液相色谱方法开发与应用培训班_part4_方法开发

岛津液相色谱分离条件优化思路

岛津国际贸易(上海)有限公司分析仪器事业部 分析中心

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建立HPLC方法步骤(1)了解样品信息，分析目的和要求

样品的制备 选择检测方法和条件

优化分离条件

定性、定量分析

分析方法验证

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有关样品组分和性质的重要信息1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 化合物的结构以及具有的官能团 化合物的分子量 化合物的酸碱性和pKa 值 样品适宜的溶剂及溶解度 化合物的UV特征 可能相关物质的数目 供试品的特性，如含有的基质、溶剂等 样品中要检测的各组分的含量范围

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明确分析的目的 定性分析还是定量分析？ 主成分分析还是相关物质分析？ 是否为手性分析？ 是否为微量或痕量分析？ 如为定量分析，要求方法的精度？ 分离的对象，如原料、制剂、工艺中间体等？ 自己实验室应用还是常规的质控分析方法？

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资料收集 各国药典方法 文献方法 类似药物分析方法

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选择一种 HPLC模式 对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式 开始的. 离子对反相模式和 正相模式 是第二选择. 具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条 件.– – – – 大分子量的样品, 如聚合物, 碳水化合物或蛋白质 含有光学异构体的混合物 (对映体) 含有其他异构体的混合物 含有无机盐的样品

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主要的HPLC方法方法/特点/色谱柱 反相模式 流动相::水/有机溶剂 色谱柱：C18,C8, 苯基, TMS, 氰基 反相离子对模式 流动相：水/有机溶剂, 缓冲盐溶液控制PH值 离子对试剂 色谱柱：C18,C8 何时应用此方法 能溶解于水/有机溶剂混合液的中 性或非离子化合物，首选该模式

离子或可电离的化合物, 酸碱性化 合物

正相模式 流动相：有机溶剂混合液 色谱柱：硅胶, 氨基, 氰基, 二醇基7

当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好 选择； 首选为不溶于水/有机混合液的亲脂性化合 物、异构体混合物 ( 硅胶最好)

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次要的HPLC方法方法/特点/色谱柱 离子交换模式 流动相：水相，缓冲液控制pH值 色谱柱：阳离子或阴离子交换柱 尺寸排阻色谱 流动相：水 相(凝胶过滤GFC) 有机相 (凝胶渗透GPC) 色谱柱：二醇基(GFC) 聚苯乙烯或硅胶(GPC) 何时应用此方法 分离无机离子 混合物的首选(离子 色谱法),分离核酸和蛋白质以及 有关的化合物

的良好的选择 分离高分子量样品，如蛋白质和 聚合物的首选，也可用作测量分 子量及其分布

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改善分离 两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs>1.5. 对简单混合物，应使分离度Rs>2 对含10个或更多成分的样品, 分离度的要求可降到Rs>1

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开发HPLC方法的分离目的目的 分离度 分离时间 定量 压力 内容 精密和抗干扰的定量分析要求 Rs > 1.5 小于5-10 min时，日常工作较理想 含量测定：RSD<1%; 要求不高或痕量分 析, RSD<5% 最好<15MPa, <20MPa 通常情况(假设是新柱) 最好是信噪比大的窄峰 每个样流动相的消耗量越小越好

峰形溶剂消耗

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检查问题 在方法开发期间，应重视方法引起的问 题 – 柱效下降 谱带增宽– 样品的溶剂不适合 – 高压引起的柱效下降

高压– 样品前处理不当 – 流动相或缓冲溶液浓度不适合

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完善方法 方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于 所有的有关实验室 HPLC 方法必须严格适合下列标准 – 精确度 – 准确度 – 稳定性 – 可转移性(再现性) 方法有效性检查对方法开发来说是非常重要的

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开发 HPLC方法的步骤1.有关样品的信息, 明确分离目的

2. 是否需要特殊的 HPLC步骤、 样品预处理等.3. 选择检测器和检测器设备

4. 选择LC 方法，进行预实验; 评估分离条件5. 最佳分离条件 6. 对特殊程序的问题和要求进行检查 7. 对方法进行常规实验室有效性检查

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分离度我国药典要求(除另外规定外)分离度应大于1.5。 适用于完全分离的两峰

2(tR 2 tR1) R W1 W 2适用于未完全分离的两峰

1.18(tR 2 tR1) R Wh / 2, 1 Wh / 2, 214

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完全分离时的分离度

Rs = 1.0

Rs = 1.50

峰形不是三角形 ，而是高斯分布。15

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峰面积分离率

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峰重叠百分率与分离度和峰面积比的关系峰面积比Rs 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 1:1 5.9% 2.3 0.83 0.26 0.069 0.016 0.003 0.001 1:3 5.0% 2.6 1.1 0.41 0.1 0.022 0.005 0.001 1:10 (*)% 2.7 1.4 0.49 0.16 0.032 0.009 0.001 1:30 (*)% 2.9 1.6 0.71 0.22 0.050 0.013 0.003 1:100 (*)% (*) 1.8 0.92 0.33 0.086 0.021 0.003

(*) 小峰仅仅以肩峰出现

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分离度, R 1 R 14 选择性

k' N

k' 1

柱效 容量因子

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容量因子, k’1 ttR

t0

tR t 0 k' t0在色谱方法建立时，常需调整实验条件，使所有谱带的k’ 在0.5至20之间。19

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理论塔板数, NRtArea H W1/2 W 方程 : N = 16 ×( Rt / W )2 实际修饰方程 : N = 5.54 × ( Rt / W 1/2 )2 综合修饰方程 : N = 6.28 × (Rt × H / Area)2

H1/2

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分离因子， 分离因子又称选择性

t1 t0

t2

=

k’1 k’2

=

t1 - t0 t2 - t0

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/khj4.html