疗提供实验依据。

材料与方法

1 材料

细胞培养 人耐药乳腺癌细胞MCF7 /AdrR, 购自中国科学院上海细胞研究所; 细胞贴壁生长, 用含

10%胎牛血清的RPM I1640培养基, 加阿霉素维持其

耐药性, 于37 、5% CO2、95% 空气饱和湿度培养箱

培养, 适时传代。

药品与试剂 人参单体Rh2, 纯度﹥ 98% , 上海

融禾医药科技发展有限公司提供; 盐酸阿霉素( adria

myc in, ADM ), 浙江海正药业公司提供。四甲基偶氮

唑盐, 购自上海实生生物有限公司; 兔抗Fas( 1 500)

多克隆抗体、鼠抗Bax ( 1 500)单克隆抗体、鼠抗Bc l- 2( 1 500 )单克隆抗体和兔抗B cl- xL( 1 500) 多克隆抗体, 均购自美国Santa C ruz公司; 鼠抗- ac

tin单克隆抗体, 购自美国S igma公司; 二抗(羊抗兔

及羊抗鼠) , 购自美国Rockland公司; TR ITC 标记的

羊抗鼠IgG, 购自上海鼎国生物技术有限公司; Ho

echst 33258细胞凋亡检测试剂盒, 购自碧云天生物

技术研究所。

仪器 培养箱和超净工作台, Thermo Forma公司

产品; 垂直式电泳仪和湿转装置, 购自美国B io- Rad公

司; 低温高速离心机, 美国Beckman coulter公司产品;

酶标仪, 美国Mou lar Dev ice 公司产品; 倒置显微镜, 日

本N ikon公司产品。

2 方法

21 分组

将对数生长的MCF7 /AdrR细胞, 按下述均分成6组: ! 对照组: 细胞加入等量的溶剂; ADM 组: 细胞加阿霉素1 g# mL- 1; Rh2组: 细胞加Rh2 40 mo l#L- 1; %ADM + 3 个剂量Rh2组: 细胞加阿霉素1 g#mL- 1和分别加不同浓度( 20, 40, 80 mo l# L- 1 )Rh2。22 MTT法检测GS- Rh2对细胞生长的抑制作用

取对数期细胞制成细胞悬液, MCF7 /Adr以4 &

103个细胞/孔接种于96孔板, 每孔100 L, 24 h 后,

药物组加入不同浓度的GS - Rh2, 使终浓度分别为

10, 20, 40, 80, 160 mo l# L- 1; 对照组与空白对照组加

培养液100 L。

分别在加药后24, 48, 72 h, 用MTT法检测各孔中

细胞的抑制率。用酶标仪检测490 nm 处吸光度值

人参皂甙 Rh2对人乳腺癌MCF7AdrR细胞增殖和凋亡的影响

(A ) , 每组设3个复孔, 实验至少重复3 次。按下列

公式计算抑制率( IR)。

IR(% ) = ( 1- Ates t /Acontrol ) &100%

23 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

将1 & 105 cell# mL- 1细胞接种于置有盖玻片的

六孔板中, 待细胞生长至70% ~ 80% 融合时, 用含05%新生牛血清的1640培液同步化20 h, 加入相应的药物继续培养24 h, 结束培养, 弃培液; 按照Hoechst 33258细胞凋亡检测试剂盒说明书进行: 室温固定10m in, 用PBS室温洗涤5m in & 3次; 加入Hoechst33258染色液, 室温染色5 m in后, 用抗荧光淬灭封片液封片; 荧光显微镜下观察并拍照, H oechst 33258激发波长345 nm, 发射波长487 nm, 阳性信号呈蓝色,凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染,

实验至少重复3次。

24 流式细胞仪

将1 &106 ce ll# mL- 1细胞接种于6 cm培养皿中,待细胞生长至70% ~ 80%融合时, 用含05%新生牛血清的1640培液同步化20 h, 加入相应的药物继续培养48 h, 结束培养, 收集培液, 可细胞刮勺, 轻柔刮下贴壁细胞, 用预冷的PBS吹打, 转移培液和细胞, 至预冷的 15mL离心管中, 于4 、2000 r# m in- 1离心5m in, 弃上清; 加入预冷的柠檬酸固定液1 mL, 重悬细胞。送中国科学院上海细胞生物研究所, 作流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期, 实验至少重复3次。

25 Western blot检测

当细胞生长融合至30% ~ 40% 时, 将MCF7 /AdrR细胞的培养液, 加入相应的药物作用48 h后, 细胞裂解液提取细胞总蛋白, 定量后取等量样本, 进行SDS- PAGE 电泳分离; 然后将蛋白转移至PVDF 膜上。将膜在封闭液中封闭2 h, 分别与Fas、Bax、B cl-2和Bc l- x l以及- actin 的一抗于4 孵育过夜。洗膜后, 再与二抗室温孵育1 h; TBST室温洗膜5 m in& 3次; 将膜转入新鲜配制的ECL化学发光孵育液中, 室温孵育5m in; 转入X 光暗盒中, 曝光3 m in, 显

影, 定影, 实验均至少重复3次。

3 统计学方法

用SPSS100软件完成统计学处理, 实验数据以

均数 标准差表示, 组间分析比较采用t检验, P <

005表示差异有统计学意义。

结 果

1 GS- Rh2对MCF7 /AdrR细胞增殖抑制作用

用MTT法检测GS- Rh2对MCF7 /AdrR细胞增殖

抑制作用, 结果发现GS- Rh2能明显抑制MCF7 /AdrR

细胞的增殖, 其抑制作用呈现出剂量- 时间依赖性,

与对照组比较有统计学差异(P < 005), 见表1。

表1 不同浓度人参皂甙Rh2 ( GS - Rh2 ) 在不同时间点对

MCF7 /AdrR细胞的增殖抑制作用

Table 1 Inh ibito ry of the CS- Rh2 on the MCF7 /AdrR ce lls at

the d ifferen t tim e

Con cen tration

( m ol# L- 1 )

T im e after add the CS- Rh2 ( h )

人参皂甙 Rh2对人乳腺癌MCF7AdrR细胞增殖和凋亡的影响

24 48 72

Con trol 0 0 0

T rial

20 0 11 0 01# 016 0 01# 0 19 0 01#

40 0 21 0 01# 025 0 00# 0 40 0 00#

80 0 45 0 01# 049 0 02# 0 53 0 02#

160 0 56 0 01# 061 0 02# 0 64 0 00#

320 0 66 0 01# 069 0 01# 0 72 0 01#

Con tro:l Norm al saline; Tria:l D ifference concen trat ion of GS - Rh2; Com

pared w ith con tro,l # P < 0 05

2 荧光染色检测细胞凋亡情况

Hoeehst 33258染色后, 荧光显微镜下可见(图1),

对照组(图1A )的细胞核圆而大, 染色质分布均匀, 表现为弥散均匀的荧光; ADM 组(图1B )与Rh2组(图1C) , 细胞核大部分形态及染色质分布, 与对照组相似;而少量细胞核染色质聚集, 荧光呈颗粒分布, 细胞凋亡核占( 52 14)% , 与对照组比较无统计学差异(P >005)。ADM + Rh2组(图1D)细胞核数目明显减少, 有大量固缩变形的细胞核, 染色质浓缩, 表现为致密浓染的荧光颗粒, 有凋亡小体形成, 尤其ADM与Rh2大剂量

图1 H oechst 33258染色后荧光检测结果

F igure 1 Fluorescence detection o fMCF7/AdrR breast ce ll sta ined w ith

H oechst 33258 sta in ing

ACon trol; BAdriam ycin ( ADM, 1 g# mL- 1 ) ; C GS - Rh2 ( 40 m ol#

L- 1 ) ; DADM ( 1 g# mL- 1 ) + GS - Rh2 ( 40 mo l# L- 1 )

联合用药组, 凋亡最明显; 细胞凋亡核占( 755

26)%, 与对照组比较有统计学差异(P < 001)。

3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况对照组细胞凋亡峰低平, Rh2组与ADM 组凋亡峰

高度与对照组接近, 对照组凋亡细胞百分率为( 1451 121)% , Rh2 组为1620% , ADM 组为1520%, Rh2组和ADM 组与对照组比较差异无统汁学意义(P > 005)。

Rh2 + ADM组, 出现明显高尖的凋亡峰, ADM + 3个不同浓度Rh2组, 凋亡细胞百分率分别为2627%,3915%, 4708% , 与对照组比较差异有统计学意义

(P < 001, 表2)。

4 流式细胞术检测细胞周期结果

Rh2组与ADM组与对照组的接近, 细胞周期Rh2组和ADM组与对照组比较差异无统汁学意义( P >005)。ADM + 各浓度Rh2组作用于MCF7 /AdrR 细胞株, 均出现诱导G0 /G1期阻滞, 阻滞细胞由G1期向S期的转化, 随Rh2作用浓度的增加, G0 /G1期细胞含量上升, S期细胞下降, G2 /M 期与对照组比较无明显的变化, 见表3。5 Western blot检测凋亡相关蛋白表达Rh2组和ADM 组的Fas、Bax、Bcl- 2、B cl- x l蛋白表达与对照组比较差异无统汁学意义。ADM + Rh2不同浓度组作用于MCF7 /AdrR 细胞使Fas、Bax 蛋白的表达增高, Rh2浓度为80 mo l# L- 1时, 蛋白表达增高最明显, Bcl- 2蛋白的表达降低, Bc l- x l蛋白的表达在药物作用前后无明显的变化(图2)。

讨 论

肿瘤的发生发展是一种多基因、多步骤、多阶段的复杂过程, 许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。本研究证实, 人参中的活性成分人参皂苷- ( GS - Rh2 ) 能抑制人乳腺癌MCF7 /A drR细胞增殖并诱导其凋亡。

人参皂甙 Rh2对人乳腺癌MCF7AdrR细胞增殖和凋亡的影响

细胞凋亡是受基因调控的、主动的细胞死亡过程, 有其特征性的形态和生化特征。凋亡细胞的主要特征是细胞增殖抑制, 流式细胞仪可检测到出现凋亡细胞特征峰( sub- G1峰), 细胞胞浆浓缩致密, 核染色质凝集, 核裂解形成凋亡小体。本实验从形态学、流式细胞仪检测, 来确认细胞凋亡的发生。增殖抑制实验结果表明, 3个浓度( 40, 80, 160 mo l# L- 1 ) Rh2

均能使MCF7 /AdrR 细胞数量明显下降, 其抑制作用呈明显的剂量- 时间依赖性。Andrew s等[ 10 ] 认为, 细胞凋亡是由正常的细胞周期改变引起的, 细胞凋亡与细胞周期阻滞有关, 细胞阻滞于哪一期, 凋亡就发生在哪一期[ 11] 。

现代药理学研究证实, 人参中含有多种具有抗肿瘤作用的皂苷, 它们能诱导细胞凋亡及引 起细胞周期阻滞, 从而抑制肿瘤生长。本实验用流式细胞仪检测也表明: 3个浓度( 20, 40, 80 mo l# L- 1 )Rh2 + ADM 组, 均能使MCF7 /AdrR 细胞发生明显的凋亡, 凋亡细胞百分率分别为2627%, 3915%,4708%。而且Rh2 + ADM 组还能诱导MCF7 /AdrR细胞的G0 /G1期阻滞, 阻滞细胞由G1期向S 期转化,Rh2 + ADM 组随Rh2作用浓度的增加, 使G0 /G1期细胞含量上升及S期细胞下降, 表明GS - Rh2可通过抑制细胞DNA 的合成, 来诱导细胞发生凋亡, 推断这可能是GS- Rh2完成其抗肿瘤作用的机制之一。通过Hoechst 33258染色观察了Rh2对MCF7 /AdrR 细胞凋亡的情况, 均发现有典型的凋亡细胞, 并可见到凋亡小体。 Bc l- 2基因已证实为癌基因; Bax作用则相反。B cl- 2和Bax形成了细胞凋亡的正负调控, 诱导细胞凋亡[ 12] 。本实验结果显示, 随Rh2 + ADM 组的Rh2浓度增加, Bc l- 2 /B ax 比例下调, 而B c l- x l蛋白的表达, 在药物作用前后无明显的变化, 说明GS- Rh2诱导MCF7 /A drR 细胞的凋亡过程, 可能是下调B cl- 2 蛋白和上调B ax 蛋白的表达, 通过凋亡通路中线粒体的途径实现的。Fas是肿瘤坏死因子受体( TNFR ) 和神经生长因子( NGF) 受体家族的细胞表面分子, Fas配体( FasL) 是TNF 家族的细胞表面分子。Fas /FasL 的主要作用是可以触发细胞凋亡。本实验结果显示, Fas蛋白表达, 随药物浓度的增加而明显增强, 说明GS - Rh2能上调MCF7 /AdrR 细胞表面的Fas蛋白表达, 通过凋亡通路中的死亡受体通路, 促进细胞凋亡。提示GS- Rh2可以通过调节凋亡相关蛋白的表达, 参与调控人乳腺癌细胞的凋亡。 肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有密切的关系。许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。Jia 等[ 13] 研究表明, 人参皂苷单体Rh2能增加多药耐药细胞株对化疗的敏感性。本实验结果显示, GS - Rh2与ADM 联用有抑制MCF7 /AdrR细胞增殖并诱导其凋亡的作用, 这为开发抗耐药乳腺癌新药提供了实验依据。

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