原位杂交流程

原位杂交流程 卢朝晖 整理

以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针，对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有，但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的，因此特加以综合供同行参考，在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中，常常可以买到已经标记好的商品探针，那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去，从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次，可获满意结果。 主要操作步骤： 制备感受态细菌

用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定

大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒

电泳分离、回收及纯化 标记探针

石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理

抗体连接、显色

制备感受态细菌

【试剂及配制】 1．LB液体培养基

在900ml三蒸水中加入： 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g

磁力搅拌使完全溶解，用5mol NaOH调节pH至7.0（如用进口试剂则不必调）。定容为1000ml，高压灭菌20min。 2．0.1mol CaCl2溶液：

1.1g无水氯化钙，溶于90ml三蒸水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中，4℃保存。

【材料】

大肠杆菌单菌落或冻存菌种，也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。

【操作方法】

1．从37℃培养12～16h的平板中用无菌的接种环（用前酒精灯烧红晾凉）挑一单菌落，转入含有5ml LB培养基的无菌试管，37℃振摇 （200r/min）过夜。次日取菌液1ml加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶，37℃振摇培养（200～300r/min）约2～3h，将烧瓶取出立即置冰浴10～15min；

2．以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中；

3．4℃离心，5000g × 10min，回收细菌；

4．弃去培养液，将管倒置于滤纸上1min，流尽培养液；

5．用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体，置冰浴30min； 6．4℃离心，5000g × 10min，弃上清，倒置于滤纸上1min； 7．加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 ，重悬菌体，动作要轻； 8．置4℃冰箱12～24h，即可用于转化。

感受态细菌的冻存

一次制备的感受态不能用完，可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中，沸水浴10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份，每份加30%体积的甘油，充分混匀，置-70℃冰箱，一年内可使用。

用含目的基因的质粒转化细菌

【试剂及配制】 1．LB液体培养基

2．氨苄青霉素（Amp）选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂（15g/L），高压灭菌20min，取出，在无菌条件下，冷却至50℃左右时（烧手但尚可忍受）加入抗生素或其他必需成分，如为氨苄青霉素（Amp）选择性培养基，则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入，即每ml培养基加入1μl氨基苄。 3．氨苄贮存液

将氨苄青霉素钠溶于三蒸水，配成50mg/ml溶液，以0.22μm滤纸过滤，1ml一份分装，存于-20℃。

【操作方法】

1．无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的感受态细菌时，将其从-70℃冰箱取出，握于手中，待其解冻后立即吸取200μl 转移至10ml无菌玻璃试管中，剩余的感受态弃去，不能再冻存复用；

2．每管加质粒50～100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min； 3．42℃ 水浴热休克90s，不要摇动试管；

4．每管加无抗生素的LB培养基1ml，37℃摇床温和摇振（100～150r/min）45min； 5．用无菌的弯头玻璃铺菌器（用前酒精灯烧，再晾凉）将200μl菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃放置20min，然后倒置培养14～20h（37℃）。

小量培养转化的细菌

【操作方法】

1．取灭菌处理的10ml 玻璃试管，用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基，再加入50mg/ml 氨苄青霉素5μl；

2．用接种环或无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，晃动使细菌进入培养液，封好管口；

3．37℃摇床100～200r/min，约6～12h，可过夜，使生长饱和。

质粒的少量提取

【试剂及配制】 1．溶液Ⅰ

葡萄糖（C6H12O6·H2O） 1.982g 三蒸水 160ml

0.5mol EDTA pH8.0 4ml 1mol Tris-Cl pH8.0 5ml

以三蒸水定容至200ml，高压灭菌，4℃保存 0.5 mol EDTA pH8.0 的配制： Na2EDTA·H2O 186.1g （如无水，则为175g） 三蒸水 700ml

边磁力搅拌边加入固体NaOH，缓慢少量加入，待充分溶解，pH接近8.0，用酸度计调节pH8.0 （HCl/NaOH）；

1mol Tris-Cl pH8.0 的配制： Tris 碱 121g 三蒸水 800ml

充分搅拌，用浓盐酸将pH调节至8.0，酸度计测量； 2．溶液Ⅱ

配制50ml的量，现用现配。 10 mol NaOH 1ml 三蒸水 40ml 10% SDS 5ml

用三蒸水定容至50ml 10mol NaOH 的配制：

40g NaOH晶体加三蒸水至100ml； 10% SDS 的配制：

戴口罩，称10g SDS，溶于80ml三蒸水中，68℃助溶，加数滴1mol HCl，调pH7.2，定容至100ml；

1mol HCl 的配制：

于通风橱中，三蒸水91.4ml，浓盐酸8.6ml，混匀； 3．溶液Ⅲ

5mol 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 三蒸水 28.5ml

高压灭菌，4℃保存； 5mol 乙酸钾配制：200ml 乙酸钾 98.14g 三蒸水 160ml

搅拌溶解，定容至200ml;

4．3ml 乙酸钠（NaAc）pH5.2 配制：500ml

乙酸钠（CH3COONa·H2O） 201.1g 三蒸水 200ml

用冰乙酸调节pH为5.2，三蒸水定容至500ml，高压灭菌，4℃保存。 5．平衡酚

在粗酚中加入0.1% 8-巯基喹啉，然后倒入0.1mol Tris-Cl pH8.0，避光磁力搅拌4h，静置后移去水相，再加0.1mol Tris-Cl pH8.0，搅拌、去除水相，反复进行，直到水相pH>7.8时为止，装棕色瓶，4℃保存。 6．TE 缓冲液 pH8.0

配制最终使：10mmol Tris-Cl pH8.0 1mmol EDTA pH8.0

7．其它试剂：氯仿：乙戊醇（V/V=24：1）、无水乙醇、70%乙醇

【操作方法】

1．取1ml菌液置于1.5ml的EP管中，10000g×30s 离心； 2．控尽上清液；

3．加溶液Ⅰ 100μl，重悬菌体；

4．加溶液Ⅱ 200μl ，倒转均匀； 5．加溶液Ⅲ 150μl ，混匀； 6．10000g×5min 离心； 7．转移上清至另一EP管；

8．加等体积平衡酚混匀，室温离心，8000g×5min；

9．小心吸取上清，转移至另一EP管中，勿将酚层吸出； 10．重复8、9的步骤；

11．等体积氯仿：乙戊醇，混匀； 12．离心，8000g×5min； 13．转移上清至另一EP管；

14．加1/10体积3mol NaAc pH5.2 和2.5倍体积的无水乙醇，混匀； 15．置液氮10min 或-20℃冰箱1h； 16．离心，10000g×10min；

17．弃上清，留沉淀，70%乙醇洗一次； 18．离心，10000g×10min； 19．弃上清，留沉淀，晾干；

20．加TE pH8.0 50μl ，溶解沉淀；

21．加RNase A (10mg/ml) 3～5μl 混匀，稍离心； 22．37℃ 水浴30 min； 23．-20℃ 保存待用。

小量酶切质粒

鉴定常用20μl反应体系。

【操作方法】

1．在灭菌的新EP管中加入7μl三蒸水； 2．加入10×缓冲液2μl ； 3．加限制酶5μl ；

4．最后加入质粒DNA10μl ； 5．稍离心，混匀； 6．37℃水浴1～1.5h；

7．无水乙醇沉淀（2.5倍体积无水乙醇，混匀液氮10min或-20℃ 30min，离心）； 8．弃上清，晾干，加10μl TE，建立第二个酶切体系，37℃ 1～1.5h； 电泳鉴定

【试剂及配制】 1．0.5× TBE 先配5× TBE贮存液，然后用三蒸水稀释10倍； 5× TBE配制：1000ml Tris 碱 54g 硼酸 27.5g

0.5mol EDTA pH8.0 2ml 2．EB ：10mg/ml 3．琼脂糖 4．上样缓冲液 0.25% 溴酚蓝

0.25% 二甲苯青FF 30%甘油

【操作方法】

1．用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端，放好梳齿，水平放置于工作台上； 2．0.5× TBE + 琼脂糖 （1%），电炉上融化，勿暴沸，待其冷却至50～60℃ 时，加入EB约5μl ，充分混匀；

3．将凝胶倒入胶模，厚约3～5mm，避免产生气泡；

4．在室温中放置30～45min，撕去胶带纸，放入电泳槽，电泳槽内为0.5× TBE，应没过凝胶，去除梳齿，预电泳10min；

5．将DNA样品与上样缓冲液混合，加进上样孔内，应设一marker作对照； 6．60～100V恒压电泳，使DNA向阳极移动（黑线为负极，红线为正极）；

7．电泳完成后，戴塑料手套，取出胶盒，将凝胶放紫外灯下观察有无切出的电泳带。

大量培养转化的细菌

小量酶切鉴定证实细菌内含有目的基因，即可大量培养。

【操作方法】

在500ml灭菌处理过的培养瓶中加LB培养基200ml，加入50mg/ml的氨苄贮存液200μl ，将小量培养的菌液取2ml加入瓶中，37℃ 200～300r/min，振摇培养6～10h，可过夜。

大量提取质粒

常用碱裂解法。

【试剂及配制】 1.溶液Ⅰ 2.溶液Ⅱ 3.溶液Ⅲ 4.异丙醇

5.3mol NaAc pH5.2 6.平衡酚 pH8.0

7.氯仿：乙戊醇 （24：1） 8.无水乙醇 9.70%乙醇 10.TE pH8.0

11.RNase A (10mg/ml) 12.溶菌酶

取100mg 溶菌酶，用2ml三蒸水溶解，分装成200μl /管，贮存于-20℃ 备用

【操作方法】

1．扩增好的菌液装入50ml离心管中，置冰浴10min； 2．4℃离心，5000× 10 min；

3．将沉底的细菌收集到一只50ml离心管中，再离心，弃上清，将离心管倒置滤纸上1 min，控干残液；

4．加入6ml冰预冷的溶液Ⅰ ，200μl 溶菌酶，充分振摇混匀； 5．加溶液Ⅱ10ml，缓慢振摇以充分混匀内容物，室温放置10min；

6．加入8ml冰预冷的溶液Ⅲ ，小心摇动离心管以混匀内容物，置冰酒精浴10min； 7．4℃离心，10000g × 10min；

8．小心倒出上清，弃沉淀，如有沉淀，再次离心；

9．加入0.6体积异丙醇，充分混匀，-20℃ 放置20min； 10．4℃离心，10000g × 10min；

11．弃上清，晾干，2ml TE pH8.0 溶解沉淀； 12．加入2ml冰预冷的5mol LiCl 溶液并混匀； 13．4℃离心，10000g × 10min；

14．将上清转移至另一离心管，加入0.6体积异丙醇，充分混匀，-20℃ 放置20min； 15．4℃离心，10000g × 10min；

16．弃上清，70%乙醇洗一次，4℃离心，10000g × 10min，弃上清，晾干； 17．将沉淀溶于1.2ml TE pH8.0中；

18．加RNase A 30μl ，封管口，37℃ 水浴30min； 19．将样品分装2个EP管，各加等体积平衡酚，混合； 20．室温离心，5000g× 5min；

21．将上层水相转移至另一EP管，小心勿吸出酚相；

22．重复平衡酚抽提；

23．等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提； 24．室温离心，5000g× 5min； 25．回收上层水相，勿吸出氯仿； 26．加1/10体积3mol NaAC (pH5.2)，再加2.5体积无水乙醇，充分混匀，置-20℃ 30min或液氮10min；

27．室温离心，12000g× 15min；

28．弃上清，70%乙醇洗一次，再离心；

29．晾干，溶于500μl TE pH8.0，-20℃ 保存；

30．取2 μl 稀释至200μl ，用紫外分光光度计测260nm、280nm OD值，OD260/OD280=1.7～2.0，如小于1.7，蛋白未提净，大于2.0，有机溶剂多。DNA含量为OD260× 50 （μg /ml）。

大量酶切质粒

【操作方法】

1．在新的灭菌EP管中依次加入： 三蒸水 70μl 10× 缓冲液 10μl 限制酶 5μl

质粒DNA（2μg /μl） 15μl 稍离心以混匀；

2．37℃ 水浴1.5～2h；

3．取5μl 电泳鉴定酶解效果，如不完全，可延长时间或加限制酶；

4．双酶解反应：如两种酶可用同一缓冲液，则可同时加入一个体系，稍增加反应体积，否则以乙醇沉淀，晾干，重建第二个反应体系。

电泳分离、回收及纯化DNA片段

电泳的方法如前述，不同点在于：① 使用低熔点琼脂糖，在4℃ 冰箱中电泳；② 将2～3个梳齿用透明胶布粘在一起，以增加上样量。

从低熔点琼脂糖中回收及纯化DNA：

【操作方法】

1．在紫外灯下将含有所需DNA片段的凝胶条切下，放入EP管中，加入2倍体积的TE缓冲液，在70℃ 保温10min，使凝胶条融化；

2．冷却至室温，加等体积平衡酚，充分混匀后以6000g离心10min，回收水相，注意不要将界面处的白色物质（即粉状的琼脂糖）吸出，再用等体积的氯仿/乙戊醇抽提一次；

3．将上清液转移到一个新的离心管中，加入0.2体积的10mol的乙酸胺和2倍体积的无水乙醇，置-20℃ 冰箱20min，离心沉淀核酸，晾干后以TE 溶解。取2μl 稀释至200μl 测DNA浓度。 标记探针

使用Boehringer Mannheim 地高辛标记探针试剂盒。

【操作方法】

1．1μl 模板DNA加灭菌三蒸水至最终体积为16μl ； 2．10min沸水浴，立即冰乙醇冷轧；

3．加入4μl 探针标记液（试剂盒中vial 1），稍微离心，混匀； 4．37℃ 水浴20h；

5．加入2μl 0.2mol EDTA pH8.0 或加热65℃ 10min以终止反应。

石蜡切片的处理

【试剂及配制】 1．二甲苯

2．乙醇（100%，95%，90%，75%） 3．甲醇

4．0.2mol HCl

5．0.1% Triton X-100 6．0.2%甘氨酸PBS 7．5mmol MgCl2-PBS 8．PBS

配制：配成10× 的贮存液，用时稀释10倍 NaCl 80g 137mmol KCl 2g 2.7mmol Na2HPO4·7H2O 11.5g 4.3mmol KH2PO4 2g 1.4mmol

配成1000ml，pH7.3，高压灭菌。 9．蛋白酶K

0.1mol Tris-Cl pH8.0 加 50mmol EDTA pH8.0 配制浓度为1μg/ml。

10．4%多聚甲醛 在通风橱中配制：称40g多聚甲醛溶于装有500ml DEPC 水的烧瓶中，加热65℃ 并磁力搅拌，使成乳白色悬液，用1mol NaOH 调节 pH7.0，呈清亮状，再加入约450ml 的2× PBS，充分混匀，再检查pH，过滤后定容至1000ml，4℃ 保存。

【操作方法】

1．将烤好的切片入二甲苯Ⅰ 30min，二甲苯Ⅱ 、Ⅲ 各10min；

2．逐级酒精入水（100%、95%、90%、75%）各5min，甲醇冲洗5min× 2； 3．用三蒸水或PBS快速洗2次；

4．0.2mol HCl 室温作用10min， 0.1% Triton X-100 作用15min； 5．0.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min； 6．蛋白酶K37℃ 消化15～30min； 7．0.2%甘氨酸-PBS室温孵育15min； 8．PBS-5mmol MgCl2洗2次，各10min； 9．4%多聚甲醛室温下固定15min；

10．PBS-5mmol MgCl2洗2次，各10min； 11．逐级酒精脱水，37℃烤干保存。

预杂交、杂交

【试剂及配制】 1．2× SSC 先配制20× SSC贮存液，用时稀释。 NaCl 175g 3mol

枸椽酸三钠·2H2O 88g 0.3mol

三蒸水加至1000ml，用1mol HCl 调pH7.0 2．4× SSC/50%去离子甲酰胺（V/V） 去离子甲酰胺的配制：500ml 甲酰胺与25g Bio-Rad AG 501-X8(20～50目) 混合，室温避光搅拌4h，过滤，分装为50ml ，-20℃ 存放； 3．100× Denhardt液 聚蔗糖 10g

聚乙烯吡咯烷酮 10g 牛血清白蛋白 10g

消毒三蒸水定容至100ml 4．预杂交液

去离子甲酰胺 5ml 20× SSC 2.5ml

加温至50℃ ，加入硫酸葡聚糖 1g

聚合物溶解后，加入100× Denhardt 500μl 10%SDS 500μl

10mg/ml变性鲱鱼精子DNA 100μl 消毒三蒸水 400μl 充分混合； 5．杂交液

将标记好的探针用沸水浴10min，立即冰酒精冷轧，用预杂交液将探针稀释至0.5～5ng/μl 。

【操作方法】 1．用2× SSC 简洗15min； 2．4× SSC/50%去离子甲酰胺37℃ 孵育15min；

3．每片加预杂交液50μl ，放入湿盒，42℃ 孵育2h；

4．去除预杂交液，每片加杂交液50μl ，放湿盒中，42℃ 杂交12～18h，不能超过24h。

杂交后处理

【试剂及配制】 1．2× SSC 2．2× SSC/50%去离子甲酰胺 3．1× SSC/50%去离子甲酰胺 4．PBS 5．4× SSC/10mmol DTT

先配制1mol DTT：通风橱中称3.1g DTT，溶于20ml消毒三蒸水中，用时取2ml 加入198ml 4× SSC

【操作方法】

1．杂交完毕后，用2× SSC洗涤1～2min； 2．2× SSC/50%去离子甲酰胺42℃ 10min； 3．1× SSC/50%去离子甲酰胺 37℃ 30min； 4．4× SSC/10mmol DTT 1h； 5．0.1× SSC 40℃ 2× 30min；

6．PBS洗10min，然后置于PBS中，直到进行下一步。

抗体连接、显色

【试剂及配制】 1．缓冲液Ⅰ

配1000ml,需加入 顺丁烯二酸 11.6g NaCl 8.8g

用10mol NaOH 将pH调至7.5，高压消毒； 2．缓冲液Ⅱ

先制备阻断剂储存液：取试剂盒中阻断剂按10%（V/V）加入溶液Ⅰ ，混匀，用微波炉加热使其完全溶解，高压消毒后4℃ 或-20℃ 保存。用时取上述10%阻断剂储存液用缓冲液Ⅰ 按1：10稀释即制成缓冲液Ⅱ ； 3．缓冲液Ⅲ pH9.5 配制1000ml：

Tris-Cl 12.1g 100mmol NaOH 5.84g 100mmol MgCl2 10.2g 50mmol 4．缓冲液Ⅳ pH8.0 Tris-Cl (pH8.0) 10mmol EDTA (pH8.0) 1mmol

【操作方法】 1．2× SSC洗涤，2× 5min，40℃ ； 2．0.1× SSC，2× 30min，40℃ ； 3．缓冲液Ⅰ 洗，室温2min，振摇； 4．缓冲液Ⅱ 洗，室温30min，振摇；

5．擦去组织周围缓冲液，加抗地高辛抗体（vial 4，1：500～5000，用缓冲液Ⅱ 稀释），室温下于湿盒内2h； 6．缓冲液Ⅰ 室温洗2× 15min； 7．缓冲液Ⅲ 室温洗3 min；

8．擦去组织周围缓冲液，加显色液（vial 5，200μl 用缓冲液Ⅱ 稀释至10ml ），放湿盒中，室温避光显色2h至过夜；

9．显微镜下检查，阳性颗粒显深蓝色，获满意结果后终止反应； 10．缓冲液Ⅰ 洗涤，室温5min； 11．缓冲液Ⅳ 洗涤，室温2min；

12．用中性红或核固红复染细胞核数秒，水冲洗，晾干后甘油封片。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kjo3.html