2012色谱技术实验讲义

实验一 中药提取液HPLC梯度洗脱条件的优化

一、目的

1．掌握高效液相色谱分析中，梯度洗脱条件的决定因素。 2．熟悉HPLC梯度洗脱条件优化的思路。 二、提要

对于成分复杂的中药提取液，测定其HPLC指纹图谱一般采用梯度洗脱的方法。而梯度洗脱条件主要受梯度范围（梯度起始浓度和终止浓度）、梯度斜度及强溶剂种类的影响。其中梯度范围和梯度斜度决定流动相的洗脱强度，可以通过调整梯度范围和梯度斜度，使样品组分的k’值符合1＜k’＜20范围；而强溶剂的种类决定流动相的选择性。本实验主要考察不同洗脱系统的溶剂强度对于梯度分离条件的影响。

三、实验条件 1．高效液相色谱仪；

2．ODS柱（C18, 4.6mm×150mm, 5μm或4.6mm×250mm, 5μm）； 3．流动相：乙腈－水；流速：1ml/min。 4．检测器：DAD检测器，检测波长254nm。 5．样品：大黄70%甲醇超声提取液 6. 进样量：20 μL

7. 柱温：35 ℃。

四、操作步骤

1．以乙腈—水（5:95），90min至乙腈（100%），保持10min，观察样品分离效果。 2．根据分离结果，调整梯度范围和斜度，即调整乙腈的起始浓度和终止浓度，及浓度变化速率，使中药提取液各主要组分的K’分布范围在1～20之间。观察各组分的分离度。

3．分析实验结果，观察流动相起始浓度、终止浓度及浓度变化速率对各组分保留时间及分离度的影响。

五、思考题

1．梯度洗脱中，如果色谱峰集中在整个分析时间的中间段，即在洗脱的开始和结束的时间里没有组分出现，应如何调整梯度范围？

答：初始浓度高点，中间段浓度变化速率慢点，终止浓度变小。

实验二 中药挥发油气相色谱分析条件的选择

一、目的

１．练习气相色谱仪的使用，了解气相色谱仪的基本结构。 ２．掌握柱温的变化对组分保留时间及分离度的影响。 ３．掌握程序升温对复杂样品分离度及分析时间的影响。 二、提要

对于宽沸程的样品分析，采用程序升温（单阶程序升温、多阶程序升温），在分析过程中柱温随时间而变化，通常是升高柱温。它的优点是减少分析时间。程序升温条件选择是确定初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间。

三、仪器与试剂

（1）气相色谱仪（FID检测器）； （2）微量注射器（1μl）；

（3）样品：中药挥发油-当归挥发油 四、操作步骤

１．设置实验条件：色谱柱：甲基苯基交联硅烷柱(30m×0.32mm, 0.52μm)；检测室300℃，气化室250℃；载气流量：N2 1.0ml/min；分流比80 : 1。

程序升温条件（初始试验条件）：初始温度50℃，以3℃/min 升至 110℃（保持3 min）；以2℃/min 升至200℃（保持5 min）；再以8℃/min 升至240℃（保持5 min）。

2．根据试验结果，调整初始温度、终止温度以及升温速率，可根据需要设置阶梯形程序升温分离。

五、思考题

程序升温的初始温度、终止温度及升温速率的对分离度会有什么影响？

实验三 液相色谱-质谱分析（HPLC-MS）

一、目的

1．练习液相色谱-质谱仪的操作，熟悉液质工作站的使用。 2．掌握HPLC-MS常用的离子源和质量分析器的类型及应用。 二、提要

液质联用技术发挥了色谱分离的长处和质谱能进行定性结构分析的优势，可用于不挥发性、极性和热不稳定性化合物的测定，还可以对大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定。

根据化合物的性质，选择离子源：分子量、极性、挥发性、热稳定性等。样品分子极性强（如有机酸碱），建议采用ESI电离方式。 化合物极性低，可采用APCI电离方式（如甾体化合物）。

离子监测模式有正离子模式和负离子模式，有机酸及含有较多强电负性基团的物质，用负离子模式电离，可以观察到不同的分子离子；有机碱（如生物碱），采用正离子模式电离，用甲酸或乙酸酸化，可能会观察到不同的分子离子

三、试剂与仪器

（1）液相色谱-质谱仪（离子阱检测器）； （2）质谱工作站；

（3）样品溶液：黑附子水提液 四、操作步骤 1．实验条件：

色谱参数：进样口250℃，分流进样，分流比30:1，色谱柱：甲基苯基硅烷柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气流量：1.2ml/min（He），接口温度280℃，柱温：60℃，保持1min，15℃/min，升到200℃，保持1min。

质谱参数：溶剂延迟1min，SCAN：30-400质量数，SIM：自选参数 进样量：0.1 μl

2. 仪器稳定后作自动调谐；

3. 调谐完成后，分别用SCAN及SIM采集样品的色谱图，通过气质工作站检索各色谱峰可能的结构，讨论、比较两种方法的差异及特点。

五、注意事项：

1.流动相中不能含有非挥发性盐类（如磷酸缓冲盐和离子对试剂）

实验四 混合染料TLC分离条件的三角形优化

一、目的

1．掌握溶剂极性参数与展开剂洗脱强度之间的关系； 2．掌握溶剂的三角形分组对展开剂选择性的影响； 3．熟悉三角形优化法在TLC分离条件选择中的应用。 二、提要

溶剂与溶质分子之间主要考虑其偶极作用力和氢键作用力，按它们的大小，即给出质子的能力、接受质子的能力、偶极矩的大小，把常用的溶剂分为8类。处于同一组的溶剂，在色谱分离中具有相似的选择性；在分组三角形中相差较远的组中的溶剂，其选择性相差较大。为改善选择性，要根据组分的性质，选择合适的溶剂；而利用多元溶剂，既可调节K值，又可调节选择性。用统计方法可以帮助确定溶剂强度及选择性的多组分样品的分离条件，例如Glajch三角形优化法。

图4-1 溶剂选择性分类图

表4-1 溶剂选择性分类表

组别 I II III

脂肪族醚、三烷基胺 脂肪醇

吡啶衍生物、THF、酰胺（除甲酰胺外）、乙二醇醚、亚砜

溶剂名称

IV V VI VII VIII

乙二醇、苯甲醇、甲酰胺、乙酸 CH2Cl2、二氯乙烷 酮、酯、腈、聚酯

卤代芳氢、芳氢、芳香醚、硝基化合物 水、氯仿、间甲苯酚、氟烷醇

表4-2 常用溶剂的溶剂参数

溶 剂 环己烷 乙醚 乙醇 异丙醇 正丁醇 四氢呋喃 乙酸 二氯甲烷 丙酮 乙酸乙酯 乙腈 苯 氯仿

三、仪器与试剂

（1）层析槽、点样毛细管、量筒（10ml, 25ml）； （2）硅胶G预制板；

（3）正己烷、乙醚、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、乙酸、二氯甲烷、丙酮、乙

溶剂参数P’

0.1 2.8 4.3 3.9 3.9 4.0 6.0 3.1 5.1 4.4 5.8 2.7 4.1

所属组别

Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵa Ⅵa Ⅶb Ⅶ Ⅷ

酸乙酯、乙腈、苯、氯仿（分析纯）；

（4）混和染料溶液（对羟基偶氮苯、对氨基偶氮苯、二甲黄、苏丹Ⅲ的苯溶液）及对照品溶液。

四、操作步骤

用统计方法确定溶剂强度及选择性的多组分样品的分离。该法用四种溶剂组成十种配比的流动相(其中三种二元体系、三种三元体系与四种四元体系)，在薄层色谱中多用其中七种流动相(见图)作为优化过程的展开溶剂。三角形优化法步骤如下：

1. 预试：选用某种溶剂体系作为展开剂，在硅板上展开样品，调整溶剂的配比，使样品斑点Rf值落入0.2～0.8之间。实验表明，P’值在2.4左右时，说明该二元溶剂的洗脱能力适宜(极性适宜)。按下式计算该二元溶剂的P'值：

P'＝P’ax十P’b(1-x)＝2.4 2. 三角形优化法展开剂的设定

先选三种选择性相差大的纯溶剂，再选一种调节极性用的纯溶剂（正己烷或环己烷），组成三个等洗脱强度 (P’= 2.4) 的二元基本溶剂：①、②及③，其组成分别为A、B及C。将这三个基本二元溶剂置于等边三角形的三个顶点上。由顶点分别向对边作垂线，与对边的交点(即对边1/2处）组成三个三元溶剂系统④、⑤和⑥，它们的组成(A/B/C)分别为0/0.5/0.5/、0.5/0/0.5、0.5/0.5/0。每条垂线的交点，构成一个四元溶剂系统⑦，其组成A/B/C＝0.33/0.33/0.33，见图4-2。

图4-2 溶剂系统三角形优化法

各实验溶剂的组成

①～⑦为七个实验组的溶剂配比A/B/C

3. 分别将混合染料溶液和对照品溶液点样（点样量1cm），展开，比较不同展开体系对样品各组分分离度和保留值的影响。

五、注意事项：

1．点样原点直径控制在2~3mm之间。 2．展开时层析槽要放平坦。

3．展开剂中含水量的多少影响分离，故用干燥的仪器。 4．展开前，层析槽内先用蒸气饱和，组分的Rf值易于重现。

实验五 有机化合物的毛细管区带电泳分析

实验目的

1、通过实验熟悉毛细管电泳仪的基本原理和操作。 2、了解在毛细管区带点泳中分离电压对迁移时间的影响。 二、实验原理

本实验是运用毛细管区带电泳对三种有机化合物进行分离分析。在一定的电场强度下，各组分的迁移速度与场强及其淌度和电渗流淌度的关系如下：

? =(uep+ueo)E

式中，?是待测组分的迁移速度，m/s；E是外加电场强度，?/m，等于分离电压除以毛细管总长度；uep是待测组分淌度，m2 /(S·V) ；ueo是电渗流淌度，m2 /(S·V)。

在一定的实验条件下，待测组分的有效淌度不同，在给定电场强度下的迁移速度也不同，从而达到将待测组分分离的目的。

仪器与试剂

仪器：Beackman P/ACE 2200毛细管电泳仪； 毛细管：75 um i.d. ×40/47cm石英毛细管； 分离电压：20kV（正极进样，负极检测） 进样时间：5s（电压进样）； 检测器；紫外254nm； 温度：30℃

试剂：缓冲溶液：用去离子水配制20mmol/L磷酸二氢钠缓冲溶液，用0.1mol/L NaOH调节缓冲溶液的PH值为5.8；

0.1M的NaOH

样品溶液：吡啶，苯酚，苯甲酸钠储备溶液的浓度均为1﹪，实验前用去离子水稀释5倍进样。

四、实验内容与步骤

1、打开Beackman P/ACE 2200毛细管电泳仪和控制计算机的电源，进入Gold软件，根据上述仪器中所给的条件设置仪器参数。

2、在每次分离之前，分别用0.1mol/LNaOH溶液和去离子水清洗毛细管1min，用分离缓冲溶液平衡毛细管3min。

3、分别对单组分析样品进行分析，确定各组分的迁移时间。

4、配制三种组分含量均为2g/L的混合样品，并在与上述仪器中设置的相同的条件下进

行分离。

5、依次改变分离电压为15KV,25KV,30KV.考察分离电压的改变对各组分迁移时间的影响，及对混合样品分离的影响。

五、注意事项

1、在实验过程中，应注意随时补充清洗毛细管用的水、酸、碱和缓冲溶液。 2、在分离过程中，单位长度毛细管的功率应低于0.05W/cm,以免损坏毛细管。 3、在试验结束后，请用去离子水清洗毛细管，以免残留的缓冲溶液堵塞毛细管。 六、数据处理

记录各个组分在不同分离电压下的迁移时间，填入下表，根据实验原理中的迁移速度关系式讨论分离电压对组分迁移速度的影响。注意：在仪器设置的实验条件下，电渗流淌度和正离子的淌度为正值，而负离子的淌度为负值。

不同电压下组分的迁移时间（min） 电压/kV 15 25 30 七、思考题

（1）根据3种物质的酸碱离解常数，确定各自在分离条件下的形态及其极性，试解释3种组分的出峰次序。

（2）讨论电压对组分迁移时间的影响。

吡啶

苯酚

苯甲酸钠

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